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慢病毒载体介导survivin小分子干扰核糖核酸对裸鼠肺癌移植瘤的影响
目的 观察慢病毒载体介导的survivin小分子干扰核糖核酸(small interfering RNA,siRNA)能否在裸鼠体内抑制肺癌移植瘤的生长.方法 裸鼠随机分为3组,分别将A549细胞、无关序列及survivin siRNA慢病毒载体感染A549细胞接种于裸鼠右侧背部近腋窝皮下,观察survivin siRNA对移植瘤生长的影响.采用逆转录酶聚合酶链反应和Western blotting测定移植瘤组织survivin基因及其蛋白表达.结果 成功建立人肺癌裸鼠皮下移植瘤模型.survivin siRNA组移植瘤体积及质量明显低于其他2组(P<0.01),抑瘤率为63.6%(基于体积)或58.8%(基于质量),survivin mRNA和蛋白表达分别减少53.7%、57.6%.结论 慢病毒载体介导survivin siRNA可明显下调裸鼠体内survivin基因表达,抑制肺癌移植瘤的生长.
关键词： 小分子干扰核糖核酸 凋亡抑制蛋白家族成员 慢病毒载体 A549细胞 裸鼠 -
高效的红细胞特异性表达系统的建立和优化
目的 探讨慢病毒载体中红细胞特异性基因调控元件的优化对小鼠红白血病(murine erythroleukemia,MEL)细胞向红系终端分化期间组织特异性表达重组蛋白的影响.方法 改变红细胞特异性β-珠蛋白启动子编码长度、改变β-珠蛋白基因位点控制区DNase Ⅰ高敏位点(hypersensitive site,HS)的组合、删除β-珠蛋白3′端增强子或β-珠蛋白内含子IVS2,由此构建一系列由不同缺失组合的基因调控元件控制目的 基因(如人凝血因子Ⅸ)表达的慢病毒载体,包装成重组慢病毒,测定病毒滴度,并分别感染小鼠MEL细胞.用O6-苄基鸟嘌呤(O6-benzylguanine,BG)-卡莫司汀[1,3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea,BCNU]联合筛选以富集感染的阳性细胞,用酶联免疫吸附测定方法检测目的 基因的表达,评估不同基因调控元件组合对重组慢病毒载体所携带的目的 基因表达的影响.结果 经限制性内切酶谱分析和序列测定,构建的慢病毒载体结构正确;三质粒系统瞬时转染人肾胚胎293T细胞包装的重组自灭活慢病毒可通过长时间高速离心有效浓缩;用50 μmol/L BG-50 μmol/L BCNU联合筛选可有效富集感染的阳性细胞;经环六亚甲基双乙酰胺(N,N′-hexamethylenebisacetamide,HMBA)诱导第8天的106个小鼠MEL细胞中表达的重组人凝血因子Ⅸ平均质量浓度达到正常水平的3.8%(191 ng/ml).结论 通过适当减少调控元件优化慢病毒载体不仅有助于提高携带的外源基因片段长度、增加载体制备的有效性、实现温和提高目的 基因产物达到治疗水平需求量的目的,而且为开展以红细胞特异性表达载体介导的携带蛋白类药物的红细胞治疗以及非血液病基因治疗奠定临床前的研究基础.
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CCDC67基因慢病毒表达载体的构建及鉴定
目的 构建CCDC67基因慢病毒表达载体,为后续转染目的细胞奠定基础,并实现在细胞中高效、稳定表达.方法 从含有CCDC67基因的cDNA文库中,利用PCR方法钓取CCDC67基因编码区片段.将目的基因与酶切载体pGV-208进行定向连接,其产物转化细菌感受态细胞.对长出的克隆先进行菌落PCR鉴定,再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析,对比正确的克隆即为构建成功的目的质粒.将构建成功的目的质粒和两种辅助包装质粒共转染293T细胞,包装成慢病毒,在荧光显微镜下观察慢病毒转染293T细胞后荧光表达情况.采用Western blot检测CCDC67及绿色荧光蛋白融合蛋白表达情况.结果 PCR产物经电泳分析表明成功获取CCDC67基因cDNA克隆,测序结果显示慢病毒转染质粒连接构建正确.荧光表达检测显示293T细胞中产生慢病毒颗粒,Western blot显示CCDC67在细胞内稳定表达.结论 成功构建CCDC67基因慢病毒表达载体,为后续转染目的细胞后从分子水平探讨CCDC67基因功能奠定了实验基础.
