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小鼠CXCR4基因慢病毒载体构建与真核表达
本研究旨在克隆小鼠CXC型趋化因子受体4(CXCR4)基因,构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的CXCR4重组慢病毒栽体并在真核细胞中表达.采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)以C57BL/6小鼠骨髓细胞为模板克隆全长型CXCR4基因,连接至克隆载体pCR-Blunt,经限制性内切酶酶切后亚克隆至慢病毒转移栽体,构建携带EGFP及CXCR4双顺反子结构的自身失活型重组慢病毒表达质粒；同时构建LV-IRES-EGFP作为对照质粒；通过脂质体转染法与包装质粒及包膜蛋白质粒共转染包装细胞293FT,超速离心浓缩病毒颗粒后转染293FT细胞,采用荧光显微镜和流式细胞术(FCM)检测EGFP的表达,Western blot鉴定CXCR4蛋白表达.结果表明,成功克隆小鼠CXCR4基因,构建重组慢病毒转移质粒LV-IRES-EGFP-CXCR4及对照质粒LV-IRES-EGFP,三质粒系统共转染293Fr细胞后获得病毒滴度可达到108 TU/ml.以重组慢病毒颗粒感染293FT细胞后第3天,在荧光显微镜下观察到较强绿色荧光表达,FCM检测显示感染效率可达95％,FCM及Western blot结果显示感染后293FT细胞表达CXCR4蛋白.结论:成功构建自身失活型慢病毒载体LV-IRES-EGFP-CXCR4,并在真核细胞中获得表达.
关键词： CXC型趋化因子受体4 慢病毒载体 基因表达 293FT细胞 -
表达红色荧光蛋白的小鼠淋巴瘤EL4细胞株的建立及鉴定
本研究通过慢病毒载体将红色荧光蛋白(DsRed)导入小鼠淋巴瘤EIA细胞,建立稳定高表达DsRed的EL4/DsRed细胞株,为建立携带红色荧光标记的小鼠肿瘤模型奠定基础.构建含新霉素耐药基因(neo)、内部核糖体进入位点序列(IRES)及DsRed的双顺反子自身失活型慢病毒载体.采用脂质体转染法将慢病毒三质粒包装系统共转染人胚肾细胞系293FT包装细胞,收集病毒上清,感染EL4细胞;利用G418的药物选择特性筛选感染细胞获得稳定表达DsRed的EL4细胞株,并扩大培养.结果表明:成功构建慢病毒表达质粒pXZ208-neo-IRES-DsRed,包装的重组慢病毒滴度可达106U/ml.病毒感染EL4细胞,经终浓度为600μg/ml的G418成功筛选出稳定携带DsRexi的EL4/DsRed细胞株;荧光显微镜观察及流式细胞仪检测证实该细胞株长期稳定高表达DsRed.结论:通过表达DsRed的慢病毒载体感染EL4细胞,获得了稳定高表达DsRed的EL4/DsRed细胞株.
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双自杀基因慢病毒转移载体系统的构建及其对K562细胞的杀伤作用
为了探讨双自杀基因慢病毒转移载体系统对K562细胞的杀伤作用,采用分子生物学方法构建了含大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(E.coli CD)和单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)的双自杀基因慢病毒转移载体,将慢病毒基因转移系统中的3种成分质粒(目的基因转移载体、包装结构及包膜结构质粒)用脂质体分为2组(实验组、对照组)共转染入病毒包装细胞293T,在荧光显微镜下观察转染效果,在透射电镜下观察上清中的病毒颗粒.大量收集病毒上清,浓缩后感染K562细胞,荧光显微镜下观察感染效果,RT-PCR鉴定目的基因在K562细胞中的整合转录.给予前体药物5-氟胞嘧啶(5-FC)和(或)无环鸟苷(GCV)后,用MTT法测定体外杀伤效应,扫描电镜下观察使用前体药物后K562细胞的变化.结果表明:成功构建了双自杀基因慢病毒转移载体,脂质体法可有效将上述慢病毒表达质粒转入293T细胞.荧光显微镜下观察到对照组大量绿色荧光蛋白(green fluorescenceprotein,GFP)表达.透射电镜下观察到大量浓缩后病毒颗粒.荧光显微镜下观察到此基因转移载体系统对293T细胞及K562细胞的感染率均很高,单独使用GCV或5-FC对转染自杀基因的K562细胞的生长抑制率(growth inhibition ration,GIR)分别为48.73%、50.16%,与未转染K562细胞比较明显升高,有显著性差异(P＜0.01),联合使用5-FC和GCV时K562细胞的GIR为87.69%,比单独使用5-FC或GCV时明显升高,有显著性差异(P＜0.01).结论:双自杀基因慢病毒基因转移载体系统可将双自杀基因高效转移至K562细胞,是一种有效的基因转移载体系统.
