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EGb761对慢性低氧低糖培养的大鼠海马神经元β分泌酶的影响
目的 研究银杏叶制剂EGb761(金钠多)对慢性低氧低糖培养大鼠海马神经元D分泌酶的影响,探讨其防治痴呆的可能机制.方法 取新生24h的Wistar大鼠海马神经元原代培养,培养第7d行低氧低糖培养和Egb 761(金纳多100ug/ml)药物干预,以荧光法检测D分泌酶活性,Western blot检测13分泌酶BACEI蛋白表达.结果 低氧低糖培养12 h、24 h、56 h组海马神经元较正常培养对照组β分泌酶活性升高(P＜0.05);金纳多药物干预12 h、24 h、56 ha与相应时间非药物干预组相比海马神经元β分泌酶活性降低(P＜0.05).低氧低糖培养12 h、24 h、56 h组海马神经元β分泌酶BACE1表达水平升高(P＜0.05);金纳多药物干预12 h、24 h、56 ha与相应时间非药物干预组相比β分泌酶BACE1表达水平降低(P＜0.05).结论 金钠多对慢性低氧低糖培养海马神经元D分泌酶活性和表达的影响是其防治痴呆的可能机制之一.
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阿尔茨海默病中α分泌酶的研究进展
阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)是一种常见的神经系统退行性疾病.现有研究证实淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)代谢紊乱是导致AD发病的核心环节[1],其中α、β分泌酶功能是决定APP代谢途径的关键.近年来随着对α分泌酶研究的深入,研究者逐渐认识到其可能成为AD治疗的一个重要的靶点而具有深远的临床应用价值.我们主要针对α分泌酶构成、活化途径及激活剂的研究作一概述.
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β分泌酶生物学特性的研究进展
β分泌酶是一种Ⅰ型跨膜蛋白，其在脑内的主要作用是从Met596和Asp597之间以及Tyr606和Glu607之间切割β淀粉样蛋白前体蛋白（β-amyloid precursor protein，APP）形成β淀粉样蛋白（β-amyloid protein，Aβ）的N端，以启动Aβ生成。β分泌酶包括多个成员，其中因天冬氨酸蛋白酶β-位淀粉样蛋白前体蛋白裂解酶1（β-site amyloid precursor protein-cleaving enzyme 1， BACE1）在阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）的发病机制中占有重要地位而研究较多。本文主要对BACE1的基因和蛋白结构、转录和翻译调控、胞内运输和调控、代谢及其调控、底物以及与其同源的酶进行综述，为以BACE1为靶点的药物研发提供借鉴。
关键词： β分泌酶 β淀粉样蛋白前体蛋白裂解酶1 阿尔茨海默病 -
基于荧光共振能量转移法建立筛选β分泌酶抑制剂的适用性评价方法
目的 建立一种基于荧光共振能量转移(FRET)法筛选β分泌酶(BACE1)抑制剂的适用性评价方法.方法 选取2种基于FRET方法建立的商品化BACE1活性测定体系,按照标准流程检验表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)和Compound 1对于BACE1的抑制活性,计算抑制剂在2个测定体系中的抑制率和催化曲线斜率,同时定量计算化合物加入对测定体系荧光强度的影响,并进行对比评价.结果 曾报道的BACE1抑制剂EGCG加入基于FRET方法的测定体系后,导致体系荧光强度降低,且荧光强度降低得到的直线斜率(10.8±2.6)与抑制曲线斜率(10.2±3.4)数据一致,证明EGCG对BACE1的抑制活性为假阳性;而Compound 1加入对于体系荧光强度无影响,证实了其对BACE1的抑制活性.在基于FRET方法的测定体系中初筛显示阳性的化合物,其对测定体系荧光强度的影响与未加入BACE1的空白对照进行校正,评价待测化合物在所选测定体系中的适用性,避免出现假阳性结果.结论 采用此化合物空白荧光校正方法可定量测定被测化合物对于体系荧光强度的影响,从而评价BACE1抑制剂在FRET体系中的适用性.
