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转染MIP-1α和B7-1基因增强小鼠的抗淋巴瘤效应
目的 观察转染趋化因子MIP-1α和共刺激分子B7-1基因增强小鼠抗淋巴瘤的效应.方法 将MIP-1α和B7-1基因慢病毒重组载体转染小鼠EL-4淋巴瘤细胞,应用RT-PCR检测MIP-1α和B7-1基因mRNA表达,Western blot法检测MIP-1α和B7-1蛋白表达；转基因EL-4细胞注入小鼠右腋皮下,观察成瘤情况；灭活的转基因EL-4细胞注入成瘤小鼠体内,观察其增强小鼠抗淋巴瘤效应.结果 RT-PCR检测发现EL-4/MIP-1α+ B7-1细胞内有MIP-1α及B7-1 mRNA表达,Western blot显示MIP-1 α及B7-1蛋白表达；MIP-1α组、B7-1组较对照组成瘤时间延长,成瘤率降低,肿瘤平均体积较小,而联合组成瘤性消失；MIP-1α和B7-1治疗组的肿瘤平均体积、重量及肿瘤器官转移率明显小于对照组(P＜0.05),而联合组的肿瘤平均体积及重量明显小于MIP-1α和B7-1组(P＜0.05),而且联合组小鼠平均生存期,均较单基因组、对照组明显延长(P＜0.05).结论 转染MIP-1α和B7-1基因能够明显增强小鼠机体抗淋巴瘤效应,明显延长荷瘤小鼠的平均生存期,为淋巴瘤的基因治疗提供了新的思路.
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重组表达小鼠MIP-1α和B7-1基因的慢病毒载体的构建及鉴定
目的 构建重组表达小鼠MIP-1α和B7-1基因的慢病毒载体,为淋巴瘤基因治疗的实验研究奠定基础.方法 设计引物扩增获得目的基因小鼠MIP-1α和B7-1基因的全长编码序列cDNA,将目的基因与经酶切线性化的慢病毒载体进行定向连接,其产物转化感受态细胞,对长出的阳性克隆进行PCR鉴定和直接测序序列分析.MIP-1α和B7-1目的基因质粒转染293T细胞,观察绿色荧光蛋白(GFP)表达,采用Western Blot法检测其蛋白表达,实时荧光定量PCR,检测慢病毒浓缩液的滴度.结果 成功构建了重组表达小鼠MIP-1α和B7-1基因的慢病毒载体,实时荧光定量PCR证实MIP-1α、B7-1基因重组慢病毒载体的滴度均达2.00E+8 TU/mL.结论 本研究成功构建并包装出高滴度的小鼠MIP-1α和B7-1基因重组慢病毒载体,为淋巴瘤基因治疗的实验研究奠定了基础.
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慢病毒介导GFP转染小鼠ESC及其对干细胞特性的影响
目的：研究用慢病毒载体进行基因转染对小鼠胚胎干细胞(ESC)特性的影响。方法慢病毒载体经293FT细胞包装后转染小鼠ESC,荧光显微镜下挑选和观察所得阳性克隆,检测ESC特异性标志物Oct-4、SSEA-1的表达,通过拟胚体(EB)诱导体外分化, RT-PCR检测三胚层的分化。结果形态学观察可见所得绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞呈克隆样鸟巢状生长,免疫组化可见GFP-ESC表达ESC特异性标志Oct-4、SSEA-1,能形成EB, RT-PCR检测到甲胎蛋白(AFP)、巢蛋白(Nestin)和血管内皮生长因子受体(Flk-1)的表达。结论慢病毒载体介导的基因转染不影响小鼠ESC的自我更新特性及多向分化潜能。
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神经元抑制性沉默元件双链RNA慢病毒载体的构建与鉴定
目的 构建神经元抑制性沉默元件(RE-1/NRSE)双链RNA的慢病毒载体.方法 根据RE-1/NRSE序列合成靶序列的寡核苷酸序列,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ和XhoⅠ双酶切后的pGC-LV载体连接产生L-smRE-1/NRSE慢病毒载体,采用PCR和测序对阳性克隆进行鉴定.用L-smRE-1/NRSE和包装质粒pHelper 1.0、pHelper2.0共转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒,在倒置荧光显微镜下观察293T细胞中绿色荧光蛋白的表达量,并计算病毒滴度,初步观察其对大鼠间充质干细胞的转染效率.结果 PCR和测序证实,构建出了RE-1/NRSE双链RNA的慢病毒载体L-smNRSE/RE-1.包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为4×10~8 TU/ml.慢病毒颗粒能稳定转染大鼠间充质干细胞,当感染复数为80时,感染效率达100%.结论 成功构建了RE-1/NRSE dsRNA的慢病毒表达载体.
