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miR-30 a抑制人骨肉瘤细胞143 B的迁移、侵袭和活力
目的：探讨miR-30a对人骨肉瘤细胞143B侵袭、迁移和细胞活力的影响。方法过表达或抑制miR-30a分别处理人骨肉瘤细胞143B。划痕实验观察细胞划痕愈合能力；Transwell 实验检测143B细胞迁移和侵袭能力；MTT实验检测细胞活力；定量PCR实验确认过表达miR-30a腺病毒有效性并且检测RUNX2 mRNA表达；Western blot检测细胞中RUNX2总蛋白表达。结果过表达miR-30a抑制了骨肉瘤细胞143B迁移和侵袭（P＜0.05），在72 h时， miR-30a明显抑制细胞活力（ P＜0.01）；抑制miR-30a的内源性表达后，143B细胞的迁移和侵袭能力增加（ P＜0.05），细胞活力也表现出上升水平（ P＜0.01）；同时过表达miR-30 a可以抑制RUNX2的蛋白表达，抑制内源性miR-30a后RUNX2蛋白水平表达增加（P＜0.05）。荧光素酶活性检测，miR-30a可以靶向于RUNX2（P＜0.01）。结论 miR-30a抑制骨肉瘤细胞143B的迁移、侵袭和活力，其作用可以能是通过抑制RUNX2的表达来实现。
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纤维粘连蛋白使骨肉瘤细胞逃避Anoikis凋亡
骨肉瘤发生转移的一个重要原因是肿瘤细胞可以脱离细胞外基质(extracellular matrix, ECM)存活并移动,而正常细胞在脱离与 ECM 的接触后会发生Anoikis凋亡[1,2].我们对纤维粘连蛋白(fibronectin,FN) 在人骨肉瘤细胞逃避Anoikis 凋亡过程中的作用机制进行了研究.
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重组人血管内皮抑制素联合顺铂对人骨肉瘤MG-63细胞VEGF基因表达、增殖及侵袭力的影响
目的 观察重组人血管内皮抑制素(rhEndo)联合顺铂对人骨肉瘤MG-63细胞VEGF基因表达、增殖及侵袭力的影响.方法 顺铂、rhEndo、rhEndo联合顺铂分别处理MG-63细胞,采用RT-PCR和Western blot检测细胞VEGF mRNA和蛋白表达量,CCK-8实验检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell小室体外迁移实验检测细胞侵袭和迁移能力.结果 rhEndo联合顺铂组对VEGF mRNA和蛋白表达量、细胞增殖、侵袭迁移的抑制作用以及对细胞凋亡的促进作用均显著高于rhEndo、顺铂单药组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 重组人血管内皮抑制素联合顺铂能够在抑制骨肉瘤MG-63细胞VEGF表达、细胞增殖和侵袭力、促进细胞凋亡方面发挥协同作用.
关键词： 重组人血管内皮抑制素 人骨肉瘤细胞 VEGF 增殖 侵袭转移 -
线粒体融合蛋白基因对人成骨肉瘤MG-63细胞的促凋亡作用研究
骨肉瘤(osteosarcoma)是起源于间叶组织常见的恶性肿瘤,好发于青少年,恶性程度高,易于复发和肺部转移,预后差[1].骨肉瘤的治疗以扩大或根治性截肢术,辅以化疗的综合治疗为主要治疗方法,但由于骨肉瘤的多重耐药性制约了它的化疗效果和远期预后[2].因此有必要寻找新的治疗方法.肿瘤的发生不仅与细胞增殖失控相关,也与细胞凋亡受到抑制相关.增殖抑制基因(HSG)又称线粒体融合蛋白基因(Mfn2),研究发现[3]它能够有效地抑制受损血管平滑肌增殖,使细胞停留Mfn2于G0/G1期.近年的研究表明Mfn2基因能抑制肿瘤细胞增殖,诱导细胞凋亡.本实验观察Mfn2基因对人骨肉瘤细胞MG-63生长的影响,并初步探讨其可能的机制,为骨肉瘤基因治疗寻找新的靶点提供实验依据.