关键词： 荧光共振能量转移 β分泌酶 荧光强度 表没食子儿茶素-3-没食子酸酯 -
中药黄连中小檗碱类主要成分抗阿尔茨海默病的多靶点体外活性研究
黄连为著名的清热泻火中药,体外活性筛选发现,黄连甲醇提取物能够通过抑制Aβ42聚集、乙酰胆碱酯酶(AChE)和β分泌酶(BACE1)的活性而表现出多靶点的体外抗阿尔茨海默病作用.HPLC分析及单体成分的体外活性验证表明,小檗碱类生物碱成分既是黄连的主要成分同时亦是其有效成分.黄连的上述体外药理活性能够通过6个主要生物碱的标准品混合物得到完整再现.分子对接研究表明,小檗碱类生物碱可以通过疏水效应、芳香堆积和静电相互作用等直接结合于Aβ42、AChE和BACE1的活性位点.
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氯化铝和D-半乳糖对β淀粉样蛋白表达的影响及其机制
目的:探讨β淀粉样蛋白在小鼠D-半乳糖和氯化铝中毒模型中的变化及其机制.方法:使用D-半乳糖联合氯化铝制作阿尔茨海默病小鼠模型.于用药后0、45、60、75、90 d取海马.取海马前用水迷宫实验分析小鼠的记忆和学习能力,对所取海马用改良的Bielschowsky氏银染来观察其病理改变.用Western杂交确定β淀粉样蛋白和BACE1蛋白的改变.结果:氯化铝和D-半乳糖处理的小鼠在水迷宫测试中逃避潜伏期明显延长;Bielschowsky氏银染发现海马细胞层次出现紊乱,但未发现典型的"老年斑"及"神经元纤维缠结";β淀粉样蛋白及BACE1的蛋白水平显著升高.结论:D-半乳糖及氯化铝可导致游离态的β淀粉样蛋白的生成增加,但并不能形成特征性的阿尔茨海默病样病理改变.
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辛伐他汀对高胆固醇血症大鼠APP、BACE蛋白表达的影响
目的 探讨辛伐他汀对高胆同醇血症大鼠β-淀粉样前体蛋白(APP)、β分泌酶(BACE)蛋白表达的影响,为阿尔茨海默病(AD)的预防与治疗提供理论依据.方法 32只大鼠(3月龄)随机分为普通饲料喂养组(n=16)和高胆固醇饲料喂养组(n=16).将高脂饲料喂养鼠随机分为高脂饲料安慰剂组(n=8)、高脂饲料药物组(n=8),并开始灌胃给药,高脂饲料药物组给予辛伐他汀2 mg/(kg·d)灌胃,高脂饲料安慰剂组给同体积安慰剂(蒸馏水)灌胃,灌胃期间继续喂高脂饲料.普通饲料喂养组随机分为普通饲料安慰剂组(n=8)和普通饲料药物组(n=8),分别给予同体积安慰剂(蒸馏水)和辛伐他汀2 mg/(kg·d)灌胃,灌胃期间继续喂普通饲料.8周后APP、BACE蛋白的表达.结果 高脂饲料药物组大鼠前额皮层、海马区APP、BACE的蛋白表达较高脂饲料安慰剂组减少(P＜0.05),高脂饲料药物组与普通饲料安慰剂组、普通饲料药物组之间无显著性差异(P＞0.05).结论 辛伐他汀可能会影响高胆固醇血症大鼠前额皮层、海马区APP、BACE的蛋白表达,从而对Aβ1-42的生成代谢产生影响.
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人参皂苷Rg1调节N2a/APP695细胞β分泌酶活性的可能机制
目的 观察人参皂苷Rg1能否通过核蛋白因子κB(NF-κB)影响N2a/APP695细胞β淀粉样肽(Aβ)的生成和代谢,从源头上缓解和(或)减轻阿尔茨海默病(AD)病人的神经病理改变.方法 利用稳定表达突变型APP695的N2a细胞(N2a/APP695),通过RT-PCR、蛋白免疫印迹、激光共聚焦显微镜等方法检测人参皂苷Rg1对β分泌酶活性及上游转录因子NF-κB活性的影响.结果 2.5 mol/L人参皂苷Rg1作用6～12 h后,N2a/APP695细胞外液Aβ1-40和Aβ1-42水平较Rg1作用前均有不同程度的下降[低值分别为(13.3±4.3 )ng/ml及(12.0±5.4) ng/ml]；BACE1的蛋白表达水平下降(BACE1/β-肌动蛋白比值为0.26±0.05)；NF-κB p65蛋白表达水平明显增加(磷酸化p65/总p65比值为0.93±0.02)并诱导促进NF-κB的核转位；NFκB的抑制剂quinazoline预处理后可见人参皂苷Rg1对BACE1 mRNA和蛋白表达的抑制作用明显减弱.结论 人参皂苷Rg1能激活NF-κB,促进NF-κB的核转位,增加与BACE1启动子相应位点的结合,导致β分泌酶的活性减少.
