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寡核苷酸促人牙周膜细胞增殖及成骨分化的实验研究
目的 研究寡核苷酸(ODN)mt01对人牙周膜细胞增殖和向成骨细胞分化的影响,为临床药剂的开发奠定实验基础.方法 采用人离体牙牙周膜细胞作为研究对象,原代培养牙周膜细胞,确定细胞佳铺板浓度后,通过四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法研究ODN mt01对人牙周膜细胞增殖的影响;用碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测ODN mt01影响人牙周膜细胞成骨分化的佳工作浓度.结果 分别作用于人牙周膜细胞24、48、72和96 h,ODN mt01在整个作用过程中均表现出显著的促人牙周膜细胞增殖作用 (P<0.05);与磷酸盐缓冲液(PBS)对照组ALP表达量相比,工作浓度为1.0 mg/L时,ODN mt01可促进人牙周膜细胞表达ALP水平显著升高(P<0.05).结论 适当工作浓度的ODN mt01可以促进体外培养的人牙周膜细胞增殖和成骨分化.
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脂质体Geneshuttle20对STAT6反义核酸转染小鼠脾淋巴细胞影响的研究
目的 探讨阳离子脂质体Geneshuttle20对STAT6反义核酸在小鼠脾淋巴细胞摄入、分布的影响作用.方法 采用阳离子脂质体介导STAT6反义核酸转染小鼠脾淋巴细胞,应用流式细胞仪、荧光显微镜分别观察反义核酸的细胞摄入和胞内分布.结果 反义核苷酸与脂质体(W/W)为2∶4时,细胞摄入率可以达到67.7%,较单独加入反义核酸提高转染效率6倍,细胞内平均荧光强度强,细胞核染色较深.结论 Geneshuttle20提高了细胞对反义寡核苷酸的摄取,促使其进入细胞核内发挥作用.
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反义硫代寡核苷酸对786-O细胞survivin基因的表达及生长抑制作用
目的研究survivin反义寡核苷酸对肾透明细胞癌786-O细胞表达survivin蛋白、细胞凋亡、增殖的影响.方法设计并合成特异性靶向survivin的反义寡核苷酸(ASODN).肾透明细胞癌细胞株786-O分为6组:空白对照组、脂质体转染对照组、正义链转染对照组、200、400 和600 nmol/L ASODN 转染组.作用24 h后收获各组细胞.倒置显微镜及透射电子显微镜观察细胞形态变化,免疫组化法检测各组细胞survivin表达情况和流式细胞术检测各组细胞周期变化和凋亡指数,MTT 法检测survivin反义寡核苷酸对各组细胞的生长抑制率.结果电镜下可以见到典型凋亡样改变,而各对照组细胞生长良好;各ASODN 转染组细胞survivin表达有不同程度减弱;各ASODN 转染组细胞凋亡指数明显高于各对照组(P＜0.05),以600 nmol/L ASODN转染组为明显(P＜0.05),而各对照组间差异无显著性(P＞0.05).结论不同浓度survivin ASODN转染后能下调survivin蛋白表达,诱导肾透明细胞癌786-O细胞凋亡,抑制786-O细胞增殖.
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血管内皮生长因子反义寡核苷核对前列腺癌细胞PC3生长特性的影响
目的 探讨血管内皮生长因子(VEGF)反义寡核苷核对前列腺癌细胞PC3生长特性的影响.方法 采用新型脂质体Oligofectamine携带VEGF反义寡核苷酸转染激素非依赖性前列腺癌细胞PC3,实验分为对照组、反义寡核苷核苷酸组和正义寡核苷酸组.Western Blot杂交的方法 检测细胞VEGF蛋白的表达,四甲基偶氮唑蓝法(MTT)检测细胞增殖变化,流式细胞仪检测细胞凋亡情况.结果 新型脂质体可以携带VEGF反义寡核苷酸转染前列腺癌细胞PC3,与对照组和正义寡核苷酸组比较,反义寡核苷酸组细胞VEGF蛋白的表达明显下降,增殖受到明显抑制,凋亡率增加.结论 新型脂质体Oligofectamine可以携带VEGF反义寡核苷酸成功转染前列腺癌细胞PC3,抑制VEGF的表达,进而抑制肿瘤细胞的增殖,促进其凋亡.
