首页 > 文献资料
-
VEGF反义寡核苷酸对C6胶质瘤细胞VEGF 表达抑制作用的定量和定性检测
为观察VEGF反义寡核苷酸对C6胶质瘤细胞VEGF表达抑制作用,应用免疫荧光流式细胞技术和免疫细胞化学定量和定性观察反义、正义、错义寡核苷酸对C6胶质瘤细胞VEGF表达的影响.结果显示,VEGF反义寡核苷酸对C6胶质瘤细胞VEGF的表达有明显抑制作用,而且抑制作用存在浓度依赖性.提示VEGF反义寡核苷酸能够有效地抑制C6胶质瘤细胞VEGF的表达.
-
端粒酶反义寡核苷酸对恶性脑胶质瘤细胞生长的抑制作用
为观察端粒酶反义寡核苷酸(ODN)对恶性脑胶质瘤细胞的生长抑制作用,采用手术切除的端粒酶活性呈阳性表达的Ⅲ、Ⅳ级脑胶质瘤标本16例,提取细胞进行原代培养后,以5μmol/L端粒酶反义寡核苷酸与恶性胶质瘤细胞进行孵育,每隔24h取样,以流式细胞仪检测PCNA、TUNEL阳性细胞百分率及细胞周期时相.结果显示,反义寡核苷酸对端粒酶活性于48h出现抑制,72h完全抑制, 72h后对胶质瘤细胞增殖出现显著抑制并对细胞凋亡有显著促进作用,96h后细胞多滞留于G2/M期,此期凋亡细胞百分率随时间延长而增加.提示端粒酶反义寡核苷酸对端粒酶活性具有抑制作用,并可引起细胞周期阻滞,抑制脑胶质瘤细胞增殖而促进其凋亡.
-
PCNA基因反义RNA表达质粒的构建及对人胃癌裸鼠移植瘤的抑制效应
为观察PCNA基因反义RNA表达质粒对人胃癌裸鼠移植瘤的抑制效应,用DNA重组法将人PCNA基因反向克隆到真核细胞表达质粒pDOR-neo中,构建成PCNA基因真核表达质粒pDR-PCNA,用Lipofect AMINTM介导转染人胃癌细胞系SGC-7901,并接种于裸鼠背部皮下.经G418筛选获得的转染细胞系SGC/PCNA与亲本细胞相比,其生长速度减慢,RNA、蛋白质生物合成受到抑制,S期、G2/M期DNA含量降低,移植瘤生长速度减慢,瘤体平均直径(0.54±0.13)cm,明显小于对照组(1.51±0.11)cm.结果表明,PCNA基因反义RNA表达质粒对胃癌裸鼠移植瘤生长具有明显的抑制作用.
-
反义C-myc寡核苷酸抑制血管吻合口狭窄的实验研究
为了探讨局部应用反义C-myc寡核苷酸对血管吻合口狭窄的抑制作用,将30只新西兰大白兔颈外静脉间置于同侧颈总动脉后随机分成对照组、胶组、正义组、反义组及错配组,以医用生物蛋白胶分别溶解反义、正义及错配的C-myc基因片段(330μg)直接涂于血管吻合口外周.术后28天取材制片,进行形态观察,并用计算机图像分析系统测量和计算内膜、中膜厚度及二者之比值,内膜、中膜面积及二者之比值.结果发现,反义组增生内膜厚度较对照组降低39%、内膜面积降低51%,对照组、胶组、正义组及错配组间内膜厚度及内膜面积均无明显差异(P>0.05);各组间中膜厚度及中膜面积均无明显差异(P>0.05).提示医用生物蛋白胶携载反义C-myc寡核苷酸局部用于血管吻合口外膜能显著抑制其内膜增生,有效防止血管吻合口狭窄.