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CD40 RNA干扰小鼠树突状细胞抑制异系T淋巴细胞增殖的研究
目的 构建针对小鼠CD40基因的RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒载体,制备低表达CD40的树突状细胞(dendritic cells,DC),探讨其阻断CD40/CD40L共刺激通路诱导异系T淋巴细胞无反应的作用机制.方法 采用培养基选择法体外培养小鼠骨髓源DC,构建针对小鼠CD40 RNAi慢病毒载体,体外感染小鼠骨髓源DC.荧光实时定量PCR及流式细胞术检测感染前后CD40 mRNA及DC表面抗原CD40表达.混合淋巴细胞培养观察CD40 RNAi慢病毒感染DC对异系T淋巴细胞增殖能力的影响.结果 体外培养可获得成熟的小鼠骨髓源DC.成功构建小鼠CD40RNAi慢病毒载体,检测滴度为8×10~9 TU/ml.慢病毒感染DC后与感染前相比,明显抑制CD40mRNA的表达(P<0.05),CD40蛋白表达也明显减少(P<0.05).混合淋巴细胞培养结果显示,CD40RNAi慢病毒感染DC组(1.381±0.442)与未感染组(2.444±0.485)及空慢病毒感染DC组(2.294±0.367)相比,淋巴细胞刺激指数(SI)明显下降(P<0.01).结论 培养基选择法可收获大量骨髓源DC,所获骨髓源DC能激活初始型T细胞免疫应答.CD40 RNAi慢病毒感染小鼠骨髓源DC,可以使DC低表达CD40蛋白.CD40 RNAi慢病毒感染的DC体外刺激异系T淋巴细胞增殖的能力下降.为研究CD40 RNAi在同种器官移植诱导免疫耐受奠定基础.
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人乳头状瘤病毒18型E6蛋白的信号转导初探
目的 探讨人乳头状瘤病毒18型E6蛋白(HPV18E6)与信号转导和转录激活因子1(STAT1)、蛋白激酶R(PKR)/真核细胞翻译启始因子2α(eIF2α)、核因子-κBp65(NF-κBp65)、丝裂酶原激活的蛋白激酶(MAPK)/cJun氨基末端激酶(JNK)信号转导的关系以及可能的分子机制.方法 构建靶向HPV18E6癌基因及无关序列(NC序列)的短发夹结构RNA(shRNA)干扰序列的慢病毒载体(HPV18E6-RNAi-LV,NC-GFP-LV),转染宫颈癌HeLa细胞,在沉默HPV18E6癌基因表达的基础上,以RT-PCR、Western blot法分别在核酸、蛋白水平(包括磷酸化型)检测各组HPV18E6、STAT1、PKR、eIF2α、NF-κBp65、MAPK、JNK的表达,以transwell侵袭试验及MTT法检测各组HeLa细胞侵袭能力及对卡铂敏感性的差异.结果 HPV18E6癌基因的表达水平能影响NF-κBp65、PKR基因的核酸及蛋白表达水平,并影响磷酸化蛋白p-STAT1、p-PKR、p-eIF2α的磷酸化水平;HPV18E6-RNAi-LV转染组细胞侵袭抑制率及对卡铂的敏感程度明显高于其他组(P＜0.05或P＜0.01).结论 HPV18E6通过降低PKR表达,并使p-STAT1、p-PKR、p-eIF2α去磷酸化的方式抑制PKR/eIF2α信号传导通路激活,维持HeLa细胞增殖活性及侵袭能力,也可抑制凋亡.HPV18E6与MAPK/JNK信号转导关系尚不明确.