关键词： 神经元抑制性沉默元件 双链RNA 慢病毒载体 -
人脐血间充质干细胞培养鉴定和慢病毒载体介导胶质源性神经营养因子在脐血间充质干细胞中的表达
目的 体外分离和培养人脐血间充质干细胞(UCB-MSCs),对其生物学特性进行鉴定.用含有胶质源性神经营养因子(GDNF)的慢病毒载体转染UCB-MSCs,初步评价基因转染后UCB-MSCs生物学功能变化,探讨GDNF在UCB-MSCs中的表达水平.方法 采用密度梯度离心法从脐血中分离单核细胞,通过贴壁培养和控制消化时间得到形态较均一的长梭形细胞,流式细胞仪(FACS)检测其细胞表面标记,诱导其向脂肪方向分化,对UCB-MSCs的生物学特性进行鉴定.将GDNF基因克隆人慢病毒载体,包装出病毒上清,以不同拷贝数转染UCB-MSCs,通过检测细胞表面抗原,观察细胞形态学和增殖分化能力的差异,初步评价基因转染对细胞生物学功能的影响.采用酶联免疫吸附实验(ELISA)和实时定量多聚合酶链反应(real-time PCR)技术分别测定不同转染组GDNF的蛋白及mRNA表达水平.结果 采用密度梯度离心法成功在体外分离和培养出UCB-MSCs,并诱导其向脂肪细胞分化.FACS检测结果显示,UCB-MSCs中CD90、CD73及CD105蛋白表达阳性,CD14、CD34、CD45、CD19、HLA-DR、Stro-1及CD106蛋白表达阴性.ELISA和real-time PCR检测结果显示,用含GDNF基因的慢病毒载体转染UCB-MSCs后,其GDNF蛋白分泌量和mRNA表达水平与转染拷贝数有关,转染拷贝数越高,GDNF表达量越高.GDNF基因转染后UCB-MSCs的原有生物学功能无明显改变.结论 成功在体外分离和培养出UCB-MSCs.用含有GDNF基因的慢病毒载体转染UCB-MSCs可通过转染拷贝数在一定水平上控制GDNF蛋白分泌量和mRNA表达水平,使其持续高表达GDNF.
关键词： 脐血 间充质干细胞 胶质源性神经营养因子 慢病毒载体 转染 -
应用短发卡RNA慢病毒质粒载体抑制去整合素金属蛋白酶33的表达
去整合素金属蛋白酶33(a disintegrin and met-alloproteinase 33,ADAM33)是近发现的ADAM家族成员,与支气管哮喘和气道高反应性有关.本研究旨在通过构建ADAM33小发卡RNA(smallhairpin RNA,shRNA)质粒表达载体,抑制AD-AM33基因在小鼠成纤维细胞(NIH/3T3)中的表达,为进一步研究ADAM33基因在气道重塑中的作用提供证据.