-
纤维蛋白组织粘着剂携载反义基因片段的实验研究
为了探讨纤维蛋白组织粘着剂携载反义基因片段血管外膜给药的可能性及可行性,作者首先对粘着剂的物理性状进行了观察,继而将亚甲蓝溶于粘着剂中观察其上清液的颜色变化,再以人工合成的反义寡核苷酸溶于粘着剂中,分别于12、24、36、48、60、72h取其上清液以紫外分光光度计测其OD值,绘出其体外控释曲线.结果发现,粘着剂混合后即刻凝结,表面呈膜状,内部呈丝状蛋白结构,其间充满颗粒状液体;粘着剂具有弹性,有类似海绵样特性,且随着时间延长其上清液颜色渐变深;体外控释曲线显示其携载的反义寡核苷酸可以缓慢释放,近72h 已大部分释放.提示纤维蛋白组织粘着剂可以携载反义基因片段直接血管外膜给药,使反义药物缓慢释放,大大延长了反义药物的局部作用时间.
-
基因芯片结合可环化探针对单碱基突变的检测
目的:将基于连接反应的可环化探针(circularizable oligonucleotide probe, C-probe)技术用于基因芯片对单碱基突变的检测.方法:可环化探针是一种检测核酸分子中单碱基突变的线性寡核苷酸分子,中间部分是通用引物结合区(约40 mer),5′端与3′端是两段与待检测的DNA分子中靶序列互补的目标序列识别区(各约20 mer).与靶序列互补结合后,可环化探针的两个末端在空间靠近并在DNA连接酶的作用下连接形成环状分子,利用荧光分子标记的通用引物对连接产物进行PCR扩增,再利用基因芯片检测荧光标记的PCR产物,从而确定所检测的核苷酸位点的性质.本实验以检测CYP3A4基因外显子5中14 026位点的单核苷酸多态性为例,优化了连接反应、荧光标记通用引物的PCR扩增以及探针杂交检测等条件,并用该方法对合成模板和人基因组DNA标本进行检测.结果:以合成的寡核苷酸序列为模板进行10倍系列稀释,确定可环化探针的检测灵敏度,PCR产物的凝胶电泳结果表明,检测灵敏度达到103拷贝;可环化探针对合成的野生型和突变型模板具有良好的区分效果.用该方法检测人基因组DNA标本,芯片检测结果与测序结果符合,证实了该方法的可行性.结论:连接反应是具特异性的酶促反应,将其与基因芯片技术结合用于单碱基突变检测,有助于简化荧光标记过程,提高检测结果的准确性.
-
用Red介导的同源重组结合酶切改构质粒DNA
目的:用Red介导的单链寡核苷酸体内同源重组结合限制酶切方法对pBR322-Red质粒中的DNA序列进行精确的缺失突变.方法:用合成的单链寡核苷酸打靶分子电击转化W3110(pBR322-Red)宿主菌,利用Red提供的同源重组功能敲除从kil基因至N基因长约2 100 bp的DNA序列,并用kil-N序列中含有的单一酶切位点XhoⅠ对混合质粒进行酶切,取酶切产物转化W3110感受态细胞,菌落PCR方法筛选重组阳性克隆.结果:在没有任何筛选标记的情况下,用菌落PCR方法从10个菌落中成功挑选出1个重组阳性克隆.结论:该方法操作简单、精确,能够避免引入新突变,为DNA序列的缺失突变提供了一种新方法.
-
反义核酸药物的合成和纯化
反义核酸药物是能与特定mRNA序列互补的不同长度的短小DNA片段,能够通过与靶mRNA形成杂交双链而干扰基因表达.反义核酸药物的合成、纯化是新药临床前评价的基础.本文就国内外反义核酸药物合成中常用的载体、硫代试剂、脱保护试剂的发展,纯化常用的聚丙烯酰胺凝胶电泳、薄层色谱、高效膜吸附色谱、寡核苷酸纯化柱芯和高效液相色谱等方法进行了综述,对其各自的特点、应用前景及优缺点等进行了介绍.