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HIF-1α表达对人骨肉瘤细胞自噬的影响
目的 探讨HIF-1α的表达程度对人骨肉瘤细胞自噬的影响.方法 传代培养人骨肉瘤细胞株(MG-63),施加不同条件诱导各组细胞中HIF-1 α不同程度表达,MTF法检测细胞增殖抑制率变化,Western blot检测HIF-1α、Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达.结果 低氧条件下HIF-1α表达增加,细胞增殖受到抑制,同时LC3Ⅱ/LC3Ⅰ,Beclin-l表达水平增加;当诱导HIF-1α过度表达时,细胞增殖受抑制更明显,同时LC3Ⅱ/LC3Ⅰ,Beclin-1表达水平增加亦更明显;当HIF-1α表达受到抑制时,细胞增殖受抑制减弱,同时LC3Ⅱ/LC3Ⅰ,Beclin-1表达水平亦较少.结论 HIF-1α可能参与人骨肉瘤细胞的发病机制.
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骨肉瘤细胞热休克蛋白70基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达
目的从人的骨肉瘤细胞中钓取热休克蛋白70(HSP70)基因并在大肠杆菌中表达出热休克蛋白,为进行热休克蛋白的功能试验提供抗原.方法热休克人骨肉瘤细胞后,采用0ne-Step,RT-PCR方法从人骨肉瘤细胞中钓取HSP70基因,DNA测序正确的HSP70基因和表达载体pET28a连接后,构建成功了重组表达质粒pET28a-HSP70,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导蛋白表达后,进行SDS-PAGE及Westernblot鉴定.结果人骨肉瘤细胞HSP70基因的PCR产物约为1.9 kb,DNA序列测定结果证实,所获目的序列与文献报道的基本一致,仅有两个碱基的差异.构建的重组表达质粒pET28a-HSP70,能够在大肠杆菌中表达.结论从人骨肉瘤细胞中成功地钓取了HSP70基因并在大肠杆菌中表达出HSP70蛋白,为研究人骨肉瘤细胞HSP70的结构、功能与临床应用奠定了基础.
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姜黄素联合顺铂对人骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响
目的:观察姜黄素联合顺铂对人骨肉瘤细胞MG-63增殖和凋亡的影响.方法:采用不同浓度的姜黄素、顺铂和姜黄素联合顺铂处理人骨肉瘤细胞MG-63不同时间,通过MTT法检测其对MG-63细胞生长的抑制作用；平板克隆实验检测其对MG-63细胞克隆形成能力的影响；流式细胞仪检测其对MG-63细胞凋亡的影响.结果:单用姜黄素或顺铂均可以时间和浓度依赖性方式抑制骨肉瘤细胞MG-63的增殖.与空白对照组相比,单用10 μmol/L姜黄素和2、4μmol/L顺铂可抑制MG-63细胞的增殖,降低其克隆形成率并提高细胞凋亡率(P＜0.05)；而与姜黄素和顺铂单用处理相比,10 μmol/L姜黄素分别与2、4μmol/L顺铂联合应用,可更显著抑制MG-63细胞的增殖,降低其克隆形成率并提高细胞凋亡率(P＜0.01).结论:姜黄素联合顺铂与单药相比能够显著抑制人骨肉瘤细胞MG-63细胞的增值,促进其凋亡,两药对骨肉瘤细胞的杀伤效应具有一定的协同性.
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蛇床子素促进人骨肉瘤细胞株SAOS-2凋亡
目的:观察蛇床子素(osthole)对人骨肉瘤细胞SAOS-2增殖和凋亡的影响及潜在的调控机制.方法:采用MTT法、TUNEL染色技术和流式细胞术检测不同浓度蛇床子素对骨肉瘤细胞凋亡的影响;Western blot检测蛇床子素对骨肉瘤细胞中与细胞凋亡密切相关的蛋白(Bax、Bcl-2)的变化.结果:蛇床子素作用于SAOS-2细胞后,MTT结果显示SAOS-2细胞的活力受到明显抑制,且与蛇床子素浓度和时间相关;Western blot结果显示细胞中的促凋亡蛋白Bax表达上调,抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显减弱,且呈剂量依赖性.结论:蛇床子素可显著抑制人骨肉瘤细胞的增殖且促进其凋亡的作用,可能与上调凋亡蛋白Bax和下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达有关.