关键词： 人乳头状瘤病毒18型E6蛋白 慢病毒载体 信号转导 蛋白激酶R NF-κBp65 -
pXZ208/gfp-aktl慢病毒表达载体的构建
Akt是蛋白激酶B(PKB)家族成员,是P13K(phosphoinositide 3-kinase)下游激酶.Akt参与胞内许多重要生理过程,包括细胞周期调节、细胞存活、细胞生长、糖原代谢及细胞迁移等[1].Akt具有促心肌存活作用,成为目前治疗心肌缺血研究的热点.本研究首次将 gfp-akt1融合基因克隆入pXZ208慢病毒载体,包装含GFP-Akt1的病毒感染心肌细胞,为揭示Akt促心肌存活的重要意义,以及心肌缺血治疗、缺血性心脏病基因治疗提供关键的实验手段.
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大鼠CD86基因RNAi慢病毒载体的构建与功能鉴定
目的 构建大鼠CD86基因的RNAi慢病毒载体并在大鼠原代培养树突状细胞(DC)上鉴定其基因沉默效率.方法 将筛选获得的大鼠CD86基因特异性siRNA靶点,合成短发卡结构shRNA序列并退火成双链DNA,与pgC-GFP慢病毒载体重组形成shRNA表达载体,利用PCR和测序鉴定获得连接正确的克隆.经由293T细胞包装shRNA慢病毒颗粒,随后将其感染原代培养的大鼠Dc细胞,采用real-time PCR和Western blot的方法检测靶基因在mRNA和蛋白水平的沉默效率.结果 构建的慢病毒载体shRNA的PcR鉴定和测序正确,shRNA慢病毒颗粒感染大鼠DC细胞后CD86基因的mRNA表达量较阴性对照载体慢病毒感染组下降了90.6%;蛋白表达显著抑制.结论 成功构建了大鼠CD86基因的shRNA慢病毒表达载体,能够在大鼠DC细胞上有效沉默靶基因.
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miR-34a调控Notch-1/NF-κB信号通路对脓毒症小鼠脑功能的保护作用
目的 观察脓毒症小鼠脑组织TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10及其Notch-1、NF-κBmRNA及其蛋白表达的动态变化,通过构建miR-34a过表达慢病毒载体及包装,并进行鞘内注射,研究其调控Notch-1/NF-κB信号通路对脓毒症小鼠脑组织各指标的影响.方法 将清洁级小鼠54只随机(随机数字法)分为假手术组(sham组,n=9,仅行腹腔开关术),模型组(CLP组,n=15,采用盲肠结扎穿孔模型),阴性对照组[NC组,n=15,鞘内注射阴性对照慢病毒(滴度为5×108 TU/mL)5μL/d,共3d,第7天行CLP术],干预组[n=15,鞘内注射miR-34a慢病毒(滴度为5×108 TU/mL)5μL共3d,第7天行CLP术],各组小鼠均于术后24h,麻醉后处死,留取脑组织标本.观察小鼠行为学变化,术后24 h进行神经功能评分;用EHSA法分别测定脑组织TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的水平;用实时荧光定量-PCR(real-time fluorogenic quantitative-PCR)法测定脑组织Notch-1、NF-κB mRNA表达;用Western Blot法测定脑组织Notch-1、NF-κB蛋白表达;并观察脑组织病理学改变.