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结核性脑膜炎实验室诊断技术进展
结核性脑膜炎是肺外结核较为常见的疾病,约占结核病的0.5％～1.0％[1].全世界结核性脑膜炎自20世纪60年代以后稳步下降,但20世纪80年代后开始呈上升趋势.尤其是近年来,耐药结核分枝杆菌广泛传播及艾滋病的流行和免疫制剂的广泛应用,使得结核性脑膜炎发病率亦随之增高.结核性脑膜炎是死亡率高的肺外结核病,早期诊断对于提高患者的生存率尤其重要.但在临床工作中,早期结核性脑膜炎患者临床表现和脑脊液改变多不典型,易与细菌性脑膜炎、病毒性脑膜炎等相混淆[1].因此,采取有效的实验室技术方法对于结核性脑膜炎诊断与治疗有着重要意义.笔者就结核性脑膜炎实验室诊断技术的进展评述如下.
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中老年肺结核患者耐药结核分枝杆菌分布 及相关危险因素分析
目的 了解中老年肺结核患者耐药结核分枝杆菌分布及其危险因素,为有效控制耐药菌提供参考.方法 采用回顾性分析方法,对医院住院中老年肺结核患者送检标本中耐药结核分枝杆菌检测结果进行分析.结果 从80例患者送检标本中确诊耐结核分枝杆菌感染患者21例,耐药结核分枝杆菌感染率占肺结核总数的26.25％.在检出的耐药结核分枝杆菌中,有47.62％只对单一抗结核药物耐药,其余均同时对2种及以上种类抗结核药物耐药,有9.52％菌株同时对4种抗结核药物耐药;用药依从性、吸烟和糖尿病史是中老年肺结核住院患者出现耐药性的危险因素.结论 中老年肺结核患者耐药菌感染率较高,危险因素多为可控性,必须加强对耐抗结核药物菌株的监测.
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耐药肺结核分枝杆菌快速诊断和治疗研究进展
目的 综述近年对耐药肺结核快速诊断及治疗的研究进展.方法 查阅国内外大量文献,对耐药结核病的诊断及其中西医药治疗情况进行分析归纳.结果 耐药肺结核快速诊断主要依靠分子生物学检测;耐药结核病化疗配合免疫、外科手术及中西医药结合治疗.结论 分子生物学检测提高快速诊断耐药肺结核效率,但由于设备、技术、费用等因素难以普及需进一步探索;快速有效治疗方法仍在探索阶段.
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刃天青法检测青蒿琥酯对耐药结核分枝杆菌药物敏感性初步研究
目的 了解青蒿琥酯(artesunate,ASN)单独或联合利福平(rifampicin,RFP)、异烟胼(isoniazid,INH)、链霉素(streptomycin,SM)、氧氟沙星(ofloxacin,OFLX)等抗结核药物对耐药结核分枝杆菌的抑制作用,为耐药结核的治疗寻找新的有效药物提供依据.方法 采用刃天青法检测ASN对耐药结核分枝杆菌的抑制作用,并采用ASN联合RFP、INH、OFLX、SM对耐药结核分枝杆菌抗结核药物MIC研究.结果 本研究测试的14株耐药菌株中,7株MIC值为256μg/mL,6株MIC值为128μg/mL,1株MIC为512μg/mL,MIC50为256μg/mL,MIC90为256μg/mL.16株敏感株中,MIC50为128μg/mL,MIC90为256μg/mL.两者差异无统计学意义(P＞0.05).此外,当ASN终浓度为32 ～ 128μg/mL时,能明显改善耐药MTB对RFP、INH、OFLX、SM等抗结核药物的敏感性.结论 ASN对抗耐药结核分枝杆菌作用可能甚微,但其能协同或逆转抗结核药物改善耐药MTB的药物敏感性,可能成为耐多药结核治疗备选新药.
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四川地区结核分枝杆菌链霉素耐药性及相关耐药基因分析
中国不但是世界卫生组织确定的22个结核病高负担国家之一,更是耐药结核分枝杆菌报道的热点地区[1].2010年3月全国第五次结核病流行病学抽样调查结果表明,我国西部地区传染性肺结核患病率分别为中部和东部地区的1.7和2.4倍.四川地处中国西南部,少数民族众多,人口流动大,医疗卫生条件尚不完善,这些都给耐药结核菌传播扩散带来便利.链霉素(SM)一直是治疗结核的主要药物.由于长时间甚至作为单一治疗药物使用,其耐药性逐年增加,世界范围内新发与复发链霉素耐受性分别为10.9％和20.1％[2].链霉素主要作用于核糖体30S亚基从而抑制细菌蛋白质合成,编码核糖体S12亚基的rpsL及16S rRNA rrs基因的530、912区域DNA序列改变与链霉素耐药性直接相关[3].