关键词： 去整合素金属蛋白酶33基因 RNA干扰 慢病毒载体 哮喘 -
过表达FoxO1对高糖诱导下大鼠肾小球系膜细胞细胞外基质分泌的影响
目的 研究叉头转录因子O1(FoxO1)过表达对高糖培养下大鼠肾小球系膜细胞(MCs)细胞外基质(ECM)蛋白分泌的影响及其作用机制.方法 以含组成性激活突变型(CA)FoxO1编码序列的慢病毒载体(LV-CA-FoxO1)及空慢病毒载体(LV-NC-GFP)转染MCs.实验分4组:正常糖(5.6 mmol/L)组(NG组),高糖(25 mmol/L)组(HG组)、高糖+LV-CA-FoxO1组(LV-CA组)、高糖+空病毒载体组(LV-NC组).各组培养72 h后,实时荧光定量PCR(Real-timePCR)检测FoxO1、纤维连接蛋白(FN)、Ⅰ型胶原蛋白(Col Ⅰ)、Ⅳ型胶原(ColⅣ)、转化生长因子β1(TGF-β1)和TGF-β Ⅰ型及Ⅱ型受体(TGF-βR Ⅰ/Ⅱ)mRNA的表达水平;Western印迹法检测FoxO1、磷酸化FoxO1(p-FoxO1)、TGF-β1、TGF-βRⅠ/Ⅱ的蛋白表达;细胞免疫荧光化学检测TGF-βR Ⅰ在细胞内表达分布.结果 (1) FoxO1表达及活性改变:HG组FoxO1 mRNA及蛋白表达与NG组相比差异均无统计学意义(均P ＞0.05),p-FoxO1蛋白表达高于NG组(P＜0.05);与HG组相比,LV-CA组FoxO1mRNA与蛋白表达水平均高于HG组(mRNA:为17.36±1.13比1.01 ±0.12,蛋白:4.38±0.09比0.93 ±0.10,均P＜0.05),p-FoxO1/FoxO1低于HG组(P＜0.05),FoxO1表达增加,转录活性增强.(2) ECM蛋白分泌改变:HG组FN、Col Ⅰ及ColⅣmRNA表达高于NG组(均P＜0.05),LV-CA组FN、Col Ⅰ及ColⅣ表达低于HG组(均P＜0.05).(3) TGF-β传导通路激活改变:HG组TGF-β1、TGF-βRⅠ/Ⅱ表达均高于NG组(均P＜0.05),而LV-CA组上述指标均低于HG组(均P＜0.05);细胞免疫荧光化学结果提示,LV-CA组TGF-βR Ⅰ在细胞内分布与HG组相比减少.LV-NC组上述指标与HG组相比差异均无统计学意义(均P＞0.05).结论 FoxO1能够抑制TGF-β传导通路的激活,从而减少MCs在高糖诱导下过度分泌ECM蛋白.
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小鼠Tox3基因重组慢病毒载体的构建及其在卵巢颗粒细胞中的表达
目的:构建重组慢病毒载体pCDH-Tox3-Flag,并检测其转染小鼠原代卵泡颗粒细胞后的表达情况.方法:利用DNA重组技术将小鼠Tox3基因克隆入慢病毒表达载体pCDH-MCS-T2A-copGFP-MSCV中,通过酶切、测序验证后,将重组慢病毒载体pCDH-Tox3-Flag、包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转染HEK293FT细胞,包装重组慢病毒LV-Tox3-Flag,并感染小鼠原代颗粒细胞,用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测Tox3 mRNA的转录水平,蛋白质印迹(Western blot)法检测TOX3-Flag蛋白的表达情况.结果:经酶切及测序结果证实,构建了重组慢病毒载体LV-Tox3;RT-PCR及Western blot结果显示慢病毒感染小鼠原代颗粒细胞后,Tox3基因能在细胞内正确转录、翻译并稳定表达TOX3蛋白.结论:成功建立Tox3基因慢病毒表达载体L V-Tox3-Flag,包装的慢病毒能够成功感染小鼠原代颗粒细胞,并使Tox3基因得到稳定表达,为后续研究Tox3基因在生殖相关疾病的生理与病理作用奠定了基础.