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肿瘤基因治疗学研究:血管内皮生长因子反义寡核苷酸对小鼠Lewis肺癌生长的抑制
目的:探讨血管内皮生长因子(VEGF)反义寡核苷酸(ASPODN)治疗肺癌的可能性.方法:实验于2002-12/2004-05在哈尔滨医科大学第一临床医学院中心实验室完成.制备C57BL/6小鼠皮下肺癌模型30只,随机分为3组(每组10只):VEGF-ASPODN治疗组,VEGF正义寡核苷酸(SPODN)治疗组及对照组.接种Lewis肺癌细胞后24 h内,分别皮下注射AS-PODN及SPODN进行治疗,对照组只注射生理盐水,2次/周,连续4周;观察各组小鼠肿瘤的生长情况、游标卡尺测量肿瘤体积大小.断颈处死小鼠,光镜及电镜下观察肿瘤组织形态学改变及超微结构变化.结果:与对照组瘤质量[(7.83±0.78)g]比较,VEGF-ASPODN组[(4.49±0.43)g]能明显抑制小鼠肿瘤生长(P＜0.01),VEGF-SPODN组[(7.73±0.69)g]则无明显作用(P＞0.05).VEGF-ASPODN组和VEGF-SPODN组抑瘤率分别为42.7%和5.9%.组织形态学及超微结构观察,VEGF-ASPODN能明显抑制肿瘤细胞生长,降低增殖活性.结论:肿瘤原位注射VEGF-ASPODN能抑制小鼠肺癌生长.
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神经元谷氨酸转运体反义寡核苷酸对急性脑缺血损伤大鼠的神经保护作用
目的:测定神经元谷氨酸转运体 (excitafory amino acid carrier l,EAAC1)反义寡核苷酸对急性脑缺血损伤大鼠的神经功能缺损评分、梗死体积和海马数密度值的影响,探讨脑缺血神经保护新方法. 方法:将大鼠分为假手术组、模型组、反义寡核苷酸组 (简称反义组 )和正义寡核苷酸组 (简称正义组 ),用插线法建立大鼠局灶性脑缺血模型 (MCAO).运用 Western blot法、神经功能缺损评分、 TTC染色、尼氏染色观察缺血区 EAAC1表达和 EAAC1反义寡核苷酸对缺血大鼠神经功能缺损评分、梗死体积和海马数密度值的影响. 结果:模型组缺血区 EAAC1表达 (0.61± 0.03)明显高于假手术组 (0.20± 0.01),差异有显著性意义( F=49.49,P< 0.01),而反义组表达 (0.31± 0.01)低于模型组,差异有显著性意义( F=49.33,P< 0.05).反义组大鼠梗死体积( 101.33± 15.08) mm3显著小于模型组( 140.5± 20.27) mm3,差异有显著性意义( F=6.66,P< 0.01),反义组大鼠神经功能缺损评分( 3.33± 0.41)分,显著高于模型组( 1.42± 0.34)分,差异有显著性意义( F=48.51, P< 0.01),海马各区数密度值均高于模型组( P< 0.01和 P< 0.05). 结论: EAAC1反义寡核苷酸对急性脑缺血损伤有神经保护作用.
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肺癌基因治疗新思路:肺癌细胞血管内皮生长因子表达的抑制
目的:探讨硫修饰和脂质体包裹的反义寡核苷酸(ASODN)抑制Lewis肺癌细胞血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor,VEGF)基因表达的效应,减少肺切除导致的呼吸功能衰竭发生的可能性.方法:将经脂质体包裹并部分硫代修饰后的VEGF ASODN,正义寡核苷酸(SODN),错义寡核苷酸(MODN)加入培养的Lewis肺癌细胞中,采用免疫组织化学SP法及RT-PCR技术检测肺癌细胞中VEGF蛋白及VEGFmRNA表达,同时测定各上清液刺激血管内皮细胞生长的受抑情况.结果:VEGF ASODN能明显抑制Lewis肺癌细胞VEGF蛋白及VEGFmRNA的表达,而且可以通过抑制VEGF的表达抑制内皮细胞的生长,并对内皮细胞的抑制作用存在浓度依赖性,5,10,20μmol/L浓度组的内皮细胞生长抑制率分别约为13.77%,48.85%,76.29%.VEGF SODN和VEGF MODN却无此作用.结论:VEGF ASODN抑制肺癌细胞表达VEGF,进而抑制内皮细胞生长,可以成为肺癌基因治疗的一种新的策略.