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放射敏感性启动子调控CD基因/5-FC自杀系统慢病毒载体的构建及125I诱导表达的研究
合成了含8个CArG元件的放射敏感性启动子E8,将其连接于胞嘧啶脱氨酶(Cytosine Deaminase,CD)基因及GFP报告基因上游,构建了重组慢病毒载体pGC-FU- E8 codA- GFP.与慢病毒包装系统共转染293T细胞包装重组慢病毒颗粒E8 -coda- GFP LV,研究重组慢病毒感染EJ细胞在不同剂量125I的电离辐射下绿色荧光表达情况及其将5 -FC转化为5- FU的能力.结果显示:构建的含有E8启动子及CD基因的重组慢病毒载体,包装的重组慢病毒滴度为2×108 TU/mL；经125I照射的重组慢病毒感染EJ细胞均可观察到绿色荧光,其细胞上清液均可检测到5- FC转化成的5- FU紫外峰,其中55.5 kBq及74.0 kBq 125I照射的细胞组绿色荧光明显,148 kBq125I照射的细胞组,其5 -FU紫外峰为明显.以上结果表明:本工作所构建的放射敏感性启动子调控CD 基因/5 -FC自杀系统重组慢病毒载体具有电离辐射调控作用,可在125I的电离辐射作用下诱导下游基因表达,为放射性核素125I联合CD基因/5 -FC自杀系统对肿瘤细胞的治疗作用研究提供了实验基础.
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慢病毒载体介导SPROUTY2基因过表达对多发性骨髓瘤RPMI8226细胞增殖作用的影响
目的 探讨慢病毒表达载体介导的人SPROUTY2基因过表达对多发性骨髓瘤RPMI8226细胞增殖、克隆性生长和细胞外调节蛋白激酶(ERK)抑制剂敏感性等生物学特性的影响.方法 克隆人SPROUTY2基因,构建SPROUTY2基因与绿色荧光蛋白(GFP)的重组慢病毒表达载体LV-S-GFP及对照载体LV-GFP.脂质体法包装病毒;优化慢病毒感染RPMI8226细胞的条件;荧光显微镜观察GFP表达;反转录聚合酶链反应(PCR)、蛋白质印迹法(Western blot)方法分别检测目的基因及其蛋白的表达,CCK-8法检测RPMI8226细胞增殖及其对ERK 1 /2抑制剂AS703026敏感性的影响,软琼脂克隆形成实验检测细胞的克隆性生长能力.结果 成功地构建了共表达SPROUTY2基因和报告GFP的高滴度慢病毒颗粒.LV-S-GFP实验组RPMI8226细胞中SPROUTY2的表达明显高于LV-GFP对照组,灰度值分别为(230.85±32.12)％和(140.35±36.62)％(P＜ 0.05).过表达SPROUTY2基因对骨髓瘤细胞增殖具有抑制作用,并可以增强ERK1/2抑制剂AS703026对RPMI8226细胞的杀伤作用.过表达SPROUTY2基因可明显抑制RPMI8226细胞的克隆性生长.结论 慢病毒载体系统可高效介导SPROUTY2基因在RPMI8226细胞中的表达,抑制骨髓瘤细胞增殖及克隆性生长,并能够提高其对ERK抑制剂的敏感性.
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慢病毒载体及其对低分裂潜能细胞的基因转移
基因转移方法为基因治疗的关键.目前,在动物及人体试验中应用广的病毒载体是来源于致瘤型反转录病毒为代表的简单的反转录病毒载体(RV),但该类载体不能有效地转染低分裂潜能细胞如终末分化的神经细胞、造血干细胞(HSC)、视网膜细胞、肝脏细胞、胰岛细胞等.