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长链非编码RNA lnc-GCLC-1稳定沉默的肝细胞株L02的构建与验证
目的 利用慢病毒载体构建长链非编码RNA lnc-GCLC-1沉默的稳转L02肝细胞株,为研究lnc-GCLC-1功能提供基础.方法 以lnc-GCLC-1为靶点,设计并合成4组双链发卡结构,分别与慢病毒载体psi-LVRH 1GP连接构成重组质粒;转化感受态细胞获取大量重组质粒后电泳、测序鉴定;通过瞬时转染筛选出2个有效的短发卡RNA(shRNA);将重组质粒转染293T细胞后,收集病毒液并感染L02细胞,经嘌呤霉素筛选出稳定转染细胞株.利用荧光显微镜观察细胞绿色荧光情况以检测转染效果,采用Real-time PCR鉴定转染细胞株,并检测lnc-GCLC-1沉默对GCLC mRNA表达的影响.结果 电泳及测序结果表明重组慢病毒载体构建成功;shRNA-2和shRNA-4是有效的shRNA;用0.5 μg/ml嘌呤霉素成功筛选出稳定低表达L02细胞株;在shRNA-2和shRNA-4稳定转染L02细胞株中,lnc-GCLC-1的表达水平均低于阴性载体组(P＜0.05),沉默效率分别为21.3％和64.82％;shRNA-2组和shRNA-4组GCLC的mRNA表达量均低于阴性载体组(P＜0.01).结论 本研究成功构建了lnc-GCLC-1沉默稳转L02细胞株.
关键词： lnc-GCLC-1 沉默 L02细胞 慢病毒载体 -
microRNA对A549细胞TGF-β1/ERK信号通路的调控
目的 观察目标microRNA对博来霉素诱导的A549细胞TGF-β1/ERK信号通路的调控作用.方法 构建miR-16、miR-21、miR-29a、miR-155、miR-200c、miR-204、miR-206过表达慢病毒载体,感染A549细胞后用博来霉素刺激,采用Real time-PCR和Western blot方法检测TGF-β1、ERK、AKT和p38表达情况.结果 Real time-PCR和Western blot检测结果显示,miR-200c过表达慢病毒能够降低博来霉素刺激的A549细胞中TGF-β1、ERK、AKT和p38的表达(P＜0.05).结论 miR-200c能够降低A549细胞TGF-β1/ERK信号通路相关基因的表达,为进一步研究miR-200c调控TGF-β1/ERK信号通路的分子机制奠定实验基础.
关键词： 微小RNA 慢病毒载体 A549细胞 TGF-β1/ERK信号通路 -
慢病毒介导的稳定过表达人谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚基基因的WRL68细胞株构建
目的 利用慢病毒载体构建稳定过表达人谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)的WRL68细胞株.方法 采用PCR方法合成GCLC基因全长,经NotⅠ、NsiⅠ酶切后克隆到慢病毒载体LV6上;采用PCR、酶切、测序鉴定重组质粒LV6-GCLC;将重组质粒转染293T细胞,收集培养上清并感染WRL68细胞,经嘌呤霉素筛选出稳定过表达细胞株.采用增强型绿色荧光蛋白检测转染情况,采用Real-time PCR及Western blotting鉴定所构建的细胞株;MTT法检测细胞活性;采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测细胞谷胱甘肽(GSHl)含量.结果 PCR、酶切及测序结果表明重组慢病毒载体构建成功;重组慢病毒转染293T细胞后可观察到荧光及蛋白表达,包装过表达慢病毒并检测其浓缩滴度为1.0× 109 TU/ml;用1μg/ml嘌呤霉素成功筛选出稳定过表达细胞株;GCLC过表达组中GCLC的mRNA和蛋白的表达量高于空载体转染组及对照组(P＜0.05);GCLC过表达组、空载体转染组及对照组的细胞活性间比较,差异无统计学意义(P＞0.05);GCLC过表达组GSH含量明显高于空载体转染组及对照组(P＜0.05).结论 成功构建了稳定过表达人GCLC的WRL68细胞株.