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血管紧张素Ⅱ受体1反义核酸抑制血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞心钠素合成
目的:探讨血管紧张素Ⅱ受体1反义寡核苷酸(AT1-AS-ODNs)对血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞心钠素合成的生物学效应.方法:实验于2004-07/2005-07在武汉大学人民医院心血管国家重点实验室进行.体外培养乳鼠心肌细胞,将其分为4组:①对照组:无血清Opti-MEM培养48 h.②血管紧张素Ⅱ组:无血清Opti-MEM培养24 h+10-6mo'l/L血管紧张素Ⅱ刺激24 h.③AT1-AS-ODNs组:200nmol/LAT1-AS-ODNs孵育24 h+10-6mol/L血管紧张素Ⅱ刺激24 h.④顺义序列组:200 nmol/L AT1-S-ODNs孵育24h+10-6 mol/L血管紧张素Ⅱ刺激24 h.显微荧光技术检测脂质体包裹的AT1-AS-ODNs在心肌细胞内分布;免疫沉淀法检测血管紧张素Ⅱ受体1,2蛋白表达水平;放射性免疫法检测心钠素(ANF)表达.结果:①在脂质体的包裹下,AT1-AS-ODNs成功转染心肌细胞,120 min转染效率为60%.②血管紧张素Ⅱ组血管紧张素Ⅱ受体1,2蛋白表达水平较对照组低25%,21%(P＜0.05),AT1R-AS-ODNs组血管紧张素Ⅱ受体1蛋白表达水平下调60.7%(P＜0.01),血管紧张素Ⅱ受体2蛋白表达水平无改变.③血管紧张素Ⅱ组心钠素表达明显高于对照组[(780+38),(430±23)μg/L,P＜0.01].AT1-AS-ODNs组心钠素表达为(589±19)μg/L,明显低于血管紧张素Ⅱ组(P＜0.01),顺义序列组与对照组相比差异不显著(P＞0.05).结论:AT1-AS-ODNs可成功转染心肌细胞,通过特异性抑制血管紧张素Ⅱ受体1蛋白表达,拮抗血管紧张素Ⅱ的生物学效应.
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人增生性瘢痕成纤维细胞佳转染条件:α1(Ⅰ)型前胶原基因反义寡核苷酸转染的实验
目的:选择?1(Ⅰ)型前胶原基因反义寡核苷酸转染人增生性瘢痕成纤维细胞的佳条件.方法:实验于2003-10/2004-06在中山大学附属第一医院外科实验室进行.以阳离子脂质体Oligofectamine转染体外培养的第2～6代人增生性瘢痕成纤维细胞,应用荧光显微镜记录荧光素在细胞内的空间分布,用流式细胞术作荧光细胞计数和观察细胞凋亡,通过不同细胞接种数量、反义寡核苷酸浓度和脂质体量转染条件的比较,逐步获得各转染过程中的佳条件.结果:①在6孔板上转染反义寡核苷酸,所用各转染条件未引起细胞凋亡.②其佳转染条件为:接种细胞数量32.25×104/皿,反义核酸浓度150 nmol/L,脂质体量3 ?L/孔;转染后细胞浆和细胞核内均有荧光素聚集.结论:获得?1(Ⅰ)型前胶原基因反义寡核苷酸转染的人增生性瘢痕成纤维细胞的佳转染条件,可为下一步试验提供基础.