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三磷酸腺苷发光法与其他方法在异烟肼耐药结核分枝杆菌检测中的比较
目的 研究通过与罗氏固体药敏法和BD960自动检测系统比较,判断三磷酸腺苷(ATP)发光法全新且检测快速简便试验方法的可行性.方法 罗氏分枝杆菌药物敏感性测定按照《临床技术操作规范结核病分册》操作,BD960药敏试验操作按照《BD BACTEC MGIT 960 system全自动分枝杆菌检测系统》培训手册操作,采用ATP发光法药敏试验操作,同时对147株临床菌株进行检测,并对结果进行比较.结果 ATP发光法检测结果与罗氏固体药敏法的符合率为95.2％,差异无统计学意义,与BD960自动检测系统的符合率为93.9％,差异无统计学意义;ATP发光法的检测时间为(6.6±2.1)d,比罗氏固体药敏法缩短很多,差异有统计学意义(t＝418.0,P＜0.01),略快于BD960自动检测系统(7.9±2.6 d);ATP发光的只需要一台HygienaPI-102荧光检测仪,检测成本较低.结论 ATP发光药敏检测法快速简便、准确率高且成本低,其有效的避免了罗氏固体法过长的检测时间和BD960自动检测系统过高的检测成本,适合常规试验室开展.
关键词： ATP发光法 罗氏固体药敏法 BD960自动检测系统 耐药结核分枝杆菌 -
处于临床研究阶段的抗结核新药研究进展
结核病的再度爆发和耐药结核分枝杆菌的出现,使结核病再次成为威胁人类健康的主要疾病之一.而在过去的40年里未开发出新型高效的抗结核药物.研究抗结核药物来有效地预防和治疗结核感染是非常必要的.目前世界范围内已经进入临床阶段的抗结核新药有莫西沙星、加替沙星、利福喷汀、利福拉齐及TMC207,PA-824,0PC-67683,SQ-109,LL3858等.文中分别介绍了这些新药的化学结构、作用机制、抗结核活性以及临床应用进展.
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耐药结核分枝杆菌潜伏-复发感染动物模型的研究进展
潜伏结核感染(latent tuberculosis infection ,LTBI)复发是新发结核病的主要来源 ,其中耐药结核病所占比例较大 ,使耐药LTBI复发的防控成为结核病研究的重点.耐药结核分枝杆菌潜伏-复发感染动物模型是开展耐药结核病防控相关机制研究、抗耐药结核分枝杆菌药物和疫苗研究的基础.目前耐药结核分枝杆菌感染动物模型缺乏 ,而已有的结核分枝杆菌标准株 H37Rv潜伏-复发感染模型存在缺陷 ,如小鼠模型的潜伏期荷菌量偏高、复发期变异大 ,而猴模型的潜伏期和复发期不可预测.模型的可控性差使其应用困难 ,且缺乏可用的免疫学评价指标 ,导致远期复发无法预测.因此 ,基于现有 H37Rv潜伏-复发感染动物模型的制备方法 ,展望耐药结核分枝杆菌潜伏-复发感染动物模型可能存在的缺陷 ,通过选用新的抑菌剂和诱导剂 ,制备有稳定潜伏期、潜伏时长适中、复发起点和复发水平变异小的动物模型 ,是未来耐药结核分枝杆菌潜伏-复发感染动物模型研究的方向.
关键词： 耐药结核分枝杆菌 动物模型 耐药结核分枝杆菌潜伏-复发感染 稳定性 可控性 -
耐药结核分枝杆菌的检测方法与进展
结核病是威胁人类健康的重要传染病.为指导临床治疗用药,需要准确、快速的检测方法.目前常用的方法主要有常规检测和分子生物学检测.其中常规方法有药物敏感性试验,液体快速培养,噬菌体裂解法'分子生物学方法主要包括DNA测序法,聚合酶链反应-单链构象多态性分析,聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析,实时荧光定量PCR技术,分子线性探针法和基因芯片技术等.
