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人参皂苷Re体外抗氧化能力及其对血清剥夺神经细胞作用的研究
目的:探讨三七中人参皂苷Re体外抗氧化能力和对血清剥夺损伤神经细胞的作用.方法:通过体外清除二苯代苦味酰肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-Diphenyi-1-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazyl,DPPH)自由基法、还原能力测定法测定人参皂苷Re体外抗氧化能力；通过细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)测定人参皂苷Re对神经细胞血清剥夺损伤的保护作用.结果:人参皂苷Re体外自由基清除率不足10％,还原能力不足12％,低于阳性对照维生素E,但对血清剥夺损伤的神经细胞保护作用非常显著(细胞存活率高78％),活性高于同浓度下的维生素E.结论:人参皂苷Re体外抗氧化能力微弱,不是通过提供电子来达到抗氧化作用,但可保护血清剥夺损伤的神经细胞,提高神经细胞成活率,抑制其损伤、凋亡的作用.
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SH-SY5Y细胞凋亡过程中Cpne5蛋白表达的变化
目的 探讨Cpne5蛋白在SH-SY5Y细胞凋亡中表达量的变化.方法 显微镜观察细胞形态及流式细胞术检测凋亡率,鉴定A23187诱导SH-SY5Y细胞凋亡及血清剥夺诱导凋亡的模型;免疫印迹法检测两种凋亡过程中Cpne5蛋白表达量的变化.结果 10μmol/L A23187诱导SH-SY5Y细胞24h,细胞出现皱缩、凋亡率增加.A23187诱导0.5h,Cpne5蛋白表达量即出现明显的上升,持续至12h;在24h时Cpne5蛋白表达量回落至诱导前水平.血清剥夺72h的SH-SY5Y细胞24份,凋亡率为23.2 ±2.1％,与对照组1.1±0.1％比,差异有统计学意义(P＜0.01).免疫印迹结果表明,SH-SY5Y细胞分别经血清剥夺1h、6h、12h、24h、72h对Cpne5蛋白表达量无明显变化.结论 A23187诱导SH-SY5Y细胞凋亡早期Cpne5蛋白表达量有显著变化;提示Cpne5基因可能参与凋亡调控的钙信号通路.
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线粒体神经酰胺酶上调K562细胞Bcl-2蛋白表达水平
近,克隆了一种新的选择性定位于线粒体的神经酰胺酶,提示线粒体存在着神经酰胺代谢途径,可能对线粒体的功能,特别对凋亡产生影响.本研究将线粒体神经酰胺酶基因转染到K562细胞,以此了解线粒体神经酰胺酶的细胞生物学效应.以脂质体介导将含有线粒体神经酰胺酶cDNA的pcDNA3.1/His-CDase质粒转染到K562细胞,G418筛选阳性克隆,建立稳定表达线粒体神经酰胺酶的K562TC细胞株.用MTT法、annexin V/PI法、FCM及Western blot分别检测K562与K562TC细胞在细胞毒药物抗性、血清剥夺耐受性及Bcl-2蛋白表达水平方面的差异.结果表明:虽然K562TC与K562细胞对阿霉素、足叶乙甙及亚砷酸的敏感性没有差异,但是K562TC细胞Bcl-2蛋白水平明显升高,抗血清剥夺能力明显增强.以硫代反义寡核苷酸特异性封闭K562TC细胞线粒体神经酰胺酶,下调Bcl-2蛋白表达水平;二甲基鞘氨醇(鞘氨醇激酶抑制剂,降低细胞内1-磷酸鞘氨醇水平)同样下调K562TC细胞Bc1-2蛋白表达水平,而1-磷酸鞘氨醇明显上调K562细胞Bcl-2表达水平.结论:线粒体神经酰胺酶将线粒体神经酰胺代谢为鞘氨醇,进而在鞘氨醇激酶作用下生成1-磷酸鞘氨醇,此代谢途径上调K562细胞Bcl-2蛋白表达水平.
