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慢病毒载体介导RNA 干扰抑制Livin 对人大肠癌HT-29细胞生物学行为的影响
目的:探讨慢病毒载体介导RNA干扰(RNAi)抑制大肠癌细胞系HT-29细胞Livin基因表达对其生物学行为的影响.方法:设计、合成靶向Livin的siRNA,构建pGCSIL-GFP慢病毒载体,采用Real-time PCR和Western blot方法观察对人大肠癌HT-29细胞Livin mRNA及蛋白质表达的抑制;并通过台盼蓝拒染法、原位末端标记法(TUNEL)、流式细胞术及Matrigel穿膜侵袭实验检测细胞增殖、凋亡、细胞周期及细胞侵袭性的变化.结果:重组慢病毒Livin-RNAi-LV1能够有效抑制Livin的表达,使Livin mRNA和蛋白表达水平明显降低(P<0.01);Livin沉默能抑制HT-29细胞增殖(P<0.05),细胞凋亡增加(P<0.01),细胞周期重新分布,G0/Gl期细胞比例升高(P<0.05),S期细胞比例降低(P<0.05),G2/M期细胞比例降低(P<0.05).HT-29细胞体外侵袭能力也明显减弱(P<0.01).结论:利用慢病毒载体介导RNA干扰技术沉默Livin基因的表达可以抑制大肠癌HT-29细胞增殖,促进细胞凋亡,使细胞侵袭性减弱.
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人GRP94基因慢病毒载体构建及稳定表达GRP94蛋白的人宫颈癌HeLa细胞株筛选及鉴定
目的:构建人葡萄糖调节蛋白94(GRP94)基因慢病毒载体,筛选稳定表达GRP94蛋白的人宫颈癌细胞株,筛选GRP94结合蛋白,为探讨GRP94对宫颈癌的调控作用提供细胞模型.方法:采用RT-PCR法从HeLa细胞中扩增GRP94基因片段,连接到慢病毒载体pLVX-IRES-Puro中,获得重组载体.瞬时转染293T细胞,采用Western blot法检测GRP94蛋白表达量.pLVX-FLAG-GRP94重组质粒通过与包装质粒共转染293T细胞,获得重组慢病毒.以慢病毒感染HeLa细胞,筛选并鉴定稳定表达GRP94蛋白的细胞株.用稳定表达FLAG-GRP94的HeLa细胞株,银染后利用质谱筛选结合蛋白,并经免疫共沉淀验证.结果:重组慢病毒载体经双酶切和基因测序比对鉴定正确.HeLa细胞经慢病毒感染、药物筛选后获得的稳定表达株中GRP94蛋白表达量高于野生型HeLa细胞(P＜0.01).成功钓取出一种与肿瘤发生发展密切相关的SND1蛋白.结论:成功构建了GRP94基因慢病毒载体pLVx-FLAG-GRP94,并筛选出稳定表达GRP94蛋白的HeLa细胞株,为进一步明确肿瘤的发生、发展机制奠定了基础.
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Annexin A2的表达上调及其23位酪氨酸磷酸化促进乳腺癌细胞MCF-7的增殖和侵袭
目的:构建以慢病毒质粒pCDH为载体的人Annexin A2(Anxa2)基因及其不同活性状态的突变体的重组质粒,筛选并验证稳定表达目的基因的人乳腺癌细胞MCF-7,观察不同表达水平及不同的酪氨酸磷酸化状态下Anxa2对乳腺癌细胞MCF-7增殖及侵袭能力的影响.方法:以质粒pEGFP-N3-Anxa2为模板,利用PCR定点突变技术获得Anxa2基因的不同活性状态的突变体—pEGFP-N3-Anxa2Y23A和pEGFP-N3-Anxa2Y23D.以慢病毒质粒pCDH和pEGFP-N3-Anxa2及其突变体为模板,通过亚克隆技术获得重组质粒pCDH-EGFP-Anxa2WT、pCDH-EGFP-Anxa2Y23A及pCDH-EGFP-Anxa2Y23D.利用慢病毒感染获得稳定表达Anxa2及其突变体的MCF-7细胞.分别采用MTT和克隆形成、划痕和transwell法测定MCF-7的增殖、迁移和侵袭能力.结果:表达Anxa2-WT及Anxa2-Y23D蛋白的MCF-7细胞的增殖、迁移及侵袭能力明显提高.结论:Anxa2的表达上调及其23位酪氨酸的磷酸化促进乳腺癌细胞MCF-7的增殖及侵袭.