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应用Gateway技术构建过表达β-catenin基因的慢病毒载体
目的 应用Gateway技术构建靶向过表达β-catenin基因的慢病毒载体,验证该载体的功能.方法 利用多位点Gateway克隆技术,通过BP重组反应,构建穿梭载体pDown-Ctnnb1；再通过LR重组反应,将pUp-EF1A、pDown-Ctnnb1、pTail-IRES/DsRed-Express2和母载体pLV.Des3d.P/puro 4个质粒构建成表达载体pLV.EX3d.P/puro-EF1A＞Ctnnb1 ＞IRES/DsRed-Express2;再转化到感受态细胞stbl3,经PCR筛选菌落阳性克隆测序鉴定.将成功构建的慢病毒表达载体转染293T细胞,用实时荧光定量PCR法验证重组载体对β-catenin基因mRNA水平的影响.结果 菌落PCR筛选和DNA测序鉴定显示入门克隆和表达载体插入片段序列正确,实时荧光定量PCR证实β-catenin基因mRNA水平显著上调(P＜0.01).结论 成功构建能显著上调β-catenin基因mRNA表达的慢病毒载体.
关键词： 多位点Gateway技术 β-catenin 过表达 慢病毒载体 293T细胞 -
红色荧光蛋白和荧光素酶双表达稳定肺癌细胞系的建立
目的 构建能稳定表达红色荧光蛋白(RFP)和萤火虫荧光素酶(Fluc)的人肺癌细胞系,为建立活体成像的人肺癌裸鼠移植瘤模型及治疗研究奠定基础.方法 构建含Fluc和RFP基因的慢病毒载体pHBLV-Fluc-RFP,转染293T细胞进行病毒包装,用获得病毒液感染人肺癌细胞系A549、H1975和人B细胞淋巴瘤细胞系K562,再用嘌呤霉素筛选获得稳定细胞株,后分别采用荧光显微镜和实时定量PCR检测稳定感染细胞中RFP和Fluc的表达.结果 成功构建了pHBLV-Fluc-RFP慢病毒载体,获得了稳定表达Fluc和RFP的A549、H1975和K562细胞.荧光显微镜下可观测到3种稳定感染细胞中均有红色荧光.实时定量PCR检测结果显示,3种稳定感染细胞中Fluc基因的相对表达量远远高于对应的野生型细胞,差异均具有统计学意义(均P＜0.05).结论 获得的RFP和Fluc双表达人肺癌细胞系A549、H1975和人B细胞淋巴瘤细胞系K562,为人肺癌细胞免疫缺陷小鼠模型的活体成像提供了新荧光配色细胞模型.
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EZH2基因RNAi慢病毒载体的包装及鉴定
目的 外周T细胞淋巴瘤(PTCL)源于成熟的胸腺后淋巴细胞,是一类少见的生物学行为及临床表现均高度异质性的疾病,且预后差.包装zeste基因增强子同源物2(EZH2)RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,可为今后相关实验研究奠定基础.方法 靶向EZH2基因的短发夹RNA(EZH2-shRNA)质粒转化感受态细菌,筛选阳性克隆,经测序鉴定正确后通过脂质体将慢病毒三质粒系统共转染293T细胞,进行慢病毒包装.病毒载体感染Hut78细胞后,观察感染效率,并用反转录定量PCR(RT-qPCR)和Western Blot检测EZH2mRNA和蛋白表达水平.结果 成功包装了慢病毒表达载体,对Hut78细胞的感染效率在95％以上.RT-qPCR和Western Blot检测结果显示,EZH2基因在靶细胞中的表达水平降低.结论 成功包装并鉴定了EZH2基因RNAi慢病毒表达载体.