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马来酸桂哌齐特对不同条件下体外培养的人脑胶质瘤 U251细胞腺苷激酶的影响
目的：观察马来酸桂哌齐特（CM）对不同条件下体外培养的人脑胶质瘤 U251细胞腺苷激酶（ADK）表达水平的影响，探讨 CM 是否可通过影响细胞内 ADK 表达水平而实现其神经保护作用。方法2013年2月—2014年6月，将人脑胶质瘤 U251细胞铺到6孔板，1孔为1组，分别为胎牛血清（FBS）＋0.9％氯化钠溶液对照组（C 组）、FBS ＋ CM 0.5 mg/ ml 组（C ＋0.5组）、FBS ＋ CM 1.5 mg/ ml 组（C ＋1.5组）、血清剥夺（SD）＋0.9％氯化钠溶液对照组（SD 组）、SD ＋ CM 0.5 mg/ ml 组（SD ＋0.5组）、SD ＋ CM 1.5 mg/ ml 组（SD ＋1.5组），进行正常体外细胞培养或 SD 体外缺血模式培养。提取细胞蛋白、RNA，采用 Western blotting 法检测人脑胶质瘤 U251细胞 ADK 表达水平， RT - PCR 法检测人脑胶质瘤 U251细胞 ADK mRNA 表达水平。结果6组 ADK 表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。SD ＋0.5组 ADK 表达水平低于 C 组（P ＜0.05）。6组 ADK mRNA 表达水平比较，差异有统计学意义（P ＜0.05）。SD ＋0.5组 ADK mRNA 表达水平低于 C 组、SD ＋1.5组（P ＜0.05）。结论 SD 体外缺血模式培养下，CM 在一定浓度范围内可能通过增强人脑胶质瘤 U251细胞的 ADK 表达抑制作用来实现其神经保护作用。
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血清剥夺法分离U87细胞系中的胶质瘤干细胞
背景:细胞周期分析已证实,90%以上的干细胞处于G0静止状态,因此采用不含任何生长因子和其他相关营养添加剂的血清剥夺培养基更适合筛选分离肿瘤干细胞.目的:应用血清剥夺法培养胶质瘤U87细胞,并筛选鉴定该细胞系中的胶质瘤干细胞.方法:将U87细胞培养在只含有DMEM和L-谷氨酰胺的培养基中培养6 d,筛选出胶质瘤干细胞,接着更换为神经干细胞培养基,观察细胞肿瘤球的形成过程;将肿瘤球接种于血清培养基,观察其在体外的分化特点;免疫荧光鉴定血清剥夺后尚存的细胞、增殖形成的肿瘤球细胞和分化细胞.结果与结论:应用血清剥夺的方法成功地筛选出了表达CD133的肿瘤干细胞,并能增殖形成肿瘤球;肿瘤球可多向分化,子代细胞表达胶质纤维酸性蛋白和神经元特异性烯醇化酶.说明U87细胞系中存在具有自我更新及多向分化能力的胶质瘤干细胞.
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血清剥夺促进成纤维细胞向内皮细胞转分化的体外研究
目的 模拟体内急性心肌梗死缺血缺氧微环境,探讨血清剥夺是否能激活心肌成纤维细胞向内皮细胞转分化.方法 取新鲜分离的C57BL/6新生小鼠心脏组织,获取成纤维细胞进行培养,用白血病抑制因子(LIF)促进成纤维细胞自我更新、长程维持干性和抑制其向终末分化.将第3代成纤维细胞分为:对照组[DMEM+10％胎牛血清(FBS)培养]、血清剥夺24 h组(不含FBS的DMEM培养24 h)、血清剥夺48 h组(不含FBS的DMEM培养48 h)、血清剥夺72 h组(不含FBS的DMEM培养72 h).经过不同处理后,采用qPCR法检测各组细胞谱系特异性基因的表达变化,采用体外血管新生实验和Dil-Ac-LDL吞噬实验检测血清剥夺后成纤维细胞的功能学变化,采用ELISA法检测血清剥夺后成纤维细胞分泌血管内皮生长因子(VEGF)的情况.结果 血清剥夺不同时间组成纤维细胞形成血管分叉的数目与对照组相比均增加(P＜0.05),但均未发现诱导细胞吞噬Dil-Ac-LDL的现象.与对照组比较,血清剥夺48 h组成纤维细胞中内皮特异性基因CD31和VE-herin的表达均升高(P＜0.05);其中血清剥夺48 h组成纤维细胞中CD31的表达是对照组的13.7倍(P＜0.05),血清剥夺72 h组是对照组的2倍(P＜0.05).ELISA检测结果显示,血清剥夺48 h组成纤维细胞分泌的VEGF是对照组的7倍(P＜0.05),血清剥夺72 h组是对照组的3.7倍(P＜0.05).结论 血清剥夺可以激活心肌成纤维细胞向内皮细胞谱系的转分化.
