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酒精鼠有助于研究人类酒精中毒
酒精中毒是一个复杂的病变。尽管目前还不清楚它的相关作用基因和分子途径，但它表现为遗传倾向。人类的一些酒精中毒表现，例如对酒精的倾向性和敏感性，能制成动物模型。下面利用基因敲除鼠，对这两方面进行研究。 多巴胺神经递质是一种表现为对酒精和药物自我控制的重要组成部分。人类已经知道五个酒精中毒受体基因，它们是酒精中毒基因的候选对象。实际上，关于D2多巴胺受体基因(DRD2)的一些连锁和相关分析，暗示这个高敏位点在人类酒精中毒基因中。Phillips等人研究D2受体敲除鼠，发现选择性给予它们永远或逐渐增加酒精浓度，其对酒精的倾向性和消耗能力比复合型和野生型鼠明显降低。通过对酒精自发运动采用调查敏感度，只有敲除鼠不能显示正常的运动抑制反应。因此，这表示D2受体影响了小鼠对酒精的敏感性和倾向性，至少C57BL/6J品系鼠是这样的。 Thiele等人调查了神经肽Y(NPY)的作用。它参与了包括摄食和相关行为的一系列活动，是一种神经调节子。NPY也影响了酒精中毒。通过对酒精敏感度逐渐增加品系鼠的连锁分析，发现了NPY区域在含有高酒精倾向的鼠脑中表达。Thiele发现了NPY缺陷鼠比野生鼠有明显高的酒精消耗性和倾向性；并且NPY基因敲除鼠显示了对酒精的镇定效果敏感性的降低。通过对NPY高敏度的表达，发现了高NPY水平导至了对酒精的倾向性和高的敏感性。这些数据表明在鼠系129/SV和C57BL/6J的杂交株中，酒精的倾向性和抗性与NPY在脑中的分布呈负相关。 对酒精的倾向性和敏感性的鼠基因的鉴定，不能够表明基因有效位点的自然突变决定人对酒精的不同反应。然而，鉴定涉及这些表型的代谢途径，终能发现更多有效的分子治疗方法，并且能鉴定对酒精中毒的高危个体。董学雨方福德搞自Mol. Med. Today 1999; 5(2):53
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感染性疾病与遗传背景
随着人类基因组计划的进行,人们对疾病研究的重点开始向宿主的遗传背景转移.而在感染性疾病领域,不同个体暴露于同一病原体后的易感性、临床表现、疗效及转归等方面均有不同.针对上述现象,研究者们利用基因敲除鼠、基因突变鼠以及转基因鼠等进行了大量的动物实验,以研究动物宿主对感染的易感性和抗感染性,证实了宿主的基因因素在抗感染过程中起到了很大的作用[1].而对于遗传因素在人类感染性疾病中的作用的研究则比较复杂,需要结合流行病学(确定危险因素)和遗传学信息(通过家系研究了解研究对象与基因标志物间的联系)来对疾病进行研究.与感染性疾病相关的临床表型、种族差异以及对双胎研究都证实人体的基因型与疾病的易感性、严重程度有关.而极端的例子就是麻风病,因其有极强的家族聚集性,导致在早期人们普遍误认为麻风病是直接由基因突变引起的[2].
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脂解新关键酶——ATGL研究进展
长期以来激素敏感性脂肪酶(HSL)被认为是脂肪水解唯一的关键酶,近20年来相继对该酶底物的选择性以及调控机制开展了广泛的研究.脂肪水解受到很多激素的调节,如胰高血糖素、肾上腺素等,这些激素在机体能量不足时与膜上受体结合,引起级联反应后导致细胞内第二信使cAMP浓度增加,活化蛋白激酶A (PKA),HSL在围脂蛋白(perilipin)的协同作用下,催化甘油三酯分解[1].但这一观点在HSL基因敲除鼠出现后受到了质疑,Haemmerle等将小鼠HSL基因敲除后发现,小鼠脂肪组织、肌肉和附睾有甘油二酯累积而不是甘油三酯[2],因此提示我们还存在另外一种酶将甘油三酯分解成甘油二酯.