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血红素氧化酶1在ADSCs增殖、凋亡和成骨分化的作用
目的:探讨应用慢病毒介导血红素氧化酶1(HO-1)基因转染诱导脂肪来源基质干细胞(ADSCs)后对细胞增殖、凋亡和成骨分化的影响. 方法: 取健康10周龄SD大鼠双侧腹股沟脂肪,分离、培养ADSCs,观察第3代细胞形态并进行成骨和成脂分化研究,流式分析细胞表面标记物,确立分离细胞为ADSCs. 利用基因重组技术构建HO-1基因重组慢病毒载体,并以Poly-brene(8μg/mL)介导慢病毒转染ADSCs,倒置显微镜下观察转染细胞荧光表达优化转染复数,Western blot检测HO-1蛋白表达.设HO-1转染组(A组)、空载体转染组(B组)和未转染组(C组);MTT,流式分析和茜素红钙结节染色分别检测各组增殖、凋亡和成骨分化情况. 结果: 分离获得的ADSCs具有多向分化潜能:CD29(+)、CD44(+)、CD90(+)、CD31(-)、CD45(-);经菌液PCR和Western blot鉴定HO-1基因重组慢病毒载体构建成功,与B、C组相比,A组具有较高的细胞活性(P<0.05),无血清培养基中较低的凋亡率(P<0.05),并增加细胞钙化基质形成的量(P<0.05). 结论:成功构建HO-1基因重组慢病毒表达载体并转染大鼠ADSCs,HO-1基因转染入ADSCs后表达HO-1蛋白成功,HO-1转染后可以发挥对ADSCs促增殖、 抗凋亡和促成骨分化的作用.
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慢病毒载体介导的RNAi双敲除ABCG2和UGT1A1的Caco-2细胞模型
目的:构建以Caco-2细胞为研究对象,由慢病毒载体介导ABCG2和UGT1A1基因RNAi干扰的肠道药物吸收和代谢模型.方法:应用慢病毒载体介导的RNAi技术敲除Caco-2细胞的ABCG2和UGT1A1基因,构建双RNAi干扰ABCG2和UGT1A1的Caco-2细胞系.应用RT-PCR,Real-time PCR,Western blotting等方法检测ABCG2和UGT1A1在mRNA及蛋白水平的表达.然后选择干扰高表达细胞株,连续传代监测干扰相应干扰基因的表达变化.结果:成功构建了慢病毒载体介导的RNAi双干扰Caco-2细胞模型,慢病毒ABCG2和UGT1A1单基因干扰效率分别为75％和88％；分组先RNAiABCG2后RNAiUGT1A1的双基因RNAi干扰效率分别为72.3％和85.7％；分组先RNAi UGT1A1后RNAi ABCG2的双基因干扰效率分别为69.7％和88.7％; ABCG2与UGT1A1基因的RNAi干扰先后顺序与终双干扰效果无显著性差异(P＞0.05).Western blotting方法验证ABCG2与UGT1A1的蛋白水平表达也分别相应地明显减少.结论:第一次应用慢病毒载体在Caco-2细胞上同时干扰ABCG2和UGT1A1基因表达.为研究肠道中ABCG2和UGT1A1对口服药物或外源化合物吸收和代谢的联合作用提供可靠细胞模型.