关键词： 慢病毒载体 基因治疗 人类免疫缺陷病理Ⅰ型 -
HSV1-TK、HSV1-SR39TK及GCV、ACV对小鼠T淋巴细胞的杀伤作用研究
目的 观察慢病毒载体携带的单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV1-TK)和突变型单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV1-SR39TK)基因在小鼠T淋巴细胞的表达及前体药物丙氧鸟苷(GCV)、无环鸟苷(ACV)对小鼠T淋巴细胞的杀伤效应.方法 用亚克隆技术将PCR扩增的HSV1-TK、HSV1-SR39TK基因分别连接至慢病毒载体,在TK、SR39TK基因后以内部核糖体进入位点(IRES)连接绿色荧光蛋白(GFP)基因,采用三质粒包装系统包装病毒,将病毒感染刀豆蛋白A激活的小鼠T淋巴细胞,然后通过CCK-8方法观察其对前体药物GCV、ACV的敏感性.结果 慢病毒载体携带的HSV1-TK及HSV1-SR39TK基因均可在小鼠T淋巴细胞内高效表达,GCV和ACV对转导TK基因的淋巴细胞均有杀伤作用,含突变型TK基因的淋巴细胞对前体药物敏感性更高,后者对GCV的IC50值比野生型小2.5倍,对ACV的IC50值比野生型小17.4倍.结论 表达HSV1-SR39TK基因的T细胞对GCV有更高的敏感性,对ACV也较敏感,应用HSV1-SR39TK基因进行防治GVHD的研究是更好的选择.
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SREBP-1c基因过表达细胞模型的构建及对HepG2细胞脂滴含量的影响
目的:构建SREBP-1c过表达HepG2细胞模型并观察其对脂滴含量的影响,为进一步深入研究肝癌脂滴代谢异常机制提供细胞模型.方法:采用DNA重组技术,将SREBP-1c基因克隆至慢病毒表达载体pLenti 6.3/V5中,并用脂质体介导法将慢病毒包装系统和带目的基因的质粒pLenti6.3-SREBP-1c共转染293T细胞,收集上清,感染HepG2细胞.通过Real-time PCR和Western blot对细胞株进行鉴定.采用免疫荧光检测HepG2细胞中脂滴的数量、大小及细胞内甘油三酯的含量.结果:成功构建了过表达SREBP-1c基因的慢病毒载体pLenti6.3-SREBP-1c,转染后HepG2细胞中可见明显的SREBP-1c蛋白表达.Real-time PCR检测结果显示转染SREB P-1c基因的HepG2细胞中SREBP-1c mRNA水平较对照组升高了约11.4倍.Western blot结果显示SREBP-1c蛋白水平较对照组提高3.2倍.免疫荧光显示过表达SREBP-1c能够明显增加HepG2细胞内脂滴的数量和大小.细胞内甘油三酯定量结果显示甘油三酯含量较对照组明显升高(P＜0.01).结论:成功构建了,REBP-1c基因过表达的重组慢病毒载体及其稳定转染细胞株.高表达SREBP-1c的HepG2细胞增加了细胞中脂滴的数量、大小和甘油三酯的含量,可用于从脂滴代谢方面对肝癌发病分子机制的研究.