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短暂缺氧血清剥夺再灌注后神经细胞顿抑现象的研究
目的研究短暂缺氧、血清剥夺复氧复注血清(再灌流)后神经细胞顿抑现象及其可能机制.方法将PC12细胞随机分为正常对照组和缺氧组,每组根据不同的再灌流时间又分为3个亚组(缺氧组分别为缺氧15min再灌流1h组、3h组、6h组,正常对照组各亚组的时间点与缺氧组相对应).测定短暂缺氧血清剥夺再灌流后不同时间点的三磷酸腺苷含量、线粒体膜电位和细胞活性.结果与正常对照组相比,缺氧血清剥夺15min再灌流1h后的三磷酸腺苷含量(1.05±0.34)、线粒体膜电位(41.39±1.242)和细胞活性(0.809±0.087)显著降低(P ＜0.05),且于再灌流6h后基本恢复至正常水平.结论短暂缺氧血清剥夺再灌流后,存在低能量状态,且可完全恢复,表明可能存在神经细胞顿抑现象,其原因可能与再灌流后线粒体呼吸链上的琥珀酸脱氢酶等活性下降及线粒体的膜电位变化等有关.
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大鼠骨髓间充质干细胞去血清培养后钙激活中性蛋白酶10基因转录变化
目的 检测血清剥夺是否诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)凋亡,探讨钙激活中性蛋白酶-10(Calpain-10)是否参与血清剥夺诱导的大鼠BMSCs凋亡.方法 原代培养的大鼠BMSCs,流式细胞术鉴定细胞表型,去血清培养,应用PI/Annexin-V双染法流式细胞仪计数0、24、48 h凋亡细胞的比例,应用荧光定量PCR测定血清剥夺24 h诱导凋亡的Calpain-10基因mRNA水平.结果 流式细胞术鉴定细胞发现:CD29、CD44、CD105表达阳性,CD45、CD14、CD34表达阴性,符合BMSCs特点;血清剥夺后24 h早期凋亡细胞比例高.荧光定量PCR结果示与正常对照组比较血清剥夺诱导凋亡24 h Calpain-10基因mRNA水平显著上调(2 -ΔΔCT=22.433).结论 血清剥夺可诱导大鼠BMSCs凋亡,并上调Calpain-10 基因mRNA水平,Calpain-10可能参与血清剥夺诱导的大鼠BMSCs凋亡.
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不同营养状态下柯萨奇病毒B3感染HeLa细胞后对mTOR及p70S6K mRNA的影响
目的 探讨不同营养状况下柯萨奇病毒B3(CVB3)感染HeLa细胞对mTOR信号通路的影响.方法 采用非饥饿法和饥饿法2种方法培养HeLa细胞.(1)非饥饿法:HeLa细胞融合成40％ ～ 50％的单层细胞时,用含10 g/L胎牛血清的细胞培养液换液培养24 h后,病毒组用100倍半数感染量(100 TCID50)的病毒干预,而对照组用病毒维持液(含胎牛血清2 g/L细胞培养液)培养；(2)“饥饿法”:待HeLa细胞融合成40％ ～ 50％的单层细胞时,用不含胎牛血清的培养基换液培养24 h后,病毒组用100 TCID50的病毒干预,而对照组用病毒维持液(含胎牛血清2 g/L的细胞培养液)培养.采用倒置显微镜观察细胞形态学变化,用实时荧光定量PCR检测3、6、9、12、24 h不同时间点饥饿法及非饥饿法不同营养状态下HeLa细胞mTOR、p70S6KmRNA表达.结果 非饥饿法:病毒组仅在12 h及24 h mTOR、p70S6K mRNA表达显著低于对照组(P均＜0.05)；饥饿法:病毒组各时间点均显著低于对照组(P均＜0.05)；饥饿法病毒组和对照组Hela细胞mTOR、p70S6K mRNA表达均高于非饥饿法,mTOR mRNA差异均有统计学意义(P均＜0.05),而p70S6K mRNA差异均无统计学意义(P均＞0.05).结论 CVB3使HeLa细胞mTOR-P70S6K信号通路表达下调.
