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基于核心家系的XRCC1基因多态性与鼻咽癌易感性的关联分析
目的 利用以核心家系为基础的关联研究探讨X射线修复交叉互补基因1(XRCC1)多态性与鼻咽癌易感性之间的关系.方法 收集457个广东鼻咽癌核心家系(包含2134名成员)作为研究对象.每一个家系由父母和至少有1名患鼻咽癌的子女构成.采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法对XRCC1基因中3个单核苷酸多态性(SNP)位点(其参考SNP编号分别为rs1799782、rs25489和rs25487)进行基因分型.运用家系为基础的相关性检验(family-based association test,FBAT)软件分析这3个SNP位点基因型及单体型与鼻咽癌易感性之间的关联性.结果 FBAT 分析结果显示:XRCC1基因的3个SNP位点基因型及单体型与鼻咽癌的易感性之间无显著相关性(rs1799782:x2=1.006,P=0.605;rs25489:x2=0.470,P=0.790;rs25487:x2=2.563,P=0.278;单体型:x2=3.004,P=0.557;全局统计).基于显性或隐性模式下,rs25487位点等位基因G或A从亲代传递给子代具有增加或减少的传递(Z=1.985/-1.985,P=0.047);然而,全局统计以及基于累加模式下并没有观察到传递的增加或减少.结论 以家系为基础的相关性研究没有发现XRCC1基因多态性与鼻咽癌的易感性之间具有显著相关性.
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基于改进的DNA连接酶链式反应发现NOD2基因多态性与冠心病的相关性
目的:本研究改进基于脱氧核糖核酸(DNA)连接酶的中低通量基因分型方法,并用此方法进行核苷酸结合寡聚结构域(NOD)样受体基因NOD1和NOD2与冠心病的关联分析.方法:通过多重聚合酶链式反应(PCR)预扩增增加连接模板分子数量,提高特异性连接效率,优化DNA探针设计,摸索连接反应温度、时间、循环圈数及连接酶种类实现等位基因特异性连接,通过荧光掺入PCR和毛细管电泳实现多种等位基因特异性产物一次性检测.Sanger测序验证此方法准确性后,利用此方法对NOD1和NOD2基因上的单核苷酸多态性(SNP)位点在1555例冠心病患者和1887例对照受试者中进行分型和关联分析.结果:通过优化反应条件和等位基因特异性探针设计原则,实现10 ng DNA样本一次性分型30个等位基因多态性位点.基于改进的DNA连接酶中低通量基因分型方法,NOD1、NOD2基因与冠心病的关联分析发现,NOD2基因上rs1861759和rs751271位点在非高血压条件下与冠心病相关(P均<0.05),经Bonferroni多重检验校正后,相关性仍然显著(P均<0.05).结论:本研究优化了DNA连接酶链式反应技术在设计上的关键点,联合使用多重PCR和毛细管电泳,建立了一种高准确性、低成本、满足基于中低通量位点分型的临床分子诊断和科研需求的基因分型新方法,并用该方法发现NOD2基因上的位点rs1861759和rs751271在非高血压条件下与冠心病相关.
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基因芯片结合可环化探针对单碱基突变的检测
目的:将基于连接反应的可环化探针(circularizable oligonucleotide probe, C-probe)技术用于基因芯片对单碱基突变的检测.方法:可环化探针是一种检测核酸分子中单碱基突变的线性寡核苷酸分子,中间部分是通用引物结合区(约40 mer),5′端与3′端是两段与待检测的DNA分子中靶序列互补的目标序列识别区(各约20 mer).与靶序列互补结合后,可环化探针的两个末端在空间靠近并在DNA连接酶的作用下连接形成环状分子,利用荧光分子标记的通用引物对连接产物进行PCR扩增,再利用基因芯片检测荧光标记的PCR产物,从而确定所检测的核苷酸位点的性质.本实验以检测CYP3A4基因外显子5中14 026位点的单核苷酸多态性为例,优化了连接反应、荧光标记通用引物的PCR扩增以及探针杂交检测等条件,并用该方法对合成模板和人基因组DNA标本进行检测.结果:以合成的寡核苷酸序列为模板进行10倍系列稀释,确定可环化探针的检测灵敏度,PCR产物的凝胶电泳结果表明,检测灵敏度达到103拷贝;可环化探针对合成的野生型和突变型模板具有良好的区分效果.用该方法检测人基因组DNA标本,芯片检测结果与测序结果符合,证实了该方法的可行性.结论:连接反应是具特异性的酶促反应,将其与基因芯片技术结合用于单碱基突变检测,有助于简化荧光标记过程,提高检测结果的准确性.