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人类P100蛋白过表达和降表达慢病毒质粒构建及其过表达和降表达白血病细胞株的建立
目的:分别构建人类P100蛋白过表达和降表达慢病毒载体并建立其过表达(NB4-pCDH-p100)和降表达(NB4-pLKO-shp100)的NB4人白血病细胞系.方法:对于人类P100蛋白过表达慢病毒质粒构建,利用Eco RI和BamHI限制性内切酶对已构建好的质粒pEGFP-C2-p100进行双酶切以获得p100基因片段,回收纯化后连接到慢病毒载体pCDH1-MCS1-EF1-copGFP上;对于人类P100蛋白降表达慢病毒质粒构建,设计针对人类p100基因的siRNA序列,进一步合成靶序列的Oligo DNA并构建pLKO.3G-shp100质粒.将构建好的P100蛋白过表达和降表达质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,包装产生假病毒颗粒.收集浓缩假病毒颗粒感染NB4细胞,并筛选单克隆细胞株.荧光显微镜下观察感染效率,利用Western blot方法检测细胞株中P100蛋白的表达水平.结果:通过对重组质粒进行酶切鉴定,观察到插入的人类p100片段和其干扰片段,并获得了P100蛋白过表达和降表达NB4细胞株,荧光显微镜下检测到感染效率达90％以上,Western blot方法证实NB4-pCDH-p100细胞株中P100蛋白表达水平明显增高,NB4-pLKO-shp100细胞株中P100蛋白表达水平明显降低.结论:成功构建了人类P100蛋白过表达和降表达慢病毒质粒并建立其过表达和降表达白血病细胞株,可为有关人类P100蛋白功能及作用机制研究奠定基础.
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卵巢癌细胞系OVCAR3过表达SND1稳定株的构建
目的:通过慢病毒载体构建过表达SND1的OVCAR3稳定的表达株.方法:重组的pLVX-FLAG-SND1表达载体与包装质粒共同转染293T细胞,获得携带FLAG-SND1的重组慢病毒.病毒感染的OVCAR3细胞经Hygromycin B筛选出稳定表达株.用Western blot方法检测SND1蛋白表达.结果:用病毒感染OVCAR3细胞,药物筛选后获得的过表达稳定株中SND1蛋白表达水平明显增高.结论:利用慢病毒表达载体pLVX-FLAG-SND1成功感染并筛选出稳定表达SND1的OVCAR3细胞株,为进一步研究SND1在卵巢癌中的作用提供了体外细胞系模型.
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NSPc1-siRNA重组慢病毒的构建及其对U87细胞NSPc1基因的沉默效应
[目的]构建包装NSPc1-siRNA慢病毒颗粒,并在 U87胶质瘤细胞中鉴定其感染及基因沉默效果.[方法]根据GenBank中基因信息,采用干扰序列设计软件设计靶点,制备合成GV118-siRNA目的质粒,转化感受态细胞,对于长出的克隆应用菌落PCR鉴定,再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和对比分析,重组病毒质粒与另外2种辅助包装载体质粒通过LipofectamineTM2000共转染293T细胞,培养48 h后,收集细胞培养上清液,将病毒浓缩后在293T细胞中测定病毒滴度;并检测病毒颗粒在目的细胞U87胶质瘤细胞中的感染效率,实时荧光定量PCR(RT-PCR)和Western blotting方法检测NSPc1 siRNA慢病毒对U87中NSPc1的干扰作用.[结果]成功构建NSPc1 siRNA慢病毒载体GV118-siRNA,重组病毒滴度为4×108 TU/ml;用该病毒体外感染U87胶质瘤细胞,当感染复数(MOI)为10时,感染效率大于90％; RT-PCR和Western blotting方法检测NSPc1基因沉默的效率分别为66.4％、60.0％.[结论]成功构建了NSPc1 siRNA慢病毒载体GV118-siRNA,该重组病毒包装后在体外感染U87胶质瘤细胞的效率较高,且具有显著的基因沉默效果.
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慢病毒表达载体pLVX-PRDX4的构建及稳定转染HepG2细胞系的建立
[目的]本研究拟构建人源过氧化还原蛋白家族成员(Peroxiredoxin 4,PRDX4)稳定过表达的人肝癌HepG2细胞系,同时验证PRDX4表达.[方法]利用RT-PCR技术扩增人PRDX4基因全长序列,插入pLVX-IRES-Puro载体,构建pLV-PRDX4载体,转染人胚肾细胞293T,包装过表达病毒颗粒,感染HepG2细胞,通过嘌呤霉素筛选,建立稳定过表达PRDX4细胞系,并且采用Western blotting验证PRDX4表达.[结果]Western blotting结果证实过表达HepG2细胞株PRDX4表达量明显高于对照细胞. [结论]成功构建过表达PRDX4的慢病毒载体和HepG2稳定细胞系,为研究PRDX4在肝癌形成和发展中的作用和机制奠定了基础.