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凋亡抑制基因survivin反义寡核苷酸联合bcl-2反义寡核苷酸诱导肺癌细胞株凋亡的实验观察
目的:探讨凋亡抑制基因survivin反义寡核苷酸单用或联用bcl-2反义寡核苷酸对肺癌细胞株的作用,探讨其在抗癌方面的作用.方法:①实验于2002-08/2003-04在蚌埠医学院免疫学实验室完成.将对数生长期NCI-H446细胞分为6组:空白对照组,脂质体10mg/L组(仅加空脂质体),NSODN 500nmol/L组(该3组均为对照组),survivin反义寡核苷酸500 nmoL/L组,bcl-2反义寡核苷酸5 μmol/L,survivin反义寡核苷酸500nmol/L+bcl-2反义寡核苷酸5 μmol/L组(分别在脂质体介导下转染不同寡核苷酸,48h后收取细胞进行以下检测).②在脂质体介导下,以survivin的反义寡核苷酸作用于肺癌细胞株NCI-H446和SPC-A1,于72 h用反转录聚合酶链反应检测survivin mRNA表达.凋亡指数=(静止期/DNA合成前期)占整个细胞周期的百分比;增殖指数=(DNA复制期+合成后期/有丝分裂期)占整个细胞周期的百分比.②survivin反义寡核苷酸单独或联合bcl-2反义寡核苷酸作用NCI-H446后,用四甲基偶氮唑盐法检测细胞生长抑制率并计算两药相互作用指数,锥虫蓝拒染实验检测细胞死亡率.③计量资料差异性比较采用方差分析和q检验.结果:①两种肺癌细胞株皆表达survivin基因.survivin反义寡核苷酸作用细胞株后,出现生长抑制和细胞凋亡,细胞survivin mRNA明显下调,反义寡核苷酸500nmol/L作用72 h后NCI-H446和SPC-A1细胞survivin mRNA抑制率分别达62.72%和67.43%.②四甲基偶氮唑盐法检测结果显示,survivin反义寡核苷酸和bcl-2反义寡核苷酸单独应用对NCI-H446细胞均有生长抑制作用;联合应用survivin反义寡核苷酸和bcl-2反义寡核苷酸的细胞生长抑制率为64.9%,优于单独应用(单用bcl-2反义寡核苷酸为34.2%)(P＜0.01),两药相互作用指数为0.708.锥虫蓝拒染实验显示,survivin反义寡核苷酸500 nmol/L+bcl-2反义寡核苷酸5μmol/L组细胞死亡率为62.1%,高于两药单用时的31.4%和41.4%.流式细胞仪检测凋亡显示,与各对照组相比,survivin反义寡核苷酸和bcl-2反义寡核苷酸均可诱导细胞凋亡,凋亡率分别为43.6%和30.7%,两者联用凋亡率提高到58.6%(P＜0.01).结论:①survivin反义寡核苷酸能抑制肺癌细胞株survivin基因表达,并诱导细胞凋亡和抑制生长.②survivin反义寡核苷酸联合bcl-2反义寡核苷酸具有显著协同抗癌作用.
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STAT3反义寡核苷酸对人肺腺癌放射治疗的增效作用
目的:评价STAT3反义寡核苷酸对人肺腺癌细胞A549增殖抑制作用及辐射增敏作用,探讨新的肺癌分子靶向治疗药物.方法:2003-10/2004-11于解放军第二军医大学放射医学教研室,应用阳离子脂质体介导STAT3反义寡核苷酸转染人肺腺癌A549细胞,western blot检测STAT3总蛋白和p-STAT3蛋白的表达;MTT法检测细胞增殖状态;流式细胞术检测细胞周期;用克隆形成分析和SF2研究人肺腺癌细胞A549辐射敏感性的变化.结果:STAT3反义寡核苷酸转染人肺腺癌A549后STAT3蛋白的表达和磷酸化水平下降,细胞增殖受抑制,出现G1阻滞;照射后12 d,反义寡核苷酸组测定SF2值是(46.78%±3.25%),较对照组(61.52%±2.74%)明显降低(P＜0.01).结论:STAT3反义寡核苷酸可以抑制STAT3蛋白表达和细胞增殖,对人肺腺癌细胞A549有辐射增敏作用.