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磷脂酰肌醇-3激酶在石英诱导的DNA双链断裂修复中的作用
目的 探讨磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)在石英致人胚肺成纤维细胞(HELF)DNA双链断裂修复中的作用.方法 用200μg/ml的石英刺激HELF和用显性失活突变体抑制P13K功能的HELF(DN-Δp85)不同时间.免疫印迹法检测磷酸化H2AX(γH2AX)的水平以及DNA依赖性蛋白激酶(DNA-dependent protein kinase,DNA-PK)的组成成分Ku70、Ku8和DNA-PKcs的蛋白水平,并用Image-Pro plus 6.0软件对条带光强度进行半定量分析.中性彗星试验检测DNA双链断裂损伤,用彗尾DNA百分含量值观察DNA双链断裂损伤程度变化,并计算DNA修复能力.结果 γH2AX的水平在石英刺激3 h明显增高,12 h达峰值,24 h下降.与HELF相比,石英诱导的DN-Δp85细胞γH2AX水平增高受到抑制.石英刺激HELF和DN-ΔP85细胞12 h组Ku70、Ku80和DNA-PKcs的蛋白水平(0.58±0.09、0.95±0.21、0.55±0.06,0.37±0.14、0.55±0.17、0.52±0.07)均高于相应的无石英刺激组(0.26±0.10、0.69±0.26、0.43±0.11,0.11±0.07、0.27±0.14、0.39±0.07),差异有统计学意义(P<0.05).与石英刺激HELF 12 h组比较,石英刺激DN-ΔP85 12 h组的Ku70、Ku80蛋白水平增高受到抑制,差异均有统计学意义(P<0.05).石英刺激的HELF12 h组和DN-Δp85 12h组的彗尾DNA百分含量分别为9.78±1.15和11.79±4.90,明显高于同细胞系的无石英刺激组(2.40±0.69,3.31±1.35),差异有统计学意义(P<0.05);与石英刺激HELF 12 h组相比,石英刺激HELF细胞24 h组彗尾DNA百分含量明显降低(4.19±0.47),差异有统计学意义(P<0.05).石英刺激DN-Δp85 24 h组的彗尾DNA百分含量为(7.58±4.32),明显高于无石英刺激DN-Δp85组和石英刺激HELF 24 h组,差异有统计学意义(P<0.05).HELF的DNA修复能力为75.74%,DN-Δp85的DNA修复能力为49.64%.结论 石英可诱导DNA双链断裂损伤,PI3K与DNA损伤修复有关,通过调节Ku70和Ku80的水平,可促进石英诱导的DNA双链断裂损伤的修复.
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连接酶-ELISA反应检测循环DNA基因突变研究
目的 研究一种简便、灵敏的单核苷酸多态性(SNP)分型方法,使其能够在简单实验条件下进行常规的临床样本检测.方法 设计针对突变位点的检测探针,通过检测探针的连接、通用扩增、标记和ELISA反应,根据检测位点对应反应管显色值判定突变位点的基因型.以表皮生长因子受体(EGFR)基因外显子21和18上的3个SNP突变位点L858R、L861Q和G719C为检测对象,对62例肺癌血浆循环DNA样本进行检测,并与直接测序结果进行比较.结果 通过对3个突变位点的检测,2种方法均在L858R位点检出杂合子突变.直接测序法仅能够明确检出2例杂合子突变,另外1例样本因在突变位点出现不明显的套峰而无法明确判定突变类型.而新方法能够明确检出6例杂合子突变.结论 建立了一种基于连接酶-ELISA的简便、灵敏的SNP突变检测方法,适合于在简单实验条件下对不均一样本进行常规突变检测.