结果 与sham组比较,CLP组在术后24h点神经功能评分、TNF-α、IL-6水平、NF-κB mRNA及其蛋白表达(P＜0.01)、IL-1β显著升高(P＜0.05),IL-10水平、Notch-1 mRNA及其蛋白表达显著下降(P＜0.01),NC组在术后24h点神经功能评分、TNF-α、IL-1β水平、NF-κB蛋白表达(P＜0.01)、IL-6水平显著升高(P＜0.05),IL-10水平、Notch-1 mRNA及其蛋白表达显著下降(P＜0.01),NF-κB mRNA表达差异无统计学意义(P＞0.05);与CLP组比较,干预组在术后24h点TNF-α水平(P＜0.01)、NF-κB mRNA(P＜0.05)及其蛋白表达(P＜0.01)显著下降,神经功能评分、IL-1β、IL-6水平差异无统计学意义(P＞0.05),IL-10、Notch-1 mRNA(P＜0.05)及其蛋白表达(P＜0.01)显著升高,NC组各指标差异均无统计学意义(P＞0.05).光镜下见CLP术后24h脑组织损伤,干预组脑损伤有所减轻.结论 miR-34a调控Notch-1/NF-κB信号通路对脓毒症小鼠脑功能有一定保护作用.
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绿色荧光蛋白标记的大鼠神经干细胞移植于损伤脊髓后的迁移和存活
目的 观察神经干细胞在体内的迁移和存活.方法 体外培养胎鼠脊髓神经干细胞,用表达绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒载体进行转染,以乙交酯-丙交酯共聚物(PLGA)为支架移植入大鼠T9半横断脊髓损伤处.移植后1个月在荧光显微镜下观察神经干细胞在脊髓内的迁移,并计算其存活率.结果 神经干细胞表达强烈的绿色荧光.细胞移植后1个月,在损伤脊髓的头端和尾端都可见GFP阳性细胞,计算出的存活率为(1.4911±0.0313)%.结论 GFP标记的神经干细胞移植入大鼠损伤脊髓后向脊髓组织内迁移并有少数存活.
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腺相关病毒及慢病毒载体对骨髓间充质干细胞基因转染效率的比较
目的：比较腺相关病毒(AAV)载体和慢病毒(LV)载体在间充质干细胞(MSCs)基因转染中的效率。方法密度梯度离心法分离培养MSCs， HE染色、Nestin免疫荧光染色鉴定， BrdU标记观察增殖情况。分别包装AAV与LV假病毒颗粒，并感染MSCs，通过β-gal染色和绿色荧光蛋白检测，分别计算两者的转染效率。结果 MSCs成功从骨髓分离。AAV载体介导的基因转染率为49.1%，LV载体的转染率为91.4%(P<0.01)。结论 LV载体介导的基因转染方法转染效率更高。
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β-arrestin2抗基因RNA慢病毒载体体外基因沉默效应研究
目的:探讨β-arrestin2抗基因RNA慢病毒载体在体外工具细胞中的基因沉默效应及其携带的用于活体核磁共振成像监测的铁蛋白报告基因的表达.方法:用构建的β-arrestin2抗基因RNA慢病毒感染NG108-15细胞,实时荧光定量PCR和Western Blot方法检测β-arrestin2抗基因RNA慢病毒对工具细胞的β-arrestin2 mRNA和蛋白表达的下调作用,以及该病毒所携带的用于活体核磁共振成像监测的铁蛋白报告基因的表达.结果:构建的β-arrestin2抗基因RNA慢病毒能显著降低工具细胞中β-arrestin2 mRNA和蛋白的表达,与对照组相比实时荧光定量PCR和Western Blot方法检测的沉默效率分别为79%和82%(P<0.05).感染病毒组的NG108-15细胞的铁蛋白表达量显著升高,是对照组细胞的2.29倍(P<0.05).结论:构建的β-arrestin2抗基因RNA慢病毒在工具细胞中对β-arrestin2基因具有显著的沉默效应,该病毒携带的铁蛋白报告基因在工具细胞中表达.成功验证了β-arrestin2抗基因RNA慢病毒在体外的基因沉默效应和铁蛋白报告基因的表达,为该病毒的在体研究奠定了基础.