关键词： SREBP-1基因 慢病毒载体 人肝癌细胞HepG2 基因转染 脂滴 -
一种转导人原代肝细胞的LV-HBx诱导调控表达系统
目的:建立一种在人原代肝细胞中可诱导调控表达HBx的慢病毒表达系统,以便研究HBx生物学特性及其对人肝细胞功能的影响.方法:采用Tet-on系统构建四环素诱导调控的慢病毒-HBx表达系统,并用流式细胞术对其进行优化以达到较高的表达效率.应用该系统制备LV-HBx和LV-rtTA重组慢病毒共同转导肝癌细胞系HepG2和人原代肝细胞后,再加入强力霉素(Dox)诱导调控HBx表达,并采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测人原代肝细胞中肿瘤转移相关基因1(MTA1)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、转化生长因子β1(TGFB1)、上皮型钙黏附素1(CDH1)、胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP3)mRNA的表达水平.结果:重组慢病毒-HBx表达系统构建成功,LV-HBx和LV-rtTA重组慢病毒用量配比经过优化,采用1:1或2:1转导后可达到较高的表达效率,Dox诱导产生的表达HBx的阳性细胞率分别为67.3%和66.7%.应用该系统将HBx基因转导入肝癌细胞系HepG2和人原代肝细胞后,可用Dox进行诱导调控HBx的高效表达.其中人原代肝细胞中Dox诱导组的HBx表达水平约为对照组(不加Dox诱导)的45倍,经qPCR检测高表达HBx的人原代肝细胞中MTA1、VEGFA、TGFB1 mRNA的表达水平较对照组均显著升高(P均<0.05),而CDH1、IGFBP3 mRNA表达水平显著降低(P均<0.05).结论:成功建立了转导人原代肝细胞的LV-HBx四环素诱导调控表达系统,该系统的建立为研究HBx等乙肝病毒基因对人原代肝细胞的影响打下了基础.
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超声辐照联合双自杀基因慢病毒载体微泡对宫颈癌细胞的杀伤效应
目的:探讨超声辐照联合双自杀基因慢病毒载体微泡对宫颈癌细胞的体外杀伤效应,为宫颈癌的靶向基因治疗奠定基础.方法:构建双自杀基因慢病毒载体pLenti6-KDRP-CD/TK-EGFP,转染293T细胞并计算病毒滴度,与声诺维微泡混悬液混匀孵育,测定其包封率和载药量.运用载药微泡对宫颈癌HeLa细胞进行干预,试验设空白对照组、慢病毒组、慢病毒载体微泡组、慢病毒载体微泡联合超声辐照组,分别使用4种超声声强(0.25、0.5、1.0、2.0 W/cm2) 300 kHz,辐照30 s.应用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色实验和流式细胞仪检测各组干预方法对癌细胞增殖和凋亡率的影响.结果:荧光显微镜下可观察到EGFP的表达,说明载体构建成功,转染后获得病毒滴度为3.5×10”pfu/L,包封率为90.6％±3.1％,载药量为29.2％±0.9％.MTT检测发现与空白对照组比较,慢病毒组、慢病毒载体微泡组、不同超声声强+慢病毒载体微泡组对细胞增殖均有明显抑制作用(P＜0.05或P＜0.01),随着超声辐照声强的增加,癌细胞的抑制率逐步增高(P＜0.05),但2.0 W/cm2组与1.0 W/cm2组相比抑制率无明显差异(P＞0.05);各组抑制作用于24h后均有所下降(P均＜0.05),48 h组与24 h组比较抑制作用无明显变化(P＞0.05).通过流式细胞术检测发现与空白对照组比较,各干预处理组对HeLa细胞的凋亡作用均显著升高(P均＜0.05);运用超声辐照后,其凋亡率升高趋势更为显著(P＜0.01).结论:双自杀基因慢病毒载体对宫颈癌HeLa细胞具有显著的杀伤效应;联合超声辐照其载药微泡的杀伤效应可明显增强,具有协同作用.