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核因子κB对血管成形术后平滑肌细胞增殖和新生内膜形成的影响
背景:血管壁机械性损伤后的炎症和增殖效应是血管再狭窄的主要原因.核因子κB/Rel家族中的核因子κB在多种细胞类型中表达,激活一系列与血管壁病理生理相关的靶基因.目的:探讨核因子κB的反义和诱骗性寡核苷酸对血管平滑肌细胞增殖以及大鼠颈动脉球囊损伤后血管新生内膜和单核细胞化学趋化因子的作用.设计:随机对照动物实验.单位:上海交通大学医学院附属瑞金医院心内科.材料:3个月龄雄性SD大鼠126只,350～380 g.引物合成和寡核苷酸合成:根据文献及国际互联网cDNA文库检索、设计,由上海生物工程公司合成;寡核苷酸合成:全硫代修饰,由上海生物工程有限公司合成.方法:实验于2001-05/2003-03在上海交通大学医学院细胞生物学实验室和瑞金医院心血管实验室完成.采用贴块法原代培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞,实验选用3～5代血管平滑肌细胞.检测增殖的平滑肌细胞内增殖细胞核抗原和核因子κB蛋白水平.制作大鼠血管球囊损伤模型.SD大鼠随机分为7组,正常组:除球囊损伤外,其余手术操作同其他组相同;反义组;正义组;诱骗组;Scramble组;反义+诱骗组;模型组.每组分为6个时相点(6 h,1,3,5,7,14 d),每个时相点3只大鼠.检测血管球囊损伤后新生内膜形成以及单核细胞化学趋化因子1、核因子κB p65和ERK2的表达水平.主要观察指标:①核因子κB p65寡核苷酸对血管平滑肌细胞增殖的效应.②核因子κB p65基因表达定位和蛋白合成.③大鼠颈动脉球囊损伤后病理形态学改变.④单核细胞化学趋化因子1 mRNA表达.⑤免疫组织化学检测球囊损伤后血管壁单核细胞化学趋化因子1的蛋白质表达.⑥Western blot检测球囊损伤后血管壁核因子κB p65,ERK2的蛋白合成.结果:①增殖的平滑肌细胞内增殖标记物增殖细胞核抗原表达增加.②增殖的平滑肌细胞浆、细胞核内均有核因子κB p65的基因表达;核因子κB p65蛋白水平增加.观察核因子κB p65基因表达水平,反义核酸组较对照正义组降低53.66%,诱骗性寡核苷酸组较诱骗对照组降低57.35%,差异均有统计学意义(P＜0.05).③核因子κB反义和诱骗寡核苷酸抑制增殖细胞核抗原表达,较阳性对照组分别降低45.12%,45.05%.④大鼠血管球囊损伤后第5天,正义组、诱骗对照组、模型组内膜面积、中膜面积、内膜/中膜比值显著升高(P＜0.05),7 d后达到高峰.反义组、诱骗组显著降低内膜与中膜比值,反义+诱骗组较单独应用无统计学意义的降低效应.⑤反转录-聚合酶链反应显示球囊损伤后6 h,单核细胞化学趋化因子1 mRNA表达明显增加,1 d后表达减少,3,5,7 d单核细胞化学趋化因子1 mRNA持续而明显的表达增强,14 d后略为降低.反义组、诱骗组、反义+诱骗组在各时间点均能减少单核细胞化学趋化因子1 mRNA表达.⑥Western Blot检测显示血管球囊损伤后6 h,核因子κB p65、ERK2蛋白表达微弱,1 d后ERK2蛋白表达略增强,核因子κB的蛋白合成明显增强.7 d后p65,ERK2的蛋白合成达到高峰.第14天,ERK2与p65的蛋白合成较第7天减弱.反义组、诱骗组、反义+诱骗组较模型组、正义组、诱骗对照组各时相点蛋白合成均减弱.结论:增殖的平滑肌细胞核因子κB p65基因表达增加,核因子κB调控单核细胞化学趋化因子1的基因表达和蛋白质水平.血管球囊损伤后,血管平滑肌细胞增殖有动态性变化.局部转染核因子κB反义和诱骗寡核苷酸能抑制所调控靶基因表达.
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核因子κB反义和诱骗寡核苷酸对平滑肌细胞增殖的作用