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CyclinD(-/-)/Patched(+/-)双基因敲除鼠的构建
目的 构建CycD(-/-)/Ptc(+/-)双基因敲除鼠以验证Hh传导系统与Rb系统的关系.方法 应用已有的杂合子CycD基因敲除鼠CycD(+/-)与杂合子Ptc基因敲除鼠Ptc(+/-)进行交配繁殖,得到双基因杂合子敲除鼠CycD(+/-)/Ptc(+/-),再利用该双基因杂合子敲除鼠进行二次交配繁殖,得到实验组CycD(-/-)/Ptc(+/-)双基因敲除鼠.结果 实验得到了双基因敲除鼠CycD(-/-)/Ptc(+/-)、双基因杂合子基因敲除鼠CycD(+/-)/ptc(+/-)、cycD单基因敲除鼠CycD(-/-)/Ptc(+/+).结论 通过本实验方法得到CycD(-/-)/Ptc(+/-)双基因敲除鼠,可用于进一步揭示Ptc基因与CycD基因相互影响调控的作用及Hedgehog与Rb信号传导通路在哺乳动物中的相关性.
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应用CRISPR/Cas9技术制备Vasohibin-2基因敲除小鼠模型及验证
目的:利用Cas9/RNA system gene targeting技术高效构建Vash2基因敲除小鼠模型.方法:根据Vash2基因序列,设计2对Vsah2基因的单链向导RNA (single-guide RNA,sgRNA)引物序列并克隆进入pU57-T7-GDNA载体.利用T7 RNA聚合酶体外转录sgRNA和Cas9 mRNA.将体外转录的gRNA/Cas9 mRNA显微注射入小鼠受精卵,通过PCR和基因测序对Vash2移码突变进行检测和鉴定.繁育Vash2基因敲除小鼠并分析后代突变情况.结果:顺利构建表达sgRNA载体并体外转录,成功将有活性的sgRNA和Cas9 mRNA直接注射入受精卵.基因测序鉴定获得5只F0代初建鼠.选取5号鼠与野生型鼠回交,得到F1代鼠,再相互交配得到F2代鼠.PCR显示F2代鼠Vash2基因移码突变,成功建立Vash2基因敲除小鼠模型并传代繁育.结论:通过Cas9/RNA systemgene targeting技术可以成功制备Vash2基因敲除鼠模型,是用于Vash2研究的有效工具.
关键词： CRISPR/Cas9 Vasohibin-2 基因敲除鼠 sgRNA -
普罗布考对高密度脂蛋白性质的影响
目的:探讨降胆固醇及抗氧化药物普罗布考对动脉粥样硬化形成过程中高密度脂蛋白(HDL)代谢的影响.方法:利用普罗布考(0.5%,w/w)给药于载脂蛋白E (apoE)和清道夫受体BI(SRBI)双基因敲除(DKO)鼠6周,血浆经快速蛋白液相色谱(FPLC)分离后检测各脂蛋白胆固醇水平,酶法测定HDL相关抗氧化酶对氧磷酯酶1(PON1)和血小板活化因子-乙酰水解酶(PAF-AH)活性,并比较普罗布考对DKO鼠粥样硬化斑块形成的影响.结果:普罗布考降低DKO鼠血浆总胆固醇水平56%,同时使其异常大分子的HDL出现部分颗粒大小正常化,PON1及PAF-AH活性明显增高,粥样斑块损伤明显减轻.结论:普罗布考在apoE/SR-BI DKO鼠的抗粥样硬化作用与其保护HDL正常性质与功能有关.