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环孢霉素A对缺氧血清剥夺再灌流后PC12细胞的保护作用
目的:研究环孢霉素A对短暂缺氧血清剥夺再灌流后PC12细胞的保护作用和可能的作用机制.方法:将PC12细胞随机分为对照组、缺氧组和干预组,缺氧组于缺氧血清剥夺15 min后复氧复注血清1 h,干预组自缺氧前4 h即给予环孢霉素A,并同样于缺氧血清剥夺15 min后复氧复注血清1 h,测定各组ATP含量(生化发光法)、线粒体膜电位(Rhodamine123标记,流式细胞仪测定)、细胞活性(MTT法).结果:与对照组相比,缺氧组ATP含量、线粒体膜电位、细胞活性显著降低,差异具有统计学意义(P < 0.01);干预组与缺氧组的ATP含量、线粒体膜电位、细胞活性的差异有统计学意义(P< 0.01).干预组与对照组间差异无统计学意义(P >0.05).结论:环孢霉素A是线粒体膜渗透性转换孔抑制剂,在短暂缺氧血清剥夺再灌流后对维持PC12细胞线粒体的完整和功能起着非常重要的作用,具有明显的神经保护作用.
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短暂缺氧、血清剥夺再灌流后神经细胞顿抑现象的研究
目的研究短暂缺氧、血清剥夺复氧复注血清(再灌流)后有无神经细胞顿抑现象存在及可能的发生机制. 方法将PC12细胞随机分为正常对照组和缺氧组,每组根据不同的再灌流时间点又分为3个亚组(缺氧组分别为缺氧15 min再灌流1 h组、3 h组、6 h组,正常对照组各亚组的时间点与缺氧组相对应).测定短暂缺氧血清剥夺再灌流后不同时间点的三磷酸腺苷含量、线粒体膜电位和细胞活性. 结果与正常对照组相比,缺氧血清剥夺15 min再灌流1 h后的三磷酸腺苷含量、线粒体膜电位、细胞活性显著降低,差异具有显著性意义(P<0.05); 缺氧血清剥夺15 min再灌流6 h后基本恢复至正常水平,差异无显著性意义(P>0.05). 结论短暂缺氧血清剥夺再灌流后,存在低能量状态,且可完全恢复,表明可能存在神经细胞顿抑现象,其原因可能与缺氧血清剥夺再灌流后线粒体呼吸链上的琥珀酸脱氢酶等活性下降及线粒体的膜电位变化等有关.
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血清剥夺致PC12细胞死亡及对细胞周期的影响
目的观察血清剥夺致PC12细胞死亡及对细胞周期的影响.方法流式细胞术检测在含5%和2%胎牛血清的培养基中,PC12细胞死亡和细胞周期的改变.结果随着血清浓度的下降,PC12细胞死亡或凋亡增加,同时,S期的细胞所占百分比降低,G2期细胞所占的比例增加,在含2%胎牛血清的培养基中培养的细胞更加明显.结论①PC12细胞经血清剥夺培养后产生的损伤可能引发了细胞周期阻滞,当损伤未得以及时修复时,导致细胞凋亡.②在细胞周期和细胞死亡之间可能存在密切的联系.
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EGb761通过改善线粒体功能抑制无血清SH-SY5Y细胞的凋亡
目的 标准化银杏叶提取物EGb761被认为有神经保护作用,但作用机制不明.本研究旨在检测EGb761对无血清人类神经母细胞瘤SH-SY5Y型细胞的生长和凋亡的作用,以了解其神经保护机制.方法 本研究通过检测线粒膜电位、细胞色素C氧化酶和线粒体ATP合成率来评估线粒体机能;通过检测细胞周期来了解细胞的生长状态.结果 我们发现,EGb761使血清剥夺诱导细胞的细胞周期停留在G0/G1期而减弱其凋亡,这有可能是通过改善线粒体的功能而实现的.结论 EGb761通过调节线粒体机能促进营养因子非依赖的神经元存活.这些结果可能为EGb761的神经保护作用增添一个新的视角.