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苦参碱对骨肉瘤细胞生长抑制作用的体外研究
目的:观察苦参碱体外对人骨肉瘤MG-63细胞的生长抑制作用.方法:用CCK-8法检测不同浓度苦参碱对人骨肉瘤MG-63细胞的生长抑制率;倒置显微镜下观察0、100、200、400 μg/ml苦参碱作用48小时后MG-63细胞形态学改变;流式细胞仪检测0、100、200、400 μg/ml苦参碱作用48小时后MG-63细胞周期分布和凋亡现象.结果:不同浓度苦参碱对MG-63细胞均有生长抑制作用,且其生长抑制作用在苦参碱浓度为30～180 μg/ml之间随浓度增加而增强;细胞形态学观察和流式细胞仪检测提示,400 μg/ml浓度苦参碱能诱导MG-63细胞凋亡.结论:苦参碱对人骨肉瘤MG-63细胞体外有生长抑制和诱导凋亡的作用.
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双氢青蒿素对人骨肉瘤细胞株143B增殖和凋亡的作用
目的 观察双氢青蒿素(dihydroarteminin,DHA)对人骨肉瘤细胞143B的增殖和凋亡的影响以及可能的机制.方法 体外培养人骨肉瘤细胞株143B;MTT比色法和克隆形成实验检测不同浓度DHA对骨肉瘤细胞存活与克隆形成能力的影响.Hoechst 33258染色法观察细胞凋亡的形态变化.构建β-Catenin荧光素酶报告基因(β-Catenin-Luc,p-Top)检测DHA作用143B后细胞内β-Catenin活性变化.不同浓度的DHA作用后,Western blot检测与细胞增殖(如PCNA、Cyclin D1、c-Myc)、凋亡(如Bad、Bcl-2、Caspase-3)密切相关的标志物蛋白质表达变化.结果 DHA作用于143B细胞24 h后,MTT结果显示143B细胞的增殖活性受到明显抑制,且其克隆形成能力减弱(P<0.05),在DHA浓度达35 μmol·L-1时,抑制效率明显.Western blot结果显示PCNA表达下调;而促凋亡蛋白Bad和 Caspase-3表达上调,Bcl-2蛋白表达明显减弱.结论 双氢青蒿素具有较明显的抑制人骨肉瘤细胞的增殖且促进其凋亡的作用,可能通过下调细胞增殖相关蛋白PCNA、Bcl-2和上调促凋亡蛋白Bad和Caspase-3,启动凋亡程序,致143B细胞发生凋亡.
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β-榄香烯通过抑制WNT信号通路促进MG-63细胞凋亡
β-榄香烯在作为化疗药使用时表现为互副作用小,极少产生耐药性[1].但是榄香烯治疗骨肉瘤尚未见报道.
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耐阿霉素人骨肉瘤细胞株的建立及其耐药机制探讨
目的 诱导并建立耐阿霉素(ADM)的人骨肉瘤细胞株并探讨其耐药机制.方法 采用逐步增加约物剂量冲击诱导方法诱导人成骨肉瘤原代Saos-2细胞株;MTT法检测原代与耐药细胞株对ADM、顺铂(DDP)、甲氨蝶呤(MTX)、异环磷酰胺(IFO)、表柔比星(EPI)、比柔比星(THP)、紫杉醇(Paclitaxel,PTX)药物敏感性;利用光学显微镜、透射电镜观察细胞形态及超微结构变化;RT-PCR和IHC法分别检测多药耐药基因1(MDRl)、多药耐药相关蛋白(MRP)基因及其相应蛋白(P-gp)、MRP的表达.结果 经167 d的诱导,建立Saos-2/ADMl、Saos-2/ADM4细胞株,其对ADM的耐药指数分别为原代细胞株的49.8和74.6倍;耐药细胞株对MTX、EPI、THP、PTX亦产生不同程度的交叉耐药(P<0.05),对DDP仍然敏感(P>0.05);光镜观察Saos-2/ADM1、Saos-2/ADM4细胞株细胞体积增大,多核现象较原代Saos-2细胞株明显增加;透射电镜显示Saos-2/ADM1、Saos-2/ADM4细胞株表面突起较原代Saos-2细胞株减少、且核仁增大增多;细胞生长曲线显示耐药细胞株增殖能力下降.MDR1 mRNA、MRP mRNA和P-gP、MRP在各耐药细胞株表达阳性.结论 MDR1 mRNA、MRP mRNA及其相应蛋白参与了耐药细胞株耐药的形成,这些骨肉瘤耐药细胞株为进一步研究骨肉瘤耐药特征及逆转方法打下了基础.