-
放射性同位素示踪技术在反义核酸研究中的应用
用放射性同位素标记反义核酸,可方便地对反义核酸的体内行为进行研究,或者进行反义显像和反义治疗.目前已有多种不同性质的放射性同位素被用于反义核酸标记,标记方法也不断得到完善.本文对常用于反义核酸标记的放射性同位素的特点及其标记方法进行综述,介绍其在反义治疗药物和反义显像研究中的应用情况,并评述了反义核酸同位素标记存在的问题和发展趋势.
-
无胶筛分毛细管电泳分离相差单个碱基的脱氧寡核苷酸方法初探
目的:建立和优化分离不同碱基数目硫代脱氧寡核苷酸的有效方法.方法:用去离子水溶解硫代脱氧寡核苷酸样品并采用核酸蛋白分析仪定量.在无胶筛分毛细管电泳分离分析之前超声波和高速离心脱气.无胶筛分毛细管电泳以线性大分子ssDNA 100-R Gel作为分离介质.为得到佳效果,对毛细管温度、分离电压、进样方式和进样时间进行了优化.结果:灵敏度、迁移时间和重现性的佳实验条件为:毛细管温度25℃,电动进样10kV10s,DAD检测器波长为255 nm,18 kV恒压分离模式.在此条件下,成功分离了依次相差一个碱基的21种脱氧寡核苷酸[pd(A)40-60].结论:建立并优化了一种简单快速分离相差单个碱基的脱氧寡核苷酸的毛细管电泳方法.
-
靶向微小RNA的病毒感染疾病治疗新策略
微小RNA(microRNA,miRNA)是真核生物细胞的一类长度约为19～25个核苷酸的非编码小RNA,在生物体发育和基因表达过程发挥重要的调控作用.miRNA分子通过与靶mRNA的互补配对,在转录后水平上对基因的表达进行负调控.近来研究表明miRNA在病毒感染宿主过程中发挥重要作用.通过设计抗miRNA反义寡核苷酸促进或阻断特定miRNA的表达可以实现抑制病毒复制的目标.本文综述了抗miRNA反义寡核苷酸研究现状和面临的挑战.
-
基于RNA的基因治疗药物研究进展
基于RNA的基因治疗是基因治疗领域的一种重要技术手段,其中多数技术在mRNA水平调控基因表达,特别是在抑制一些有害基因表达或失控基因过度表达方面取得了很大进步.本文就反义寡核苷酸、核酶及RNA干扰等主要的RNA治疗药物的作用机制、应用研究及存在问题进行综述.
-
反义:衰而未败
20年来,反义核酸药物的发展非常缓慢,仅有一个反义药物进入市场,其他大部分都在Ⅲ期临床试验中遭遇失败,有关反义新药的申请也很快被FDA驳回.人们开始把目光投向竞争RNA技术平台尤其是小干扰RNA,这是否意味着反义核酸药物没有发展前途了呢？本文就反义药物的发展现状、发展前途以及可能突破现状的切入点作了详细分析,为反义药物的继续发展指出了方向.
-
一个新的靶向HER-2mRNA的反义寡核苷酸,HA824,对HER-2表达的影响
目的观察HA824,这种新合成的靶向HER-2 mRNA的反义寡核苷酸对SK-BR-3乳癌细胞株mRNA和蛋白表达的特异性作用.方法以HA4为阳性对照,随机序列为随机对照检测了HA824对SK-BR-3细胞生长的抑制作用与IC50值;采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、流式细胞技术、免疫组织化学法检测了对SK-BR-3细胞mRNA与蛋白表达的影响.结果结果表明HA824对SK-BR-3乳癌细胞的生长有剂量依赖性的抑制作用[IC50(nmol@L-1):HA824,(47±26);HA4,(97±41);随机序列,(251±86).HA824 vs HA4,P＜0.05].HA824还显著抑制了HER-2 mRNA与蛋白的表达(免疫组化结果:HA824,1+染色;HA4,2+染色;随机序列,3+染色;流式细胞技术检测结果,荧光强度分别为:HA824,338.6;HA4,355.5;随机序列,532.4).结论HA824对SK-BR-3乳癌细胞生长的抑制作用与特异性的抑制HER-2表达有关.