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下丘脑－垂体－性腺轴在FKBP12．6缺失介导的性别差异性心肌肥大发生发展过程中的作用及其分子机制
目的：我们的前期研究发现，敲除FKBP12．6基因可导致成年雄性小鼠心肌肥大。本研究旨在探讨FKBP12．6缺失导致性别差异性心肌肥大的分子机制。方法：手术摘除FKBP12．6基因敲除小鼠睾丸以观察对心肌肥大的影响；放射性免疫检测法（RIA）和ELISA法检测FKBP12．6敲除小鼠17β－estradiol （E2）、testosterone （T）、LHβ和FSHβ分泌变化情况；建立垂体神经元LβT2 FKBP12．6shRNA载体稳定干扰细胞系，采用Fluo3－AM荧光探针检测［ Ca2＋］ i；real－time PCR检测LHβ、FSHβ、calci－neurin（CaN）等mRNA表达变化；分离胞浆胞核蛋白，Western blot法检测CaN、MCIP1．4、NFAT3、Nur77、Pin1等蛋白表达和核浆分布情况。结果：摘除雄性FKBP12．6基因敲除鼠的睾丸可显著抑制心肌肥大的发生；FKBP12．6敲除小鼠心脏中可能促进心肌肥大的通路CaN和CaMKⅡ的表达和活性并未发生明显变化；血清E2、T、LHβ及FSHβ水平与WT相比显著上调，表明敲除小鼠性腺轴调控增强；LβT2 FKBP12．6干扰后［ Ca2＋］ i 显著上升；性腺轴相关基因LHβ、SF－1、Nur77和钙离子相关基因CaN、MCIP1．4、SERCA2的mRNA表达显著上调；胞浆中CaN和MCIP1．4蛋白水平上调；NFAT3、Nur77和Pin1核转位明显增加。结论：FKBP12．6缺失后垂体细胞内钙离子水平上调，激活CaN／NFAT3通路，进而促进LHβ和FSHβ转录，导致下丘脑－垂体－性腺轴激活，从而诱发性别差异性心肌肥大。
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瞬时受体电位通道（TRPV1）在热性惊厥中的作用及其机制研究
目的：通过分析C57BL／6野生型小鼠和TRPV1基因敲除鼠热性惊厥行为学、脑内炎性因子表达变化，探讨TRPV1对热性惊厥发生及复发的致病机制。方法：高热诱导C57BL／6野生型小鼠和TRPV1基因敲除鼠热性惊厥后：比较两组间热性惊厥行为学、脑电图及核心温度的差异；ELISA检测两组间大脑及经辣椒素和高热处理后BV2细胞中炎性因子的表达差异。结果：（1）行为学评分显示，与野生型小鼠相比：TRPV1基因敲除鼠经高热诱导惊厥后，其潜伏期延长，惊厥持续时间缩短，发作等级降低；TRPV1基因敲除鼠热性惊厥发作时无明显惊厥脑电棘波；TRPV1基因敲除鼠惊厥发作时核心温度升高；（2）野生型小鼠大脑海马和皮质中炎性因子的表达水平较常温对照组明显升高，TRPV1基因敲除鼠中未检测到类似结果；（3）经辣椒素、高热处理后，永生小胶质细胞系BV2分泌炎性因子的水平显著增加。结论：激活TRPV1可刺激炎性因子分泌，促进反复热性惊厥的发生，提示TRPV1通道可能是热性惊厥发生的潜在易感基因。
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肾上腺髓质素对血管紧张素Ⅱ刺激下的肾上腺髓质素基因敲除鼠肾间质纤维化的保护作用
肾上腺髓质素(adrenomedullin, AM)是一种血管扩张肽,在肾间质纤维化中可以通过自分泌和旁分泌的方式起调节作用[1].肾上腺髓质素基因敲除(AMKO)的杂合子小鼠,血清和器官中的AM含量为野生型的一半[2].通过本实验,我们研究内源性AM对肾间质纤维化的作用.