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Cell-SELEX筛选人骨肉瘤细胞MG-63核酸适配体的实验研究
目的 获取人骨肉瘤细胞MG-63的核酸适配体,并对核酸适配体克隆进行测序.方法 通过细胞指数富集的配基系统进化(Cell-SELEX)技术建立人骨肉瘤细胞核酸适配体筛选平台,对筛选过程中的文库PCR退火温度、PCR循环扩增次数进行优化和改进,获取人骨肉瘤细胞MG-63的核酸适配体,并对核酸适配体克隆进行测序.结果 在其他条件不变的情况下,文库PCR退火温度56.2℃、循环扩增15次能获得足量的扩增产物,挑选20个克隆进行测序,得到5条核酸适配体序列.结论 应用Cell-SELEX技术可成功筛选人骨肉瘤细胞MG-63核酸适配体,为后期骨肉瘤循环肿瘤细胞的分离检测奠定实验基础.
关键词： 核酸适配体 Cell-SELEX 人骨肉瘤细胞 -
miR-181a重组穿梭载体的构建及其对人骨肉瘤细胞迁移侵袭能力的影响
目的 探讨miR-181a对入骨肉瘤细胞迁移侵袭能力的影响.方法 通过构建miR-181a重组穿梭载体,并将其转染到人骨肉瘤细胞MG63中,以Transwell实验检测人骨肉瘤细胞MG-63的迁移和侵袭能力.结果 pGV314-miR-181a重组穿梭载体组相对于空白对照组及pGV314空载体组,细胞迁移和侵袭的能力获得增强,组间差异有统计学意义(P＜0.05).结论 miR-181a能显著提升入骨肉瘤细胞的迁移和侵袭能力.
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靶向Bak1的shRNA表达腺病毒构建及其对人骨肉瘤细胞的影响
目的 构建沉默人Bcl-2拮抗1基因(Bak1)的重组腺病毒,感染人成骨肉瘤细胞MG63并检测其对细胞活性的影响.方法 设计特异性针对Bak1的shRNA序列及无关对照序列scr,分别构建重组腺病毒表达载体,感染人成骨肉瘤细胞MG63,利用qPCR和Western blot检测Bak1基因沉默后的MG63细胞Bak1 mRNA及蛋白的表达,筛选出能高效沉默目标基因的重组腺病毒表达载体,并对其进行包装扩繁,荧光显微镜观察计算病毒滴度,利用MTT法检测高效沉默的重组腺病毒感染MG63细胞后的细胞活性.结果 ①测序列结果表明,shRNA序列已成功克隆入到pAd-GFP载体上;②shRNA-3的沉默效率高,扩增纯化后腺病毒滴度达到7.7×108GFU/ml;③MTT检测显示与NC对照组相比,shRNA-3组MG63细胞活性增强(P<0.5).结论 成功构建了沉默Bak1的重组腺病毒,为进一步研究Bak1的功能奠定了基础.
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HELQ对骨肉瘤细胞增殖、侵袭、迁移的影响及机制
目的 探讨POLQ样蛋白解旋酶(HELQ)对骨肉瘤细胞增殖、侵袭、迁移的影响及作用机制.方法 将体外培养的人源骨肉瘤细胞系U2-OS、143B随机分为Lv-HELQ组、NC组、Lv-shHELQ组,分别转染Lv-HELQ、Lv-Negative、Lv-shHELQ慢病毒载体.转染48 h时,采用Western blotting法检测HELQ蛋白表达,结果显示两种细胞Lv-HELQ组HELQ蛋白相对表达量均高于NC组,Lv-shHELQ组均低于NC组,组间比较P均＜0.05,提示HELQ转染成功.三组(两种细胞)转染48 h时,采用CCK8法检测细胞增殖情况(光密度值),采用Wound healing法检测细胞迁移率,采用Transwell invasion法检测细胞穿膜细胞数(侵袭能力),采用彗星实验检测彗星尾部DNA百分比.结果 两种细胞Lv-HELQ组光密度值均高于NC组,Lv-shHELQ组光密度值均低于NC组,组间比较P＜0.05或＜0.01.两种细胞Lv-HELQ组细胞迁移率、穿膜细胞数及均彗星尾部DNA百分比均低于NC组,Lv-shHELQ组均高于NC组,组间比较P均＜0.05.结论 HELQ可抑制人骨肉瘤细胞增殖、侵袭、转移,修复DNA损伤可能是其作用机制.