-
骨桥蛋白基因反义寡核苷酸对被动吸烟大鼠骨组织的影响
目的 探讨骨桥蛋白(OPN)在被动吸烟所致大鼠骨吸收中的作用,了解OPN基因反义寡核苷酸(AS-OPN)对大鼠被动吸烟所致骨质疏松的影响,寻求治疗骨质疏松症的可能有效途径.方法 2月龄SD大鼠40只,随机分4组:对照组、被动吸烟组、AS-OPN组和有义OPN(S-OPN)组,每组10只.按密室熏烟法给大鼠被动吸烟,同时AS-OPN及S-OPN组大鼠每3d分别iv给予AS-OPN(10 μg·L-1)或S-OPN(10 μg·L-1)6 μL·g-1, 吸烟组和对照组给同等剂量的生理盐水,实验持续4个月,然后进行指标的测定.(1)骨代谢生化指标测定:血Ca、血清骨钙素(BGP)和尿Ca/肌酐(Cr).(2)骨密度测定:测量L3～L6各腰椎骨密度、双侧股骨和肱骨的整体骨密度及其7个感兴趣区(ROI)的骨密度.(3)骨形态计量学测定:①静态参数包括骨小梁面积百分数、骨小梁厚、骨小梁数和骨小梁分离度;②动态参数包括荧光周长百分率和破骨细胞计数.(4)骨生物力学测定:① L4椎体压缩试验测量指标包括弹性模量、大载荷、骨大应变和能量吸收.②右股骨三点弯曲试验测量指标包括大载荷、弹性载荷、大挠度和弯曲能量;弯曲弹性模量、大弯曲应力、弯曲刚性系数和弯曲韧性系数.结果 与正常对照组比较,吸烟对照组比较,给予AS-OPN后大鼠的尿Ca/Cr比值降低(0.08±0.01 vs 0.11±0.02);L3, L4, L5, L6各腰椎骨密度升高[27.77±1.38 vs 25.20±1.94;26.80±1.66 vs 24.25±1.48;27.55±1.61 vs 24.20±2.13;26.63±1.17 vs (22.58±1.69) mg·cm-2], 左、右侧股骨骨密度升高[25.39±1.34 vs 23.26±1.16, 26.28±0. 92 vs (23.30±1.38)mg·cm-2];左、右侧肱骨骨密度及其7个ROI的骨密度升高;骨小梁面积百分数、骨小梁厚度、骨小梁数升高 [6.29±0.67 vs (5.13±0.54)%, 55.82±2.78 vs (49.10±4.36)μm, 0.73±0.05 vs (0.64±0.07)mm];骨小梁分离度、破骨细胞计数和荧光周长百分率降低[22.48±0.93 vs (23.58±0.59)mm, 25.33±0.85 vs (16.90±0.84)mm -2, 38.56±1.63 vs (40.32±0.79)%];L4椎体的弹性模量、大载荷、骨大应变和能量吸收升高[951.1±6.6 vs (935.4±10.3)Mpa, 178.9±4.2 vs (174.3±2.5)N, (1.68±0.09)×10 -2 vs (1.57±0.06)×10 -2;201.46± 1.03 vs (199.25±1.47)N·mm];右股骨的大载荷、弹性模量、大挠度和弯曲能量升高[100.59±1.35 vs (98.44±1.21)N, 70.43±0.61 vs (69.26±0.94)N, 1.66±0.06 vs (1.56±0.08)mm, 80.06±1.07 vs (78.54±1.36)N·mm];右股骨的弯曲弹性模量、大弯曲应力、弯曲刚性系数和弯曲韧性系数升高[5.67±0.12 vs (5.52±0.12)Gpa, 168.24±1.00 vs (166.08±1.12)Mpa, 26.14±1.07 vs (24.88±1.13)kN·mm2;17.4±0.9 vs (15.6± 1.0)μm·N-1.给予S-OPN对这些指标改变无明显影响.结论 OPN基因反义寡核苷酸可以抑制吸烟所致骨骼的骨密度、骨量、骨转换、骨结构、骨强度的改变.