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亚低温抑制神经元凋亡的机制
亚低温(直肠温度33～35℃)有很好的脑保护作用,同时无明显并发症[1],因而已被广泛地应用于临床.近年来人们对亚低温脑保护展开了大量的动物实验,探讨其机制.Shibano等[2]采用血清剥夺培养PC12细胞作为神经元凋亡模型研究发现:在37℃时发生凋亡的细胞超过90%,在33～35℃时神经元发生凋亡的百分比为42.5%,因此亚低温对神经元凋亡有明显抑制作用.Lin等[3]用弥漫性脑损伤大鼠模型研究发现:TUNEL染色显示凋亡的神经元数随损伤的严重程度而增加,脑损伤48 h后达高峰.亚低温治疗组大鼠皮层和海马的凋亡细胞在24 h、48 h、72 h时均显著低于对照组,因此亚低温治疗对脑损伤引起的神经元凋亡也有明显的抑制作用.亚低温抑制多种原因引起的神经元凋亡的机制是什么呢?本文围绕这个问题进行综述.
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维生素C对TNF-α及血清剥夺诱导的人髓核细胞凋亡的作用
目的 探讨维生素C (Vitamin C,Vit C)在TNF-a及血清剥夺诱导人椎间盘髓核细胞凋亡中的作用及机制.方法 取脊柱矫形手术患者的髓核组织,消化法获得正常髓核细胞,取第3代细胞按不同处理因素分为VitC作用组(A组)、TNF-α诱导组(B组)和血清剥夺组(C组),每组再分为以下亚组:A组分为A1组(基础培养液)、A2组(100 μg/mL VitC)、A3组(200 μg/mL Vit C);B组分为B0组(对照组)、B1组(100 ng/mL TNF-a)、B2组(100 μg/mL Vit C+100 ng/mL TNF-α)、B3组(200 μg/mL Vit C+100 ng/mL TNF-α);C组分为C0组(对照组)、C1组(FBS浓度由8％降低为2％)、C2组(2％FBS+100 μg/mL VitC)、C3组(2％FBS+200 μg/mL Vit C).各组作用24h后,采用流式细胞术检测各组膜联蛋白Ⅴ、碘化丙啶双染后髓核细胞凋亡率;实时荧光定量PCR检测p53(基因编码相对分子质量为53×103的蛋白质)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase3)、Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、Sox9和糖胺多糖(Aggrecan)mRNA表达.结果 A组:与A1组比较,A2、A3组的VitC均能降低髓核细胞凋亡及p53、FAS、Caspase 3 mRNA表达(P＜0.05),但A2、A3组间比较差异无统计学意义(P＞0.05);A2、A3组的Vit C可促进髓核细胞Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、Aggrecan、Sox9 mRNA表达,且A3组促进作用显著大于A2组(P＜0.05).B组:与B0组比较,B1组TNF-α促进了髓核细胞凋亡,增加了髓核细胞p53、FAS、Caspase 3 mRNA表达(P＜0.05);与B1组比较,B3组的Vit C能降低髓核细胞凋亡及p53、FAS、Caspase 3 mRNA表达,而B2组的VitC则增加其凋亡及p53、FAS、Caspase 3 mRNA表达,差异均有统计学意义(P＜0.05).C组:与C0组比较,C1组2％FBS能诱导髓核细胞凋亡,但降低了髓核细胞p53、FAS、Caspase 3 mRNA表达(P＜0.05);与C1组比较,C3组的VitC能降低髓核细胞凋亡及p53、FAS、Caspase 3 mRNA表达,而C2组的VitC则增加其凋亡及p53、FAS mRNA表达,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 Vit C能延缓或降低髓核细胞凋亡、促进细胞外基质合成与分泌,200 μg/mL Vit C可延缓或降低100 ng/mL TNF-a和2％FBS诱导的凋亡,而100 μg/mL Vit C则促进其诱导的凋亡.