关键词： 过氧化物酶蛋白家族 人源过氧化还原蛋白PRDX4 慢病毒载体 肝癌 -
小鼠盐皮质激素受体基因shRNA慢病毒干扰系统的建立与鉴定
[目的]应用RNA干扰技术,构建小鼠盐皮质激素受体(mineralcorticoid receptor,MR)基因重组慢病毒载体并鉴定.[方法]根据本室已经筛选的有效RNA干扰序列和阴性对照序列,合成单链引物并经退火形成双链寡核苷酸序列,连接经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切线性化的pLVX-shRNA-Puro慢病毒质粒载体中,提取质粒DNA并经测序验证.测序正确后,在Lipofectamine@3000的介导下,与慢病毒包装辅助质粒psPAX2 、pMD2.G共转染293T细胞,收集病毒上清经浓缩后感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,流式细胞术评价其滴度及感染复数,实时定量PCR法鉴定MR shRNA慢病毒的干扰效率.[结果]成功构建了重组质粒pLVX-shRNA-MR,经DNA测序验证载体构建成功.流式细胞术测定重组慢病毒的感染复数大约为100,实时定量PCR法和Western Blot法检测干扰效率大约为75％左右.[结论]成功构建出小鼠MR基因shRNA慢病毒干扰系统.
关键词： 小鼠盐皮质激素受体 慢病毒载体 RNA干扰 RAW264.7细胞 -
p100蛋白慢病毒干扰载体及p100沉默的HepG2稳定细胞系的构建
目的:用表达shRNA的干扰慢病毒载体系统构建p100基因稳定沉默的HepG2人肝癌细胞系.方法:通过RNAi序列设计软件进行p100干扰片段设计,筛选出p100基因的RNAi有效靶序列,进一步合成靶序列的Oligo DNA并构建p LKO.3G-p1001慢病毒载体,用双酶切及测序进行鉴定.将构建好的p100 shRNA表达质粒与慢病毒包装质粒共转染至包装细胞293T,包装产生病毒颗粒.运用病毒颗粒感染HepG2细胞,获得p100稳定沉默的细胞系.荧光显微镜下观察感染效率,利用Western blot方法检测稳定细胞株中p100的沉默效果.结果:成功构建了具有p100干扰效果的慢病毒载体,并获得了稳定沉默p100及对照的HepG2细胞株.慢病毒感染HepG2细胞后,荧光显微镜下观察到90％以上细胞发出绿色荧光,Western blot证实干扰p100后,HepG2细胞株中p100蛋白表达水平明显降低.结论:成功构建了具有p100干扰效果的慢病毒干扰载体及p100稳定沉默的HepG2细胞系.
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基于慢病毒载体系统构建重组JSRV-NM假病毒
目的：采用慢病毒质粒结构重组JSRV-NM假病毒，克服JSRV-NM病毒只能通过绵羊支气管穿刺接种扩增，不能通过体外细胞培养扩增的问题。方法采用慢病毒高效包装系统pMD.G、pCMV-HIV△8.2和pHIV-eGFP，以JSRV-NM病毒的env包膜质粒pCMVJSRV-NM替代VSV-G病毒的包膜质粒pMD.G，转染293T细胞，复制、包装并产出重组的JSRV-NM假病毒。用real-time PCR检测WPRE表达来测定假病毒的滴度，用接种24孔板的293T细胞检测假病毒感染力。结果成功重组了基于慢病毒质粒结构的JSRV-NM假病毒，可超速离心浓缩成高滴度（1×108 TU/mL）的病毒，Lv-JSRV-NM包膜与Lv-VSV-G包膜按感染复数（MOI）=3的比例感染Hela细胞具有相同的感染能力。结论基于慢病毒质粒构建的JSRV-NM假病毒，能够在293T细胞中复制和扩增，产出的假病毒具有稳定性、感染力和安全性，符合二级生物实验室安全的要求。
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慢病毒载体介导的bFGF基因转染兔BMSCs的实验研究
目的 观察在体外培养条件下,慢病毒载体介导的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因转染对兔骨髓基质干细胞(BMSCs)生物学特性的影响.方法 采用密度梯度离心法及贴壁筛选法获取BMSCs;利用慢病毒载体将bFGF基因转染到BMSCs中,根据转染条件分为bFGF转染组、空病毒组、未转染组,转染后分别对3组细胞的形态、bFGF mRNA及蛋白表达、细胞增殖情况、细胞周期及碱性磷酸酶(ALP)活性进行观察.结果 采用密度梯度离心法和贴壁筛选法,成功获得高纯度的BMSCs.载有bFGF基因的慢病毒转染BMSCs后,细胞形态无明显变化,而bFGF mRNA与蛋白表达均明显增强、细胞增殖曲线上移、增殖期细胞比例增大、ALP活性明显增高,与空病毒组及未转染组比较,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 利用慢病毒载体将兔bFGF基因导入体外培养的BMSCs,目的基因获得稳定表达,并且自身过表达的bFGF可以促进BMSCs的增殖与成骨分化.