-
荧光探针法测定血浆中硫代寡核苷酸PS20的方法初探
目的为解决快速定量测定血浆中硫代寡核苷酸的问题.方法以一个全程硫代修饰的寡核苷酸,PS20为模型序列,用去离子水溶解PS20标准品,通过核酸蛋白分析仪定量,采用猕猴血浆稀释得到7个浓度梯度的血浆样品,再与稀释200倍的Oligreen荧光素Tris-EDTA缓冲液等体积混合.采用荧光高效液相色谱检测含不同浓度PS20的血浆样品.结果采用20 μL体系,所测血浆样品的积分面积和PS20浓度在50～2500 μg·L-1范围内呈良好线性关系,线性相关系数均大于0.997.对方法学的确证表明,荧光素法的线性范围、灵敏度、特异性、精密度和准确度均满足生物分析方法的要求,已经采用该方法成功的测定了PS20在猕猴血浆中的浓度,可以准确定量.结论荧光探针法可以快速定量血浆中硫代寡核苷酸的浓度,满足药代动力学研究的要求.
-
反义寡核苷酸对子宫内膜癌细胞雌激素受体亚型α特异性调控的研究
目的:初步建立子宫内膜癌雌激素受体亚型α(estrogen receptor α, ERα)弱表达细胞模型,探讨ERα在子宫内膜癌发病机制中的作用,研究17β-雌二醇(17β-estradiol, E2)及三苯氧胺(tamoxifen, TAM)在子宫内膜癌发病过程中与ERα的关系。方法:设计针对ERα的反义寡核苷酸 (antisense oligodexyribonucleotides, AS-ODN),转染入子宫内膜癌HEC-1B细胞,Western blot 测定转染后细胞ERα的表达;检测转染反义寡核苷酸后E2和TAM对子宫内膜癌细胞生长影响的变化。结果: (1)针对ERα翻译启动区设计的反义寡核苷酸可以选择性下调ERα的表达。 (2) E2和TAM可以促进子宫内膜癌细胞系HEC-1B的生长。转染ERα-AS-ODN后可抑制E2对子宫内膜癌细胞HEC-1B的促生长作用,这种抑制作用以转染后的24,48及72 h尤为明显。转染ERα-AS-ODN可抑制TAM对子宫内膜癌细胞HEC-1B的促生长作用,这种抑制作用在转染后的48 h为明显。结论: 初步建立了ERα弱表达的子宫内膜癌细胞模型。反义核酸技术可以作为一种有效的特异性下调子宫内膜癌细胞中ERα的实验手段。在HEC-1B细胞中,ERα抑制E2和TAM的促进子宫内膜癌细胞生长的作用。
-
孕激素受体B亚型在子宫内膜癌细胞中的功能
目的:通过反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,AS-ODN)技术特异性下调子宫内膜癌细胞系中孕激素受体亚型B(progestrone receptor isoform B, PR-B),在此基础上观察激素对转染前后细胞作用的改变,了解子宫内膜癌细胞中孕激素受体亚型功能的不同.方法:体外培养高分化子宫内膜癌细胞Ishikawa和中分化子宫内膜癌细胞Hec-1B, 转染PR-B的反义寡核苷酸和正义寡核苷酸及错义寡核苷酸后,提取细胞蛋白,采用Western blot 方法测定各个条件下内膜癌细胞中两种孕激素受体亚型的表达;并在转染PR-B的反义寡核苷酸和正义寡核苷酸及错义寡核苷酸后,用MTT法测定转染前后各种激素对细胞生长作用的改变.