关键词： 基因沉默 抗基因RNA β-arrestin2 慢病毒载体 铁蛋白 -
慢病毒载体用于转基因技术的研究进展
慢病毒载体作为目前研究多的外源性转基因载体之一，已成为一种高效率的转基因和基因治疗工具。该载体大的优势是能够感染分裂和静止状态下的细胞，并且能够高效、稳定地整合于宿主细胞内。目前研究该载体在多种动物转基因技术方面的应用，有助于我们利用除了大鼠和小鼠以外的多种实验动物来研究基因的功能，并实现通过调节基因表达治疗人类疾病的目的。
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Plenti6.3/V5-TERT慢病毒载体的构建并成功建立永生化大鼠骨髓间充质干细胞系的研究
目的 为实现慢病毒感染后可用抗生素筛选TERT基因稳定整合的骨髓间充质干细胞,首先对pCI-neo-TERT质粒进行了改造和构建.方法 将pCI-neo-TERT酶切后得到TERT片段,并进行PCR扩增,将得到的TERT片段连入Plenti6.3/V5,酶切鉴定载体构建正确后,将改造和构建载体分别与辅助质粒psPAX2、pMD2.G共转染HEK-293T包装细胞,收获病毒上清并感染靶细胞,使用相应抗生素筛选细胞,验证抗性基因的插入.结果 成功构建了重组慢病毒载体Plenti6.3/V5-TERT,通过调整病毒上清的用量可以使靶细胞达到很高的感染效率;用相应抗生素筛选细胞证明了抗性基因的表达.结论 我们成功构建了慢病毒载体Plenti6.3/V5-DEST-TERT,从而使病毒感染后用抗生素筛选稳定整合TERT的骨髓间充质干细胞成为可能.
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人EZH2基因编码区及3′非翻译区融合蛋白重组慢病毒表达载体构建及其在293T细胞中的表达
目的 构建携带人EZH2基因编码区(coding region,CDS)及3′非翻译区(3′untranslated region,3′UTR)融合红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)重组慢病毒表达载体,使mCherry-EZH2融合蛋白在293T细胞中稳定表达.方法 运用In-Fusion定向克隆技术构建人EZH2基因CDS区及3′UTR融合蛋白重组慢病毒表达载体,测序无误后抽提质粒,转染293T细胞,包装病毒,测定病毒滴度.Western blot检测mCherry-EZH2的表达.结果 测序证实重组慢病毒表达载体基因序列完全正确;病毒颗粒包装成功,滴度为1.59×109 IU/ml;Western blot检测293T细胞中可以表达mCherry-EZH2融合蛋白.结论 成功构建人EZH2基因CDS区及3′UTR融合蛋白重组慢病毒表达载体及病毒,其mCherry-EZH2可以在293T细胞中稳定表达.为进一步分析可能调控EZH2基因CDS区及3′UTR表达的miRNA奠定前期实验基础.
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视锥视杆细胞同源盒基因的慢病毒载体的构建
目的 构建视紫红质启动子(rhodopsin,Rho)驱动的、大鼠视锥视杆细胞同源盒基因(cone-rod homeobox gene,CRX)为目的基因的重组慢病毒载体LV-Rho-EGFP/CRX,研究其在体外的转染效率.方法 用PCR法扩增质粒pEGFP-C3/CRX中的EGFP/CRX基因片段,取代慢病毒载体LV-Rho-EGFP中的EGFP片段,构建表达载体LV-Rho-EGFP/CRX,经酶切和双向测序验证.用磷酸钙沉淀法四质粒共转染293T细胞,包装、收集病毒,利用有限稀释法测定病毒滴度.用慢病毒原液感染光感受器细胞来源的人视网膜母细胞瘤细胞株HXO-RB44,观察感染情况.结果 成功构建慢病毒表达载体LV-Rho-EGFP/CRX,产生的慢病毒滴度为2×104 IU/ml,感染48h后,HXO-RB44细胞内可见强弱不等的绿色荧光.结论 重组载体LV-Rho-EGFP/CRX产生的慢病毒能感染光感受器细胞来源的HXO-RB44细胞,但还需提高转染的效率和滴度.