关键词： 外周T细胞淋巴瘤 zeste基因增强子同源物2 慢病毒载体 RNA干扰 -
Nup88-shRNA对人结肠癌细胞株HT-29生长及侵袭力影响的实验研究
目的：构建重组慢病毒介导的Nup88-shRNA载体，由RNA干扰（RNAi）技术沉默Nup88，研究其对结肠癌HT-29细胞的增殖、黏附、侵袭和转移的影响，为结肠癌的临床基因治疗寻找新的靶点。方法 Nup88重组慢病毒载体的构建后包装检验效价，以佳感染复数转染结肠癌HT-29细胞，实验分为沉默组、阴性对照组和空白组3组，其中沉默组分为Nup88-shRNA1、Nup88-shRNA2、Nup88-shRNA3、Nup88-shRNA44个亚组。通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot印迹检测各组表达效率，主要是HT-29细胞的mRNA和蛋白；四甲基偶氮唑盐（MTT）法和流式细胞术检测Nup88基因被干扰后对HT-29细胞增殖和凋亡的影响；细胞侵袭实验检测Nup88基因被干扰后对HT-29细胞侵袭力的影响。结果沉默4组病毒及1组阴性对照均构建成功，滴度均为4E+8 TU/mL。沉默组Nup88 mRNA与阴性对照组和空白组相比，蛋白表达差异均有显著统计学意义（P<0．01）。 Nup88-shRNA1转染后，沉默率可达到86%。沉默组细胞增殖程度显著减少，与空白组和阴性对照组相比，差异有统计学意义（P<0．05）。沉默组细胞凋亡率（30．28%±0．19%）显著增加，与阴性对照组（4．15%±0．24%）和空白组（2．98%±0．27%）相比，差异有统计学意义（P<0．05）。培养肿瘤细胞常规24 h 后，沉默组穿膜细胞数（120．5±8．7）和抑制率（49．22%）与阴性对照组（232．2±13．4，-2．14%）和空白组（276．4±10．2，0）相比，穿膜细胞数明显减少，抑制率明显增加，差异具有统计学意义（P<0．05）。结论 Nup88重组慢病毒可以通过RNAi成功抑制HT-29细胞中Nup88基因的表达，并能显著抑制其增殖及远处的侵袭能力。
关键词： Nup88 人结肠癌细胞HT-29 RNA干扰(RNAi) 慢病毒载体 -
慢病毒载体介导的基因转导技术对人脐血CD34+细胞基因表达谱的影响
目的 研究慢病毒载体(lentivirus vector)基凶转导技术对脐血CD34+细胞基因表达的影响.方法 将携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的第三代自身失活(self-inactivating,SIN)慢病毒载体导入CD34+细胞,提取被病毒感染细胞的总RNA,应用cDNA微阵列技术对慢病毒载体感染的脐血CD34+细胞及正常对照细胞进行差异基因表达谱分析.结果 在23000个被检测基因中,与无基因导人的对照组细胞比较,基因导入细胞中表达的上调基因共2个,分别为IGSF4和HEC基因,下调基因共6个,分别为HNRPAO、ZNF205、FLNA、CLK3、LDB1、ACTA1.进一步对筛选出的差异表达基因进行半定量RT-PCR分析证实基因表达水平变化不明显.结论 本实验中应用的慢病毒载体对脐血CD34+细胞基凶表达无明显影响,有望成为临床基因治疗有效且安全的工具.
