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荧光定量PCR结合TaqMan-MGB检测肾移植后患者尿中BK病毒
目的:建立一种检测肾移植术后患者尿中BK病毒的荧光PCR方法.方法:选择VP1基因作为检测目标,设计引物、探针,探针5'端用FAM标记,3'端标记MGB,建立重组质粒标准曲线,评价特异性、灵敏度、重复性;对本院收集的肾移植患者尿液标本进行检测.结果:本研究以BK病毒VP1基因中75 bp为靶基因,建立结合TaqMan-MGB的荧光PCR方法,灵敏度为10拷贝/μl,R<'2>:0.999;批间和批内的重复性(CV%)均小于5%.102例临床标本中检测到10例阳性标本,阳性率为9.8%,上述结果与测序验证结果一致.结论:结果表明BK病毒TaqMan-MGB探针荧光PCR方法的特异性好、灵敏度高、操作简便,可特异、快速、灵敏地对临床标本的BK病毒进行定量检测,可用于早期诊断BK病毒感染和预防肾移植术后BK病毒感染造成的相关肾病等方面.
关键词： 荧光定量PCR TaqMan-MGB 检测 BK病毒 -
荧光定量PCR结合TaqMan-MGB检测食品中空肠弯曲菌
目的:基于TaqMan-MGB探针的荧光定量PCR技术,研发出一种定量检测食品污染物中空肠弯曲菌的方法,为食品污染物调查提供快速、可靠的监测工具.方法:根据TaqMan-MGB探针原理,在空肠弯曲菌基因组保守区设计引物和探针,探针的5'端用FAM荧光标记,3'端标记MGB,建立基于TaqMan-MGB探针的实时荧光定量PCR方法.并对其特异性、灵敏度、重复性进行评价,然后对收集的市场食品污染物调查样本进行检测,与常规方法做对照.结果:所建立的实时荧光定量PCR方法可准确、特异的检测空肠弯曲菌,低检测限为10 cfu/ml;对50例市场污染物调查样本进行评价,结果显示6份食品污染物调查样本中空肠弯曲菌为阳性,其余为阴性,结果与常规培养检测结果一致.结论:空肠弯曲菌TaqMan-MGB探针荧光定量PCR方法具有结果可靠、操作简便等优势,比目前常规检测方法更灵敏,该方法可用于食物污染物调查、临床检验等多个方面.
关键词： 实时荧光定量PCR 空肠弯曲菌 检测 TaqMan-MGB -
乙型脑炎病毒的实时荧光定量逆转录PCR检测方法的建立
目的 建立一种可以准确、快速、特异检测乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)的一步法实时荧光定量逆转录PCR (reverse transcription-quantitative real time PCR,RT-qPCR)体系. 方法 参照NCBI数据库的乙脑病毒全基因组序列,经过一致性比对分析,在乙脑病毒保守的3'非翻译区(3'untranslated region,3'UTR)区段,设计相应的特异性引物以及Taqman-MGB探针,优化检测体系及反应条件,建立一步法RT-qPCR方法.利用登革热、森林脑炎病毒、肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A16型(CoxA16)、狂犬病毒培养物和临床诊断为登革热及手足口病人的血清样本检测其交叉反应.选择15例疑似脑炎症状的病人血清样本,以国家食品药品监督管理总局(CFDA)批准的乙脑病毒检测试剂盒作对照试剂盒,检测其临床适用性. 结果 所建立的乙脑病毒一步法RT-qPCR检测方法重复性试验Ct值的变异系数CV在0.46％～0.53％之间,低可检出5 copies/反应样本.检测体系与登革热、森林脑炎病毒等黄病毒及EV7I、CoxA16、狂犬病毒培养物等未发现交叉反应;64份临床诊断为登革热和手足口病人的血清样本检测也均为阴性.15份疑似乙脑感染的病人血清样本的检测结果与国家食品药品监督管理总局批准的乙型脑炎病毒检测试剂盒检测结果一致,但本方法操作步骤更少,检测时间更短. 结论 本实验建立的乙型脑炎病毒一步法实时荧光RT-qPCR检测方法具有较高灵敏度、特异性,可用于乙型脑炎病毒的检测.
关键词： 乙型脑炎病毒 TaqMan-MGB 流行性乙型脑炎 RT-qPCR -
耐药结核分枝杆菌多重Taqman-MGB探针检测方法的建立
目的 建立耐药结核分枝杆菌的多重Taqman-MGB探针检测体系.方法 针对结核分枝杆菌抗结核一线药物突变位点[利福平: RpoB(526)/(531);乙胺丁醇: embB(306);异烟肼: KatG(315)、inhA(-15);链霉素: Rpsl(43)]设计并合成引物探针;构建耐药结核分枝杆菌野生型和突变型模板,对其进行梯度稀释;配制结核分枝杆菌耐药基因检测试剂,用不同类型模板进行检测;检测72例结核样本(耐利福平20株,耐异烟肼22株,耐链霉素1株,耐多药17株),并与罗氏药效试验结果比较.结果 该检测体系可同时检测6个结核突变位点,低检测限为104拷贝/mL,对临床样本检测其总符合率为100％,一致性好(χ2=137.3,P＜0.001).结论 本研究建立了耐药结核分枝杆菌的快速检测方法,可较好应用于卫生检疫系统和临床实验室.
关键词： 结核分枝杆菌 耐药结核分枝杆菌 TaqMan-MGB 快速检测