关键词： 耐药结核分枝杆菌 -
110株结核分枝杆菌二线药敏结果分析
目的 了解2007年至2010年胜利油田结核分枝杆菌菌株对二线结核药的耐药状况,初步探讨本地耐多药(MDR-TB)及广泛耐药(XDR-TB)结核病发病情况.方法 运用药物敏感检测和调查相结合,收集2007年2月至2010年8月结核病患者痰标本进行分离培养和菌种鉴定,同时对4种一线药物及4种二线药物应用比例法进行耐药性检测.结果 在所分离的110株耐药结核分枝杆菌中,MDR-TB 14例,其中XDR-TB6例,耐LFX占17.3%,耐AK、PAS、CM分别为:6.4%、5.5%、1.8%,对二线药物的耐药顺位依次LFX>AK>PAS>CM.结论 胜利油田结核病患者二线药物耐药情况严重.
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痰耐药结核分枝杆菌rpoB基因的快速检测及利福平耐药机制研究
目的 快速检测痰耐药结核分枝杆菌rpoB基因,了解利福平耐药的分子机制.方法 根据结核分枝杆菌rpoB基因的耐利福平决定区设计引物,用PCR方法从耐药肺结核患者痰及临床分离菌株扩增rpoB基因片段,对扩增获得的rpoB基因片段进行序列测定,比较分析耐多药、全耐、单耐利福平、全敏感或标准结核分枝杆菌株之间的基因序列差异.结果 于6 h内从耐药肺结核痰中快速检测到rpoB基因.耐多药菌株、全耐及单耐利福平分离菌株均检测有rpoB基因点突变,突变位点主要为531、516或526常见密码子,且绝大多数为单碱基突变,发现1例MDR-TB出现479位和531位密码子同时突变.敏感株和标准株无基因突变.结论 PCR及序列分析方法可快速、准确检测结核分枝杆菌rpoB基因及其突变,结核分枝杆菌对利福平的耐药性与rpoB基因点突变有关.
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痰中耐药结核分枝杆菌katG基因的快速检测及异烟肼耐药机制研究
目的 快速检测痰中耐药结核分枝杆菌katG基因及了解耐异烟肼的分子机制.方法 用PCR方法直接从耐药肺结核患者痰及临床分离菌株扩增katG基因片段,对扩增获得的katG基因片段进行序列测定,比较分析耐多药、全耐、多耐药但对异烟肼敏感、全敏感或标准结核分枝杆菌株之间的基因序列差异.结果 于6 h内从耐药肺结核痰中快速检测到katG基因.从临床分离菌株中随机扩增药敏试验证实的耐多药3株,全耐、包括对异烟肼耐药的多耐、对异烟肼敏感的多耐药、全敏感及H37Rv标准结核分枝杆菌株各1株,均扩增获得273bp片段,序列测定比较发现,2株耐多药菌、1株全耐菌及包括异烟肼耐药的多耐药菌株均检测有katG基因点突变,突变位点均为第2066位碱基C突变为G,1例MDR-TB、全敏感株、对异烟肼敏感的多耐药菌株和标准株均无基因突变.结论 PCR及序列分析方法可快速、准确检测结核分枝杆菌katG基因及其突变,结核分枝杆菌对异烟肼的耐药性与katG基因点突变有关,但可能还存在其它值得探讨的机制.
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耐药结核分枝杆菌多重Taqman-MGB探针检测方法的建立
目的 建立耐药结核分枝杆菌的多重Taqman-MGB探针检测体系.方法 针对结核分枝杆菌抗结核一线药物突变位点[利福平: RpoB(526)/(531);乙胺丁醇: embB(306);异烟肼: KatG(315)、inhA(-15);链霉素: Rpsl(43)]设计并合成引物探针;构建耐药结核分枝杆菌野生型和突变型模板,对其进行梯度稀释;配制结核分枝杆菌耐药基因检测试剂,用不同类型模板进行检测;检测72例结核样本(耐利福平20株,耐异烟肼22株,耐链霉素1株,耐多药17株),并与罗氏药效试验结果比较.结果 该检测体系可同时检测6个结核突变位点,低检测限为104拷贝/mL,对临床样本检测其总符合率为100％,一致性好(χ2=137.3,P＜0.001).结论 本研究建立了耐药结核分枝杆菌的快速检测方法,可较好应用于卫生检疫系统和临床实验室.