结果:转染孕激素受体亚型PR-B的反义寡核苷酸后, 两种细胞系PR-B的表达较非转染组显著下调,孕激素受体亚型A(progesterone receptor isoform A,PR-A)的表达无明显变化.雌激素(17β-estradiol,E2)作用后72 h Ishikawa细胞生长显著高于对照组,Hec-1B细胞较对照组有升高趋势,但差异无统计学意义.孕激素(R5020)作用72 h后对Ishikawa细胞有显著抑制作用,96 h后对Hec-1B细胞有显著抑制作用.在雌、孕激素作用基础上加入米非司酮(mifepristone,RU486),96 h后Ishikawa细胞明显增生,而仅48 h后HEC-1B细胞明显增生.转染PR-B的反义寡核苷酸后,雌激素对内膜癌细胞生长的刺激作用较转染前增强 ,孕激素对细胞的生长抑制作用减弱甚至消失,米非司酮拮抗孕激素的作用较转染前显著降低. 结论:(1)向子宫内膜癌细胞系中转染PR-B的反义寡核苷酸可以下调PR-B的表达,使细胞优势表达PR-A;(2)雌激素可以刺激内膜癌细胞的生长,PR-B可能参与下调雌激素对内膜癌细胞的促生长作用;(3)孕激素在雌激素基础上抑制内膜癌细胞的生长,主要可能通过PR-B起抗内膜癌细胞增生作用;(4)米非司酮有拮抗孕激素抑制子宫内膜癌细胞生长的作用.PR-B可能参与介导了米非司酮拮抗孕激素的作用.
-
反义寡核苷酸减弱转染p16基因对包装细胞生长的抑制
目的:应用p16(MTS1)反义寡核苷酸抑制转染p16逆转录病毒载体后外源性p16基因的表达,减弱p16表达对包装细胞的生长抑制作用.方法:合成p16 cDNA起始密码子区的反义寡核苷酸和正义寡核苷酸,加入筛选的转染p16逆转录病毒载体的包装细胞培养液中,记录各孔中出现细胞克隆的时间和数量,测量各形成细胞克隆的病毒上清滴度.Western blot 检测反义寡核苷酸对外源性P16蛋白表达的影响.MTT法检测加入反义寡核苷酸后对转染的包装细胞生长的影响.结果:p16(MTS1)反义寡核苷酸可以抑制外源性p16基因的表达.加入反义寡核苷酸的包装细胞形成细胞克隆的时间提前,克隆数量和滴度都高于对照组.结论:p16(MTS1)反义寡核苷酸可以抑制外源性p16基因的表达,促进p16逆转录病毒载体转染的包装细胞的生长并提高病毒滴度.
-
含CATTGCT与含CATTCCT核心序列的两种寡核苷酸结合反应特性不完全相同
目的:比较含CATTCCT、CATTGCT核心序列的两种寡核苷酸与鸡骨骼肌核因子的结合反应,分析M-CAT结合活性在鸡发育过程中的表达规律.方法:采用含CATTCCT或CATTGCT核心序列的不同寡核苷酸与发育阶段骨骼肌核抽提物进行胶阻滞实验及竞争反应.结果:胶阻滞实验显示各阶段鸡胚骨骼肌核抽提物与含CATTCCT核心序列的寡核苷酸形成L、H两条DNA-蛋白质阻滞条带,条带于出生后减弱,2周消失;含CATTGCT核心序列的寡核苷酸与第9～13天鸡胚肌核抽提物结合反应形成L′、M′及H′ 3条阻滞带,出生后2周仍检出1条近似M′带的结合活性带;前者结合反应可被含CATTGCT核心序列的寡核苷酸和鸡乙酰胆碱受体γ亚基基因204/50片段(含CATTGCT)竞争消除,但后者结合反应却不能被含CATTCCT核心序列的寡核苷酸完全竞争.结论:两种寡核苷酸除结合共同因子外,不排除特异因子的结合.胶阻滞差异可能与核心序列或侧翼序列不同有关;发育过程存在M-CAT结合因子同工型的置换.