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β片层阻断肽H102对双转基因AD小鼠海马脑区APP代谢酶的影响
目的:探讨β片层阻断肽H102对APP/PS1双转基因小鼠(AD小鼠)海马脑区β淀粉样蛋白前体蛋白(APP)代谢分泌酶以及学习记忆能力的影响.方法:将6月龄大小的30只AD模型小鼠随机分为AD组和H102组,相同月龄、数量和背景的C57BL/6J小鼠作为对照组(n=15).H102组每日经鼻腔给予H102溶液(5.8 mg/kg)5 μl,对照组及AD组每日给予辅料溶液5 μl.给药30 d后,使用Morris水迷宫的方法检测各组小鼠的空间记忆能力变化,采用免疫组织化学方法及Western blot技术测定海马脑区α分泌酶(ADAM10和ADAM17)、β分泌酶(BACE1)及γ分泌酶(PS1,APH1a,PEN2)在小鼠海马中的表达.结果:与对照组比较,AD组小鼠海马脑区BACE1、PS1、PEN-2、APH1-a蛋白表达显著升高,ADAM10、ADAM17蛋白表达显著降低(P＜0.05);与模型组相比,H102能够明显提高AD小鼠的空间学习记忆能力,明显降低海马脑区BACE1、PS1、PEN-2、APH1-a蛋白的表达,明显提高ADAM10、ADAM17蛋白的表达(P＜0.05).结论:β片层阻断肽H102能够减少海马脑区Aβ的生成,提高海马脑区α分泌酶的活性,降低β和γ分泌酶的活性,改善AD小鼠的学习记忆能力.
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晚发性阿尔茨海默病的血管性易感基因
晚发性阿尔茨海默病(Late-onsetAlzheimer disease,LOAD)是老年人常见的痴呆类型.本病的病理改变以细胞内神经原纤维缠结(NFTs)和细胞外老年斑(SPs)为特征.NFTs由双螺旋的过度磷酸化的Tau蛋白组成,SPs由淀粉样蛋白Aβ组成,Aβ由淀粉样前体蛋白(APP)通过.α、γ和β分泌酶作用而形成.
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丁苯酞对AD大鼠模型海马BACE及NEP活性含量的影响
目的 探讨丁苯酞对AD大鼠模型海马组织β分泌酶(BACE)和中性内肽酶(NEP)活性含量的影响.方法 选用健康雄性Wistar大鼠40只,随机分为4组,假手术组、模型组、丁苯酞低剂量组、丁苯酞高剂量组.采用大鼠海马立体定向注射凝聚态Aβ1-40诱导AD模型,灌胃时间为4周,以ELISA 法测定海马组织匀浆中β-分泌酶及中性内肽酶的活性含量.结果 用药组大鼠海马组织β-分泌酶的活性含量没有明显降低,与模型组之间差异无统计学意义(P>0.05);用药组大鼠海马组织中性内肽酶的活性含量明显升高,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01),但丁苯酞低剂量组与高剂量组之间差异无统计学意义.结论 丁苯酞可以促进AD大鼠模型海马组织的中性内肽酶的活性含量,并可能通过促进其活性含量加速Aβ的降解,但对于β分泌酶却没有明显的影响.