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小鼠单核巨噬细胞Ufm1基因shRNA慢病毒载体构建及鉴定
目的 构建小鼠Ufm1基因RNA干扰慢病毒载体,并实现该基因在小鼠单核巨噬细胞系(RAW264.7)中的稳定表达抑制.方法 根据小鼠Ufm1基因设计两条RNA干扰序列,合成靶序列双链DNA,与pFU-GW-RNAi载体连接,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.pFU-GW-RNAi载体、pHelper 1.0载体及pHelper 2.0载体共转染293T细胞包装产生慢病毒颗粒,并测定其滴度,随后感染RAW264.7细胞,建立稳定转染细胞株.将RAW264.7细胞分为空白组、阴性对照组及RNA干扰慢病毒感染组,用Real-time PCR检测Ufm1基因mRNA的表达量.结果 PCR扩增检测阳性菌落和测序证实,shRNA片段完全正确插入慢病毒载体pFU-GW-RNAi中.在荧光显微镜下观察可见,293T细胞呈绿色荧光,并测得病毒滴度为9×105 TU/μl.重组慢病毒感染RAW264.7后,用Real-time PCR检测到Ufm1基因mRNA的表达受到抑制.结论 成功构建了小鼠RNA干扰慢病毒载体,并能够在RAW264.7细胞中有效沉默靶基因.
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siRNA靶向干扰GPC3基因慢病毒载体的构建及其对肝癌Huh-7细胞凋亡的影响
目的：构建GPC3基因短发夹干扰RNA（shRNA）慢病毒载体，观察GPC3基因对人肝癌细胞系Huh-7凋亡的影响，探讨GPC3基因影响肝癌细胞生长的机制，为肝癌的基因治疗提供理论基础。方法采用RNA干扰技术转染肝癌细胞系Huh-7，荧光定量 PCR检测GPC3基因在多种肝癌细胞株中的表达情况。构建重组靶向GPC3基因的小干扰RNA序列PGC-shRNA-GPC3，以脂质体（lipofectamineTM2000）为载体转染人肝癌细胞系，筛选并建立稳定表达 siRNA的细胞株。采用RT-PCR及Western blot检测GPC3 siRNA转染后mRNA表达情况，验证siRNA的干扰效率。流式细胞仪检测阴性对照组、未转染组和转染组细胞凋亡的情况。结果在肝癌细胞株Huh-7中， GPC3基因显示高表达。测序验证 PGC-shRNA-GPC3重组质粒构建成功。将重组质粒稳定转染入肝癌细胞株Huh-7后能明显抑制GPC3 mRNA表达水平；同时，流式细胞仪检测发现，GPC3表达下调后，诱导Huh7细胞的凋亡。结论靶向GPC3的siRNA能有效抑制GPC3的表达，并能促进肝癌Huh7细胞凋亡。
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CLRs过表达/siRNA慢病毒载体的构建及其瞬时转染树突状细胞的研究
目的：构建C型凝集素受体（C-type lectin receptor，CLRs）过表达/siRNA慢病毒载体，并将其瞬时转染树突状细胞（dendritic cell，DC）。方法免疫磁珠分离、培养及鉴定胎盘和蜕膜来源的DC；构建CLRs过表达/siRNA慢病毒载体并转染DC；抽提转染CLRs过表达/siRNA慢病毒后的DC的总RNA；RT-PCR检测DC转染慢病毒前后CLRs基因mRNA表达量。