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三氯乙烯对CYP1A2高表达肝细胞株凋亡基因和癌基因的影响
目的:构建CYP1A2基因高表达载体,转染到L02肝细胞,建立CYP1A2高表达细胞株并检测三氯乙烯对该细胞株凋亡基因和癌基因的影响.方法:根据GenBank提供的CYP1A2基因cDNA序列设计引物,PCR扩增该基因并将其克隆到慢病毒高表达载体pLVX-acGFP1-C1中,将已经构建的慢病毒载体对293FT细胞进行转染,收集病毒上清,感染正常L02肝细胞.用嘌呤霉素进行筛选得到CYP1A2高表达L02细胞株,通过荧光定量PCR和Western blot对细胞株进行鉴定.用不同剂量三氯乙烯对正常L02肝细胞和CYP1A2高表达细胞进行染毒12h,采用PCR方法检测凋亡基因(Bcl-2、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9)和癌基因(c-fos、c-myc、K-ras、p53)mRNA表达的变化.结果:测序证明重组慢病毒高表达载体CYP1A2基因序列与GenBank提供的CYP1A2序列一致,荧光定量PCR检测显示CYP1A2高表达细胞株CYP1A2 mRNA表达比正常L02肝细胞提高317倍,Western blot结果显示CYP1A2高表达细胞株CYP1A2蛋白表达水平比正常L02肝细胞高3.41倍.三氯乙烯染毒后,CYP1A2高表达细胞中凋亡基因Bcl-2 mRNA表达水平与正常肝细胞无显著性差异(P＞0.05),而Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9 mRNA表达水平高于正常肝细胞(P＜0.05或P＜0.01).CYP1A2高表达细胞中癌基因c-myc和p53 mRNA表达水平低于正常肝细胞(P＜0.05或P＜0.01),而c-fos和K-ras mRNA则高于正常肝细胞(P＜0.05或P＜0.01).结论:三氯乙烯对CYP1A2高表达细胞凋亡基因和癌基因表达有显著影响,提示CYP1A2是三氯乙烯在体内代谢的重要因素,与三氯乙烯毒性存在一定关系.
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慢病毒敲减质粒pLKO.1-hSRF的构建及鉴定
目的:构建敲减人血清反应因子SRF基因的慢病毒质粒,为进一步研究SRF在口腔鳞状细胞癌中的作用提供工具.方法:利用Therimo Fisher公司RNAi网站设计出针对SR基因特异性敲减的片段,然后通过对pLKO.1载体进行双酶切,胶回收纯化后,经T4连接酶将双酶切线性化载体与设计的目的片段进行连接,转化和质粒提取,采用双酶切以及测序的方法对重组质粒进行序列鉴定.利用293T细胞对构建正确的pLKO.1-hSRF质粒进行病毒包装后感染SAS口腔鳞癌细胞,经嘌呤霉素筛选获得稳定株,并通过Western blot和实时荧光定量PCR对稳定转染细胞株的敲减效率进行验证.结果:构建出的慢病毒敲减质粒pLKO.1-hSRF经测序和酶切鉴定均正确,感染该慢病毒质粒的SAS细胞后,其SRF蛋白表达量和mRNA水平与对照组相比均显著下降(P＜0.01).结论:慢病毒敲减质粒pLKO.1-hSRF构建成功,获得SRF低表达的SAS细胞株.
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可条件性诱导PLK1稳定敲降的食管癌细胞株的建立
目的：建立可条件性诱导PLK1-shRNA稳定表达的食管癌细胞株，为深入研究PLK1在食管癌发生发展中的作用及分子机制提供细胞模型。方法：合成PLK1-shRNA寡核苷酸，退火后连接到慢病毒表达载体pLKO-Tet-On并转化至感受态细胞Stbl3，利用菌落PCR和测序分析鉴定阳性重组子。用pLKO-shPLK1-Tet-On重组质粒和包装质粒共转染293T细胞，收集病毒上清，感染食管癌细胞KYSE510，利用嘌呤霉素筛选可诱导PLK1-shRNA稳定表达的细胞株。采用qRT-PCR和Western blot检测强力霉素(Dox)诱导PLK1-shRNA表达的效率。结果：菌落PCR和测序分析结果显示，pLKO-shPLK1-Tet-On重组质粒中PLK1-shRNA的序列及插入位点正确。包装、收获病毒并感染KYSE510细胞后，筛选获得了具有嘌呤霉素抗性的稳定细胞株KYSE510-shPLK1-Tet-On。qRT-PCR和Western blot的检测结果显示，0.1μg/mL Dox即可显著下调KYSE510-shPLK1-Tet-On细胞中PLK1的表达。结论：成功构建了诱导型PLK1-shRNA慢病毒表达载体，并筛选获得了可条件性诱导PLK1稳定敲降的食管癌细胞株，为进一步探讨PLK1异常表达与食管癌发生发展的关系提供了理想的细胞模型。