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三氧化二砷对人骨肉瘤U2-OS细胞增殖和周期的影响
目的 观察三氧化二砷(As2O3)在体外对人骨肉瘤U2-OS细胞增殖及周期的影响.方法 将对数生长期入骨肉瘤U2-OS细胞分为两组,实验组分别加入0.5、1.0、1.5 μmol/L As2O3,阴性对照组加入同体积培养液,阳性对照组加入5-Fu 15 mg/L,采用MTT比色法检测各组24、48、72 h增殖抑制率,流式细胞仪检测48 h后细胞周期变化.结果 各浓度的As2O3对骨肉瘤U2-OS细胞均具有抑制增殖作用,且呈剂量和时间依赖性；随着As2O3浓度的升高,细胞周期发生S期阻滞,与正常对照组相比有统计学差异(P＜0.05).结论 As2O3能抑制骨肉瘤U2-OS细胞增殖,其机制可能为使细胞发生S期阻滞.
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雷帕霉素联合顺铂治疗人骨肉瘤的研究
目的 比较雷帕霉素联合顺铂与单用雷帕霉素或单用顺铂对人骨肉瘤细胞增殖和捌亡的影响.方法 将人骨肉瘤细胞株随机分为4组:空白组、阳性药1组、阳性药2组和治疗组.阳性药1组应用雷帕霉素20mg/L,阳性药2组应用顺铂10 mg/L,治疗组联合雷帕霉索20mg/L和顺铂10mg/L,空白组加入等量生理盐水.利用噻唑蓝(MTT)比色法俭测雷帕霉素联合顺铂或单用雷帕霉素/顺铂对骨肉瘤细胞的增殖抑制率；流式细胞术检测雷帕霉素联合顺铂或单用雷帕霉素/顺铂对骨肉瘤细胞凋亡率的影响.结果 联合应用两种药物对人骨肉瘤的抑制率较单独使用明显增强,且差异有统计学意义(P＜0.05),空白组:0.33±0.02,阳性药1组:0.56±0.05,阳性药2组:0.55±0.03,治疗组:0.95 ±0.01 单独应用雷帕霉素和顺铂,可诱导骨肉瘤细胞凋亡；联合应用时,诱导凋亡作用显著增强,且差异有统计学意义(P＜0.05).结论 雷帕霉素与顺铂联合应用,可明显抑制骨肉瘤细胞的增殖并诱导其凋亡,比单独应用效果更佳.
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RGDS-GG-KLAKLAKK多肽对人骨肉瘤细胞黏附迁移和侵袭力的影响
目的 研究多肽RGDS-GG-KLAKLAKK对体外培养人骨肉瘤细胞MG-63黏附迁移和侵袭力的影响,并探讨其作用机制.方法 将不同浓度(0、25、50、75、100μmoL/L)的多肽RGDSGG-KLAKLAKK与MG-63细胞混合培养,用比色法测量多肽RGDS-GG-KLAKLAKK对MG-63细胞黏附力的抑制作用,通过transwell小室侵袭模型检测多肽对MG-63细胞侵袭力的影响.观测多肽对骨肉瘤细胞自发肺转移模型抗肿瘤转移的影响.结果 MG-63骨肉瘤细胞对纤维连接蛋白(Fn)的黏附被多肽GDS-GG-KLAKLAKK对明显抑制(P<0.05).25、50、75、100 μmol/L的多肽RGDS-GG-KLAKLAKK对MG-63细胞侵袭力的抑制率分别为(18.3±2.9)%、(28.5±4.8)%、(40.4±5.6)%和(66.7±7.8)%,对比空白对照组(0μmol/L多肽)差异有统计学意义(P<0.05).多肽RGDS-GG-KLAKLAKK对MG-63骨肉瘤细胞浸润能力有明显抑制作用.MG-63骨肉瘤细胞接种于裸鼠后给予多肽RGDS-GG-KLAKLAKK治疗,与对照组比较,有明显的肺重减轻、肺转移灶减少(P<0.05).结论 多肽RGDS-GG-KLAKLAKK能够抑制人骨肉瘤MG-63细胞的体外黏附、侵袭和转移.
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Survivin反义寡核苷酸对人骨肉瘤细胞的抑制作用
我们以骨肉瘤OS-732细胞为对象,在明确其高表达Survivin基础上,尝试通过合成靶向Survivin的反义寡核苷酸(ASODN)转染OS-732细胞,以封闭Survivin表达,探讨ASODN对骨肉瘤细胞凋亡/增殖的影响及其对化疗药物的促进作用.