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静脉和吸入麻醉后认知功能障碍与BACE1基因多态性的关系
目的 比较和分析静脉麻醉和吸入麻醉后出现的认知功能障碍与β分泌酶基因多态性的关系. 方法 1000例受试者被随机分配在静脉麻醉组和吸入麻醉组,分别接受全凭静脉麻醉和吸入麻醉.用简易精神量表分析患者术后认知功能,评分小于25分被诊断为认知功能障碍.从受试者全血中提取DNA,用PCR方法扩增β-分泌酶1、β-分泌酶2(BACE1、BACE2)基因,记录两种基因BACE1和BACE2限制性酶切片段的个数. 结果 在静脉麻醉组中,评分的降低与β分泌酶基因单核苷酸多态性没有相关性,而在吸入麻醉组中评分的降低与β分泌酶基因1单核苷酸多态性的相关性有统计学意义.结论 携带β分泌酶1基因单核苷酸多态性的患者应慎用吸入麻醉.
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醒脑液对PAP双转基因痴呆小鼠NEP和BACE1 mRNA表达的影响
目的:探讨中药醒脑液(XNY)对PAP双转基因痴呆小鼠大脑组织中中性内肽酶(NEP)和β分泌酶(BACE1) mRNA表达的影响.方法:采用实时荧光定量PCR技术分别观测正常对照组、模型组、西药对照组、XNY高剂量组、XNY中剂量组和XNY低剂量组小鼠大脑组织中NEP和BACE1 mRNA的表达.结果:与模型组相比,XNY高剂量组脑内NEP mRNA含量表达上调(P＜0.05);XNY高、中剂量组BACE1 mRNA含量表达下降(P＜0.01).结论:醒脑液对双转基因痴呆小鼠大脑组织中NEP和BACE1 mRNA表达有较好的调控作用,说明醒脑液对防治老年性痴呆能起到良好效果.
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阿尔茨海默病中Aβ聚集的研究进展
Aβ是由淀粉样蛋白前体(APP)代谢生成的.APP位于21q21.1 ～21.3,长约300 kb.APP由该基因的16、17外显子编码,含695～770个氨基酸残基,是一种跨膜蛋白,其上有三个酶切位点,可分别被α、β及γ分泌酶剪切.在正常情况下,大量的APP经α-分泌酶和γ-分泌酶的作用代谢,不产生Aβ,只有少量的APP经β及γ分泌酶的作用剪切产生Aβ.其中,γ-分泌酶的切割位点位于APP跨膜结构域内的711或713位置,切割产生Aβ的羧基末端.γ-分泌酶一般在APP的711位置切割产生Aβ40亚型,但当APP或PS21基因突变时则增加在713位置切割,产生Aβ42亚型.此亚型更容易聚合形成纤维,是导致AD早期发病的重要因素.
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吡格列酮对胰岛素抵抗大鼠海马神经元β-淀粉样肽及其相关蛋白的影响研究
目的:观察胰岛素抵抗大鼠海马神经元β-淀粉样肽(β-amyloid,AB)生成与其相关蛋白的表达及吡格列酮的干预效果.方法:48只6～8周龄的Wistar大鼠随机分为正常对照组(Control组)、吡格列酮对照组(Pioglitazone,PIO组)、胰岛素抵抗组(Insulin resistance,IR组)、吡格列酮-胰岛素抵抗干预组(Insulin resistance+pioglitazone.IR-PIO组),IR组和IR-PIO组饮用10%果糖水4周建立胰岛素抵抗模型,造模成功后,Pioglitazone组及IR-PIO组给予吡格列酮10 mg/(kg·d)灌胃,同时,IR组和NC组给于相同体积的生理盐水,共12周;免疫组织化学检测大鼠脑皮层A β<,42>的蛋白表达;Western blotting检测大鼠脑皮质区APP、β分泌酶1(β-secretase,BACE1)、早老素(Presenilin,PS-1)、脑啡肽酶(Neprilysin,NEP)及胰岛素降解酶(Insulin-degrading enzyme,IDE)的表达.结果:免疫组织化学检测显示IR组和IR-PIO组大鼠脑皮质A β<,42>的蛋白表达明显高于NC组及NC-PIO组(P<0.01),而IR-PIO组A β<,42>的蛋白表达低于IR组(P<0.05);Western blotting检测IR组和IR-PIO组大鼠脑皮质APP、BACE1、PS-1的蛋白表达明显高于NC组及NC-PIO组(P<0.01),与IR组相比,IR-PIO组以上各指标表达明显减低(P<0.01);各组间NEP表达差异无统计学意义(P>0.05);NC组及NC-PIO组IED的表达明显增强,与NC组相比,IR组IED的蛋白表达明显减弱(P<0.01),而IR-PIO组蛋白的表达明显强于IR组.结论:胰岛素抵抗大鼠脑皮质可能通过上调BACE1,PS-1活性,促进A β<,42>生成增加,同时抑制IED的活性减少了A β<,42>的降解;吡格列酮能抑制BACE1,PS-1的表达,增强IED的活性,减少A β<,42>生成及促进分解增加.