关键词： 结核分枝杆菌 耐药结核分枝杆菌 TaqMan-MGB 快速检测 -
基因芯片方法检测耐异烟肼结核分枝杆菌准确性的M eta分析
目的：利用M eta分析方法系统评价基因芯片技术检测耐异烟肼（INH）结核分枝杆菌的准确性。方法计算机检索The Cochrane Library、SCI、PubMed、EMbase、WanFang Data、CNKI数据库，检索时限均为建库至2015年5月。由2位研究者根据纳入与排除标准筛选文献、提取资料，应用QUADAS条目工具评价纳入研究质量，采用Meta‐DiSc 1．4软件对敏感性（SEN）、特异性（SPE）、阳性似然比（＋LR）、阴性似然比（－LR）、诊断比值比（DOR）进行异质性检验和合并分析并绘制受试者工作特征（SROC）曲线、计算曲线下面积（AUC）。结果共纳入15篇符合要求文献，分析3967株经传统药敏试验鉴定结核分枝杆菌菌株，其中耐IN H菌株1147株、敏感菌株2820株。基因芯片技术检测耐INH结核分枝杆菌的 S E N并发为0．82[95％ CI（0．79～0．84）]、S P E并发为0．97[95％ CI（0．97～0．98）]、＋LR为21．81[95％ CI（12．12～39．25）]、－ LR为0．19[95％ CI（0．15～0．24）]、DOR并发为136．55[95％ CI（70．66～263．89）]，AUC为0．94。结论通过循证学方法系统评价基因芯片技术检测耐INH结核分枝杆菌结果表明，其具有较好的诊断价值；与传统药敏试验相比基因芯片技术操作简单、检测快速，对耐药基因检出率较高，但费用较贵，成本较高。
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分枝杆菌噬菌体DNA Ⅲ生物学特性及其抗耐药结核潜力
目的 研究分枝杆菌噬菌体DNAⅢ的生物学特性及抗耐结核潜力,筛选鸡尾酒疗法配方噬菌体.方法 采用双层琼脂培养法制备噬菌体DNAⅢ,观察噬菌斑特点;透射电镜观察DNAⅢ形态;噬菌斑实验检测DNAⅢ佳和小感染复数(MOI);通过一步生长曲线实验确定DNAⅢ潜伏期及裂解量;检测DNAⅢ对温度、酸碱度的耐受情况;检测DNAⅢ对分枝杆菌的裂解谱;血清中和实验检测DNAⅢ的抗原性,及其与其它8种分枝杆菌噬菌体之间的亲缘关系.结果 DNAⅢ噬菌斑圆形透明,直径约1mm;DNAⅢ尾长(208±28.7) nm;佳MOI为10-4,DNAⅢ对耻垢分枝杆菌极度易感;DNAⅢ感染宿主菌的潜伏期约为165min,裂解量为28;DNAⅢ对热、酸碱均敏感;DNAⅢ能裂解耻垢分枝杆菌、结核分支杆菌标准株、多数结核分枝杆菌临床耐药株;DNAⅢK值为770.01,抗血清对非对应噬菌体的中和活性差.结论 DNAⅢ抗原性低,裂解谱广,具有抗耐药结核作用,可作为鸡尾酒疗法的候选噬菌体.
关键词： 分枝杆菌噬菌体DNAⅢ 生物学特性 耐药结核分枝杆菌 -
抗结核MPT64-Ag85B/katG/GNLY-PRF1重组质粒DNA疫苗的构建与表达
目的 构建抗结核MPT64-Ag85B/katG/GNLY-PRF1重组质粒DNA疫苗.方法 利用DNA重组技术,将激活细胞免疫和体液免疫的MPT64/Ag85B优势抗原基因和野生型katG基因编码区以及穿孔素/颗粒溶素整合进串联真核表达载体pIRES2-EGFP中,构建抗结核重组质粒MPT64-Ag85B/katG/GNLY-PRF1;电转化方法将质粒重组耻垢分枝杆菌制备菌苗;通过脂质体Lipofectamine 2000介导将重组质粒转染293T细胞.应用qRT-PCR技术在mRNA水平检测靶基因体外表达效果并用Western blot方法检测转染细胞是否表达目的蛋白.结果 PCR证实重组质粒MPT64-Ag85B/katG/GNLY-PRF1构建成功并制备重组耻垢分枝杆菌菌苗;qRT-PCR分析表明重组质粒的靶基因MPT64/Ag85B、katG、GNLY/PRF1基因转染293T细胞后均有表达,免疫印迹分析重组质粒的融合蛋白MPT64/Ag85B在相对分子质量72 kDa处有明显蛋白表达条带,且融合蛋白MPT64/Ag85B可分泌表达;融合蛋白GNLY/PRF在相对分子质量75 kDa处有明显蛋白表达条带.结论 成功构建抗结核MPT64-Ag85B/katG/GNLY-PRF1重组质粒DNA疫苗,为进一步研究该疫苗的免疫作用提供依据.