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HPA-shRNA对乳腺癌MDA-MB-231细胞的肿瘤抑制作用
目的 探索乙酰肝素酶短发夹RNA(HPA-shRNA)对乳腺癌细胞的抗肿瘤作用.方法 根据RNA干扰(interfering RNA,RNAi)序列设计原则,以乳腺癌HPA基因为靶基因,构建shRNA重组慢病毒表达载体,通过Western-blot检测HPA-shRNA的敲降作用;通过CCK8实验观察HPA-shRNA对乳腺癌MDA-MB-231细胞生长增殖的影响;运用Transwell实验检测HPA-shRNA对乳腺癌MDA-MB-231侵袭能力的影响.结果 经测序分析证实HPA-shRNA1重组慢病毒栽体构建成功;在MDA-MB-231细胞内,HPA-shRNA1有效降低了HPA蛋白的表达水平(P＜0.05);通过体外实验证明了HPA-shRNA1能够抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的生长增殖及侵袭能力.结论 HPA-shRNA1重组慢病毒载体可有效抑制HPA在乳腺癌细胞中的表达,并且证实HPA-shRNA对MDA-MB-231乳腺癌细胞具有良好的抗肿瘤作用.
关键词： 慢病毒载体 乙酰肝素酶 抗肿瘤 短发夹RNA MDA-MB-231细胞 -
慢病毒载体在RNA干扰中的应用
慢病毒载体是以人类免疫缺陷1型病毒为基础发展起来的基因治疗载体.区别一般的逆转录病毒载体,它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力.该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久件表达.在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞,从而达到良好的基因治疗效果.RNA干扰技术是近年来发展起来的新技术,通过产生针对特定基因的小分子干扰RNA,能高效特异地抑制特定基因的表达,在探查基因功能和治疗人类疾病方面有广阔的应用前景.
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黑色素瘤相关抗原-A3基因重组慢病毒载体的构建与鉴定及其在肺癌细胞株中的表达
目的 构建重组慢病毒载体PLV-MAGE--A3-GFP,并检测其在人肺癌细胞系A549的表达情况.方法 利用DNA重组技术将MAGE-A3基因克隆到带GFP的慢病毒表达载体质粒PLV中,经限制性酶切和测序鉴定重组载体.将重组慢病毒载体PLV- MAGE- A3 -GFP与包装质粒pCMV-dR 8.91及pCMV-VSV-G共转染人胚肾上皮细胞株293TAB,包装重组慢病毒PL V-MAGE-A3-GFP,并感染人肺癌细胞株A549,用Western blot法检测MAGE-A3蛋白的表达情况.结果 限制性内切酶酶切和DNA测序分析证实,构建了重组慢病毒载体PLV-MAGE-A3-GFP,免疫荧光显微镜下观察显示慢病毒感染A549细胞后,MAGE-A3基因能够在细胞内正确地转录、翻译并稳定表达MAGE-A3基因.结论 成功构建了慢病毒载体PLV-MAGE-A3-GFP,包装的病毒能够成功感染人肺癌细胞系A549,并使MAGE-A3基因得以稳定表达,为进一步对非小细胞肺癌进行免疫治疗提供了适合的稳定转染的载体.