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在大鼠局灶性脑缺血再灌注早期DNA修复酶APE/Ref-1表达水平对修复功能的影响
目的:探讨大鼠局灶性脑缺血再灌注早期,皮质和尾壳核中DNA修复酶APE/Ref-1的表达变化情况及其意义.方法:40只SD大鼠单纯随机分为正常组和手术组,其中手术组根据不同时间点分为再灌注6,24和72 h组,每组10只动物.通过苏木精-伊红染色方法观察再灌注早期的损伤情况,采用免疫组化和免疫荧光方法检测APE/Ref-1的表达变化.结果:再灌注6,24,72 h,皮质损伤区域APE/Ref-1的表达分别为(28.9±8.7),(26.5±10.8),(12.8±6.8)个/视野,与正常组(68.1±12.2)个/视野比,均显著下降(F=2 182.92,P＜0.01);尾壳核损伤区域APE/Ref-1的表达分别为(21.3±9.8),(20.6±7.6),(13.5±7.3)个/视野,与正常组(72.4±14.7)个/视野比,均显著下降(F=2 453.79,P＜0.01),并始终维持于较低水平,同时皮质损伤区域细胞胞浆内出现APE/Ref-1的异常表达.结论:再灌注早期DNA修复酶APE/Ref-1表达水平的降低及其在胞浆中的滞留,提示损伤区域DNA修复功能下降,并可能因此促进DNA损伤的积累和发展.
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慢性脑缺血大鼠海马中APE、PCNA的表达与神经细胞凋亡
目的 研究慢性脑缺血大鼠海马中DNA损伤修复相关蛋白脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(APE)、增生细胞核抗原(PCNA)的活性变化及神经元的凋亡情况,并探讨三者之间的相关性.方法 成年雄性Wistar大鼠随机均分为假手术组、持久性双侧颈总动脉结扎(2-VO)1周组、3周组、8周组,用Western blotting检测各组海马组织中APE、PCNA蛋白表达水平,用流式细胞仪检测海马神经元的凋亡程度.结果 2-VO 1周组APE、PCNA蛋白的表达量明显低于对照组(P＜0.01),随着2-VO时间的延长其蛋白表达水平逐渐上升,但仍低于对照组(P＜0.05);慢性脑缺氧大鼠术后1周时海马神经细胞凋亡百分率高为22.66%,以后随时间的延长细胞凋亡数逐渐下降(P＜0.01).结论 慢性脑缺血大鼠早期APE、PCNA活性下降,同时其神经元凋亡率较高,后期蛋白表达水平逐渐上升,神经元的凋亡程度也逐渐下降,表明DNA损伤与修复失衡所致的神经细胞凋亡是慢性缺血性脑损伤发病的重要机制之一.
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RNA干涉Ku70基因增敏伽玛刀治疗大鼠C6脑胶质瘤的实验研究
目的 研究RNA干涉Ku70(Ad-Ku70shRNA)联合伽玛刀治疗对大鼠C6胶质瘤的生长抑制作用.方法 将SD大鼠分为5组(每组12只):对照组、Ad-Ku70shRNA组、空载病毒组、伽玛刀治疗组、Ad-Ku70shRNA联合伽玛刀治疗组(联合治疗组).分别建立大鼠胶质瘤模型模型.建立第10天,对伽玛刀治疗组及联合治疗组大鼠进行伽玛刀治疗,边缘剂量15Gy,治疗后48h,每组处死2只大鼠,行生物学特性检测(增殖、侵袭、凋亡等);其余10只在伽玛刀治疗后1、2、4及8周进行MRI检查.并观察生存期及生存状态.结果 伽玛刀治疗组及联合治疗组与其他三组比较,大鼠肿瘤细胞出现明显的增殖抑制、侵袭性减弱、凋亡率增高,生存期显著延长;联合治疗较单纯伽玛刀的治疗作用明显增强.结论 伽玛刀联合Ad-Ku70shRNA治疗C6荷瘤大鼠,较单纯伽玛刀治疗具有更好的肿瘤细胞抑制作用,可使荷瘤动物生存期明显延长.
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连接酶-ELISA检测K-ras基因突变方法研究
目的 研究一种简便、灵敏的K-ras基因突变检测方法,使其适合于进行常规突变检测.方法 设计对应检测位点寡核苷酸探针,经探针的连接、扩增、标记及ELISA反应,通过ELISA反应检测值确定突变位点基因型.以K-ras基因12位密码子的G12S、G12R、G12C、G12D、G12A、G12V 6个点突变为检测对象,对72例肺癌血浆循环DNA标本进行检测,并与直接测序结果进行比较.结果 利用建立方法共检出3例标本分别存在G12S、G12R、G12A突变.而通过直接测序未能从标本中检出K-ras突变,表明直接测序方法灵敏度较低,不适合于对循环DNA等不均一标本进行突变检测.结论 建立了一种简便、灵敏的K-ras基因突变检测方法,能够对不均一标本进行常规突变检测.