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MicroRNA-191在T淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤中的表达及其作用机制研究
目的 探讨MicroRNA-191 (miR-191)与T淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤(T-ALL/LBL)的相关性及其作用机制.方法 采用荧光实时定量PCR(qRT-PCR)法检测20例T-ALL/LBL患者肿瘤组织和20例淋巴结反应性增生(LRH)患者淋巴结组织中miR-191的表达,并分析其与临床预后的关系.构建反义miR-191慢病毒载体(LV-miR-191-KD)和阴性对照载体(LV-NC-GFP)并转染T-ALL细胞系Jurkat细胞,qRT-PCR法检测miR-191的表达水平.分别用CCK-8法和流式细胞术检测下调miR-191后的细胞活性、细胞周期和凋亡.结果 T-ALL/LBL患者组miR-191表达水平明显高于LRH患者组(1.875±0.079对1.000,P=0.001),以miR-191表达量的中位数为界,将T-ALL/LBL患者分为高表达组(10例)与低表达组(10例),高表达组患者3年OS率明显低于低表达组(26％对82％,P=0.021).转染48 h后,LV-miR-191-KD组Jurkat细胞miR-191表达水平(0.578±0.012)较LV-NC-GFP组(1.011±0.053)和未转染对照组(1.000)显著降低(P值分别为0.018和0.021),细胞凋亡比例显著升高(P值均＜0.05),细胞周期阻滞于G0/G1期,并抑制从G1期向S期转化.结论 miR-191在T-ALL/LBL的发生、发展过程中起促进作用,可能作为T-ALL/LBL治疗的潜在靶点.
关键词： 微RNAs 前体T细胞淋巴母细胞白血病淋巴瘤 预后 慢病毒载体 -
慢病毒载体介导CXCR4基因过表达对骨髓间充质干细胞生物学特性的影响
目的 探讨慢病毒表达载体介导的小鼠CXC型趋化因子受体4(CXCR4)基因体外对小鼠骨髓间充质干细胞(MSC)生物学特性的影响.方法 克隆小鼠CXCR4基因,构建携带CXCR4基因与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)双顺反子结构的重组慢病毒表达载体LV-CXCR4-IRES-EGFP,同时构建对照载体LV-IRES-EGFP.脂质体法包装病毒,并测定滴度.通过优化慢病毒感染MSC条件,建立高表达CXCR4的MSC,荧光显微镜观察EGFP表达,流式细胞术检测细胞表面CXCR4表达,CCK-8法检测MSC对单向混合淋巴细胞培养体系中淋巴细胞增殖的影响,划痕实验和Transwell实验检测MSC体外迁移能力.结果 成功克隆小鼠CXCR4基因,并构建重组慢病毒载体LV-CXCR4-IRES-EGFP和对照载体LV-IRES-EGFP.制备共表达CXCR4和报告基因EGFP的高滴度慢病毒颗粒.优化感染条件后,LV-CXCR4-IRES-EGFP感染组MSC表面CXCR4的表达明显高于LV-IRES-EGFP对照组(P＜0.05),分别为(90.3±3.37)％和(1.53±0.34)％.过表达CXCR4基因不影响MSC对T淋巴细胞增殖的抑制作用(P＞0.05).划痕实验和Transwell实验结果表明,过表达CXCR4可明显提高MSC对划痕损伤修复能力和向高浓度基质细胞衍生因子-1(SDF-1)的迁移能力,并且具有剂量依赖性.结论 成功构建重组慢病毒载体LV-CXCR4-IRES-EGFP,慢病毒载体系统可高效介导CXCR4基因在小鼠MSC表达,并具有生物学活性.