关键词： 黑色素癌相关抗原-A3 慢病毒载体 非小细胞肺癌 -
RNA 干扰沉默 IGF1R 表达对 A549细胞放射增敏作用的研究
目的：构建靶向胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)-siRNA 重组慢病毒表达载体,观察其对人肺腺癌 A549细胞放疗增敏作用并探讨其机制。方法构建 IGF1R-siRNA 重组慢病毒,感染 A549细胞,蛋白免疫印迹法检测 IGF1R 沉默效率；荧光实时定量 PCR 法及 ELISA 法分别检测缺氧诱导因子1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)和 Bad 基因及蛋白表达情况。克隆形成实验检测放射增敏作用。结果 IGF1R-siRNA 重组慢病毒使 A549细 胞 IGFlR 蛋白沉默效率达70.53%；HIF-1α、VEGF和 Bad 基因及蛋白表达量均显著降低；A549细胞对放射治疗的敏感性增加,平均致死剂量由1.20 Gy 下降至0.94 Gy,放射增敏比达1.28。结论沉默 IGF1R 对人肺腺癌 A549细胞具有放疗增敏效应,其机制可能与 HIF-1α、VEGF 和 Bad 表达下调相关。
关键词： 胰岛素样生长因子1受体 慢病毒载体 放疗增敏 RNA 干扰 A549 细胞 -
表皮生长因子受体基因RNA干扰慢病毒载体的构建和鉴定研究
目的 构建表皮生长因子受体(EGFR)基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,为其体内外实验研究提供依据.方法 合成EGFR基因的miRNA干扰序列,构建pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-EGFR质粒,测序验证插入序列正确,连接到慢病毒载体pLenti6.3-MCS/V5 DEST中,获得pLenti6.3-EGFR-miRNA质粒,与慢病毒包装质粒Packaging MIX、POLOdelivererTM 3000 Transfection Reagent共转染293T细胞株,细胞包装产生慢病毒颗粒,测定慢病毒滴度.结果 PCR和测序结果证实,EGFR miRNA核苷酸链序列插入正确,包装慢病毒产生病毒悬液滴度为1.8×106 ifu/ml.结论 成功构建EGFR基因RNAi慢病毒载体,为研究其在胶质瘤细胞中的生物学功能奠定基础.
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Tf-USPIO 纳米微粒的合成及 TfR转基因神经干细胞过表达的研究
目的：合成Tf-USPIO纳米微粒以及建立稳定表达TfR的神经干细胞。方法利用慢病毒转染神经干细胞，通过流式细胞仪筛选出稳定表达TfR的神经干细胞，运用WB检测其表达水平。将Tf与USPIO进行偶联，合成Tf-USPIO纳米微粒，通过DLS方法测出USPIO和Tf-USPIO的直径分别为（36±0?．7）nm，（43．5±0．08）nm。结果慢病毒成功的转染神经干细胞，通过流式细胞仪器筛选出稳定表达的神经干细胞，并用WB证实了TfR的过表达；通过偶联的方法合成了稳定的Tf-USPIO微粒。结论成功构建了TfR 神经干细胞系，合成出稳定的Tf-USPIO纳米微粒。
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慢病毒感染人脐静脉内皮细胞的实验研究
目的：探索慢病毒感染人脐静脉内皮细胞研究。方法：本实验共分为四组，即在细胞培养液中分别加入不同的慢病毒感染复数（MOI)：空白对照组MOI为0，三个实验组MOI值分别为5、10、50。每组将进行2种不同的感染方法，并于感染48h后观察慢病毒感染效果。结果：当MOI值为0时均未见荧光。MOI值为5时，2种条件下均可见荧光，L+P组强于L组。MOI值为10时,2种感染条件下均可见较强荧光，L+P组更强，病毒感染率可达90%。MOI值为50时，感染率下降，出现细胞死亡现象，L+P培养条件下细胞死亡更明显。结论：MOI值为10时，L+P组的感染效果佳，感染率可达90%，能满足后续实验的需求。