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阿尔茨海默病重要分泌酶BACE1及其抑制剂
阿尔茨海默病(AD)是一种为普遍的痴呆.其病理特征是神经细胞外不溶性淀粉样蛋白Aβ以及胞内由过磷酸化tau形成的纤维缠结.这种胞外聚合物主要由Aβ4两组成,它是由淀粉样前体蛋白APP依次经β分泌酶(β-secretase)和γ分泌酶(γ-secretase)剪切所产生的.因此,通过抑制此两种酶很有可能能够减少Aβ的产生从而延缓病程.由于γ分泌酶有众多重要的生理功能,被抑制后会产生很多较为严重的副作用,因此β分泌酶的抑制剂可能是对抗AD药物研发的更有效切入点.本文主要对影响BACE1的表达及活性的相关因素和新研制成功的β分泌酶抑制剂做简要综述.
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脑室注射同型半胱氨酸对脑缺血大鼠β淀粉样蛋白及认知功能的影响
目的:观察脑室注射同型半胱氨酸(Hcy)对实验性脑缺血大鼠脑组织β淀粉样蛋白(Aβ)的表达及学习记忆的影响.方法:Wistar雄性成年大鼠按随机数字表法分为假手术组、脑缺血组、Hcy组.采用线栓法建立左侧大脑中动脉脑缺血大鼠模型,2h后同侧脑室立体定向注射Hcy(3 μmol/L).采用Morris水迷宫测试各组大鼠学习记忆能力;化学定量法检测血浆中Hcy含量;免疫荧光组织化学检测Aβ42、β-分泌酶(BACE1)在海马CA1区神经元中的共定位;免疫印迹检测Aβ42、BACE1在海马CA1区中的表达变化;结果:与假手术组相比,脑缺血组逃避潜伏期延长,穿越平台次数及平台象限停留时间均减少,并且Aβ42和BACE1表达明显上调,差异均有统计学意义.Hcy脑室注射后显著增加Aβ42和BACE1表达,明显加重脑损伤后的学习和记忆功能障碍.结论:Hcy可以导致脑缺血大鼠的学习记忆功能障碍,海马CA1区Aβ42和BACE1表达升高可能是其机制之一.
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RNA干扰调节β分泌酶治疗阿尔茨海默病
阿尔茨海默病(AD)是一种为常见的慢性神经系统退行性疾病，AD发病机制中众多的细节问题尚未完全阐明，且无针对病因的有效治疗方法，文中针对AD新治疗进展作一综述。
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淀粉样前体蛋白β切割的调控
阿尔茨海默病是造成老年人痴呆的首要因素.淀粉样蛋白级联假说认为β淀粉样蛋白是阿尔茨海默病的致病因子,其在大脑中的含量高低对疾病的发生有重要意义.β淀粉样蛋白由淀粉样前体蛋白相继经β和γ分泌酶切割产生,而α分泌酶的切割既排除了β淀粉样蛋白的形成,又能产生具有神经保护作用的片段.因此,抑制β或γ切割,或者增强α切割,都可以减少β淀粉样蛋白的积累,改善阿尔茨海默病的病理表现.淀粉样前体蛋白切割的调控机理,目前已被广泛研究.本文就淀粉样前体蛋白β切割的调控机理作一综述.
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β淀粉样蛋白与年龄相关性白内障
白内障是世界首位致盲性眼病,而年龄相关性白内障(ARC)是其中主要的类型.ARC的发病机制以及非手术干预已经成为了研究热点.近来,研究者在多种证据支持下提出ARC与阿尔兹海默病(AD)可能存在类似的发病机制;因此,导致AD发生的关键物质β-淀粉样蛋白(Aβ)与ARC的相关性受到了特别关注.本文主要就Aβ与ARC的相关性研究进展作一综述.