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慢病毒载体介导的CXCR4基因过表达骨髓间充质干细胞在防治小鼠移植物抗宿主病中的作用
目的 探讨小鼠CXC型趋化因子受体4(CXCR4)基因过表达的骨髓间充质干细胞(MSC)防治小鼠移植物抗宿主病(GVHD)作用.方法 利用慢病毒载体构建过表达小鼠CXCR4基因的重组慢病毒载体,包装病毒后转导小鼠骨髓间充质干细胞(CXCR4-MSC).以C57BL/6小鼠为供鼠,BALB/c小鼠为受鼠,建立小鼠异基因骨髓移植(BMT)模型,同时输注骨髓MSC.分5组:全身照射(TBI)组:仅接受TBI; BMT组:TBI组输注小鼠骨髓细胞;GVHD组:BMT组输注异基因脾细胞;EGFP-MSC组:GVHD组输注EGFP-MSC; CXCR4组:GVHD组输注CXCR4-MSC.观察受鼠生存状态,统计生存率,观察受鼠组织病理学改变及炎症细胞因子变化,评价其对GVHD防治作用.结果 TBI组小鼠在照射后14d内均死于造血衰竭,BMT组受鼠可获长期存活,GVHD组、EGFP-MSC组和CXCR4-MSC组生存时间分别为(1 7.0±2.3)、(21.7±4.8)、(30.1±9.1)d,CXCR4-MSC共移植组受鼠存活时间明显长于GVHD组(P＜0.05).各组受鼠均出现腹泻、弓背、翘毛、皮肤缺损、体重减轻等GVHD症状,共移植CXCR4-MSC组受鼠临床评分低于GVHD组(P＜0.05).GVHD组与EGFP-MSC组受鼠肝脏、小肠与皮肤均存在典型GVHD病理改变,CXCR4-MSC组仅发生Ⅰ～Ⅱ度病理改变,受鼠组织病理评分低于以上两组.移植后第14天,各组受鼠促炎症因子水平明显升高,CXCR4-MSC组IFN-γ、IL-2、TNF-α水平明显低于GVHD组与EGFP-MSC组(P＜0.05).结论 联合输注CXCR4过表达的骨髓MSC可通过降低受鼠移植后炎症因子分泌从而减轻GVHD.
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抑癌基因p14ARF表达上调对慢性髓性白血病细胞凋亡的影响
目的 探讨上调抑癌基因p14ARF表达对慢性髓性白血病(CML)细胞凋亡的影响以及其对伊马替尼增敏的作用.方法 应用水泡性口膜炎病毒外壳糖蛋白假构型(VSV-G pseudotyped)慢病毒载体基因转导系统,将抑癌基因p14ARF导入CML细胞系K562及4例CML急变期患者原代白血病细胞(分别称为CML-BC1 ～4),同时以转染空载体的细胞作为对照组.用荧光显微镜及流式细胞术检测转导效率,Western blot法检测K562细胞p14ARF蛋白表达；用WST-8法检测细胞增殖抑制率及转染目的基因的K562细胞在不同浓度倍比稀释的伊马替尼(0、0.015、0.062、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 μmol/L)处理后细胞增殖抑制情况；用FITC标记的膜联蛋白V/碘化丙锭(Annexin V-FITC/PI)标记流式细胞术检测细胞凋亡；半固体培养法检测白血病细胞集落形成能力.结果 荧光显微镜及流式细胞术检测GFP阳性细胞率显示,转染目的基因及空载体的K562细胞及CML-BC1细胞转染效率接近100％,而CML-BC2 ～4细胞转导效率为80％～90％；Western blot分析结果显示,转导p14ARF的K562细胞(K562-p14ARF)ARF蛋白表达较未转导细胞明显提高；K562-p14ARF细胞凋亡率为20％；转导p14ARF后的4例CML患者原代白血病细胞凋亡率为(71.1±22.4)％,与对照组的(12.4±6.2)％相比差异有统计学意义(P＜0.05).伊马替尼对K562-p14ARF细胞增殖有明显的抑制作用,且呈浓度依赖性.转导p14ARF后的4例CML患者原代白血病细胞集落形成数为41.5 ±13.2,与对照组(88.5±7.9)相比差异有统计学意义(P＜0.05).结论 人为上调p14ARF基因表达可诱导CML细胞凋亡,与伊马替尼联合应用可进一步加强对细胞增殖的抑制作用.