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CYP2E1基因过表达细胞株的建立及鉴定
目的：应用分子克隆技术，构建CYP2E1基因过表达载体，转染L02肝细胞，建立CYP2E1过表达细胞株并进行鉴定，为深入研究环境和职业毒物的毒作用机制提供模型细胞。方法：根据GenBank提供的基因cDNA序列设计引物，PCR扩增该基因并将其克隆到慢病毒过表达载体pLVX-acGFP1-C1中，将已经构建的慢病毒载体对293FT细胞进行转染，收集病毒上清，感染正常L02肝细胞。用嘌呤霉素进行筛选得到转染CYP2E1基因的L02细胞，通过基因测序、荧光定量PCR和Western blot对细胞株进行鉴定。结果：测序证明重组慢病毒过表达载体CYP2E1基因序列与GenBank提供的CYP2E1序列一致，荧光定量PCR检测转染CYP2E1基因的L02细胞比正常肝细胞CYP2E1 mRNA表达提高273倍，Western blot实验显示转染CYP2E1基因的L02细胞CYP2E1蛋白表达水平比正常肝细胞提高3.2倍。结论：成功构建了CYP2E1基因过表达细胞株，可应用于环境毒物和职业毒物的分子机制研究。CYP2E1
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慢病毒介导炭疽毒素受体1基因靶向沉默对γ珠蛋白基因表达的影响
目的 探讨沉默炭疽毒素受体1 (anthrax toxin receptor 1,ANTXR1)基因对γ珠蛋白基因表达的影响.方法 构建ANTXR1基因特异性序列的shRNA重组质粒及阴性对照重组质粒,经酶切验证及测序鉴定后,将干扰载体和慢病毒质粒共转染入293T细胞后收集病毒上清液,再将其转染至K562细胞中,并经puromycin筛选稳转细胞株.通过实时荧光定量PCR技术检测各组ANTXR1基因和γ珠蛋白基因mRNA的表达情况;通过Western蛋白印迹技术检测各组ANTXR1蛋白和γ珠蛋白的表达情况.采用t检验进行统计分析.结果 获得有效干扰ANTXR1基因的K562稳转细胞株,实时荧光定量PCR结果显示,ANTXR1-shRNA实验组中ATXR1基因和γ珠蛋白基因mRNA相对表达水平分别为0.19±0.02和1.46±0.24;Western蛋白印迹技术结果显示,蛋白相对表达水平分别为0.20±0.01和1.45±0.14.ANTXR1-shRNA实验组与阴性对照组、空质粒载体组和空白对照组相比,ANTXR1基因相对低表达,γ珠蛋白基因相对高表达,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 靶向沉默ANTXR1基因后,促进γ珠蛋白基因mRNA和蛋白水平的表达.
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人LIGHT基因重组慢病毒的构建以及在脐血间质干细胞中的表达
目的 构建带有人LIGHT基因的慢病毒载体,观察其在人脐血间质干细胞中的表达.方法 通过逆转录聚合酶链反应从PCD DNA-LIGHT质粒中获得人LIGHT基因,利用infusion技术重组构建慢病毒载体质粒pGC-FU-LIGHT,在脂质体lipofectamine 2000介导下与结构质粒pHelper1.0及包膜蛋白质粒pHelper2.0共转染293T细胞包装生产慢病毒.将人脐血间质干细胞分为实验组(pGC-FU-LIGHT)、空载体对照组(pGC-FU-EGFP)及空白组(脐血间质干细胞),分别用重组慢病毒、空载慢病毒、PBS感染后,采用RT-PCR以及Elisa检测LIGHT表达情况.结果 所获LIGHT基因经测序后与Gene Bank报道序列完全一致;重组慢病毒载体质粒pGC-FU-LIGHT经鉴定正确;三质粒共转染293T细胞成功,收集、浓缩病毒后测定其滴度为2×107TU/L,感染UCBMSCs后RT-PCR、Elisa检测各组细胞均有LIGHT的表达,其中试验组pGC-FU-LIGHT组更大量表达LIGHT,与其余2组(pGC-FU-EGFP、UCBMSCs)比较差异具有统计学意义.结论 成功构建带有LIGHT基因的慢病毒载体并实现在脐血间质干细胞中的表达,为间充质干细胞移植治疗胃癌的应用奠定了基础.