结果从胎盘分别纯化得到的DC经流式细胞术检测DC纯度为（82.6±2.4）%；根据Genebank数据库成功构建了过表达CLRs基因慢病毒及CLRs基因siRNA慢病毒，病毒量为1×1010 Unit；将构建的两种慢病毒转染DC后，在荧光倒置显微镜下可观察到被转染的阳性细胞有绿色荧光蛋白（GTP）表达，通过流式细胞仪检测，转染效率分别为85%及82%左右；RT-PCR检测发现过表达CLRs基因慢病毒转染DC后mRNA相对含量为（14.26±0.47）%，较空白未转染的DC表达量[（1.67±0.19）%]明显上升（P＜0.01）；CLRs基因siRNA慢病毒转染DC后CLRs mRNA相对含量为（0.03±0.01）%，较空白未转染的 DC 表达量明显下降（P＜0.01）。结论成功构建了表达人CLRs-siRNA的慢病毒载体，它能有效沉默CLRs基因在胎盘DC中的表达并获得了其瞬时转染的DC；成功构建了过表达CLRs的慢病毒载体，它能有效地在体内发挥基因过表达效应并获得了其瞬时转染的DC。
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HBx蛋白及其羧基末端缺失35个氨基酸的突变体对正常肝细胞增殖的影响
目的 构建野生型HBx(wild-type HBx, wt-HBx)和自然突变体HBx(truncated HBx, tHBx△35)重组慢病毒表达载体,建立稳定转染细胞株,观察wt-HBx和tHBx△35对肝细胞增殖和凋亡的影响.方法 构建TOPO3.1- wt-HBx和TOPO3.1-tHBx△35重组慢病毒载体;与3个质粒包装系统用磷酸钙方法 共同转染到人293T细胞,包装成病毒颗粒,分别感染肝细胞L02和MIHA,并进行荧光和Western blot法检验细胞中wt-HBx和tHBx△35的表达情况.用细胞计数,细胞活力测定,集落形成实验,流式细胞仪等方法 检测对肝细胞增殖和凋亡效应的影响.结果 重组慢病毒载体及稳定转染细胞株构建成功,转染后wt-HBx和tHBx△35在细胞中表达明显变化; tHBx△35过表达细胞的增殖速度明显高于wt-HBx组和CTRL对照组,而感染wt-HBx组的肝细胞增殖速度比CTRL对照组和tHBx△35组增殖速度慢 (P＜0.05); tHBx△35可能通过促进细胞S期的合成而刺激细胞增殖,而wt-HBx可能通过捕获细胞的GO/G1期而抑制细胞增殖.但tHBx△35, wt-HBx在肝细胞的凋亡率是很低的.结论 HBx对肝细胞具有抑制增殖的作用,而tHBx△35对肝细胞具有促进增殖的作用.
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Cdx2基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定
目的:构建尾型同源盒基因Cdx2 RNA干扰(RNAi)慢病毒表达栽体并进行鉴定.方法:选取Cdx2基因的19 nt特异性序列,设计针对Cdx2的shRNA序列,应用基因重组技术插入到pLentiLox3.7(pLL3.7)慢病毒表达栽体中,Xba Ⅰ和Not Ⅰ进行双酶切和DNA测序鉴定重组克隆,重组病毒质粒及其3种辅助包装原件载体质粒通过LipofectamineTM2000共转染293T细胞,培养48 h后,收集细胞培养上清液,将其浓缩后在293T细胞中测定病毒滴度.结果:通过对pLL-Cdx2-shRNA载体进行双酶切鉴定,证实短发夹RNA正确插入慢病毒载体,DNA测序证实插入的序列正确,Cdx2基因RNA干扰重组慢病毒载体经293T细胞包装成功,收集293T细胞分泌的病毒上清测定病毒的滴度为5×107TU/mL.结论:成功构建A.Cdx2基因RNAi慢病毒栽体,为研究Cdx2对胃癌生长的影响提供了稳定感染细胞载体.