目的:观察离体血管平滑肌细胞和动物体内转染转录因子核因子κB p65诱骗性寡核苷酸和反义寡核苷酸对平滑肌细胞增殖及大鼠颈动脉球囊损伤后血管新生内膜的干预作用.方法:实验于2001-05/2003-03在上海交通大学医学院细胞生物学实验室和瑞金医院心血管实验室完成.建立大鼠颈动脉球囊损伤模型.SD大鼠126只随机数字表法分为7组,每组18只.正常对照组(除球囊损伤外,其余手术操作与其他组相同),反义组,正义组,诱骗组,诱骗对照组,反义加诱骗联合干预组,模型组.每组又分为术后6 h,1,3,5,7,14 d 6个时相点,每个时相点3只.阳离子脂质体介导的核因子κB p65诱骗性寡核苷酸、反义寡核苷酸转染血管平滑肌细胞及局部定向转送至球囊损伤血管内,观察大鼠颈动脉球囊损伤后5-溴脱氧尿嘧啶掺入试验结果,大鼠颈动脉球囊损伤且转染不同寡核苷酸后的血管增殖标记物检测结果,大鼠颈动脉球囊损伤后核因子κB p65蛋白合成Western Blot检测结果.结果:纳入动物126只,均进入结果分析.①核因子κB的反义寡核苷酸组、诱骗性寡核苷酸组、反义寡核苷酸加诱骗性寡核苷酸组细胞核蛋白增殖细胞核抗原的表达低于阳性对照组,差异均有显著性意义(分别为348.55±39.63,369.05±71.56,309.33±12.86,635.16±89.95,P＜0.05);反义寡核苷酸组低于正义寡核苷酸组,差异有显著性意义(分别为348.55±39.63,752.11±76.43,P＜0.05);诱骗性寡核苷酸组低于诱骗对照组,差异有显著性意义(分别为36905±71 56,818.31±10229,P＜0.05);反义寡核苷酸和诱骗性寡核苷酸联合转染较单独作用显示增强的抗细胞增殖效应趋势,统计学上无差异.②血管球囊损伤后1 d5-溴脱氧尿嘧啶掺入明显高于正常对照组和损伤后6 h[分别为(22.52±0.21)%,(0.02±0.01)%,(4.16±0.22)%,P＜0.05],球囊损伤后3 d较其他时间点5-溴脱氧尿嘧啶表达明显,为(48.71±0.22)%,差异均有显著性意义(P＜0.05).3 d后5-溴脱氧尿嘧啶表达逐渐降低.③球囊损伤后3 d正义组、反义组、诱骗组、诱骗对照组、反义加诱骗联合干预组、模型组增殖细胞核抗原表达明显高于正常对照组,差异均有显著性意义(分别为41.63±4.06,22.57±2.62,21.64±2.98,38.89±6.33,21.06±2.89,41.48±3.09,4.49±0.79,P＜0.01);反义组低于正义组(P＜0.05);诱骗组低于诱骗对照组(P＜0.05);反义加诱骗联合干预组略低于反义组、诱骗组,但无统计学差异;反义组、诱骗组、反义加诱骗联合于预组增殖细胞核抗原表达显著低于模型组,差异均有显著性意义(P＜0.05).④球囊损伤后3 d正义组、反义组、诱骗组、诱骗对照组、反义加诱骗联合干预组、模型组5-溴脱氧尿嘧啶表达明显高于正常对照组,差异均有显著性意义(分别为56.23±2.00,28 97±1.14,26.64±2 89,48.89±2.28,21.06±2.89,51.48±3.09,14.49±0.79,P＜0.05);反义组低于正义组(P＜0.05);诱骗组低于诱骗对照组(P＜0.05);反义加诱骗联合干预组低于反义组、诱骗组,差异有显著性意义(P＜0.05);反义组、诱骗组、反义加诱骗联合干预组5-溴脱氧尿嘧啶表达明显低于模型组,差异均有显著性意义(P＜0.05).⑤大鼠颈动脉损伤7 d后,模型组、正义组、反义组、诱骗对照组、诱骗组、反义加诱骗联合干预组核因子κB p65蛋白表达高于正常对照组,差异均有显著性意义(分别为1.86±0.03,1.67±0.10,1.25±0.01,1.51±0.01,1.41±0.07,1.19±0.02,0.84±0.01,P＜0.05).反义组低于正义组(P＜0.05),诱骗组与诱骗对照组之间无差异.反义加诱骗联合干预组核因子κB p65蛋白表达低于诱骗组(P＜0.05),与反义组相比无统计学差异.反义组、诱骗组、反义+诱骗联合干预组低于模型组,差异有显著性意义(P＜0.05).结论:核因子κB p65诱骗寡核苷酸和反义寡核苷酸均能抑制血管平滑肌细胞增殖.大鼠颈动脉球囊损伤后,血管细胞显示动态的增殖效应.核因子κB p65反义寡核苷酸抑制p65蛋白质生成,诱骗寡核苷酸对核因子κB生成无作用.
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转录因子NF-κB和E2F的decoy寡核苷酸抑制血管平滑肌细胞的增殖
目的:探讨转录因子NF-κB和E2F的decoy寡核苷酸单独或联合应用对猪血管平滑肌细胞增殖的抑制作用及其机制.方法:实验于2004-05/2005-08在瑞金医院内科实验室完成.①原代培养小型猪胸主动脉平滑肌细胞,体外合成转录因子NF-κB和E2F的decoy寡核苷酸,将细胞分为6组:正常对照组、NF-κB decoy寡核苷酸组、E2F decoy寡核苷酸组、NF-κB+E2F decoy寡核苷酸组、NF-κB错配寡核苷酸组、E2F错配寡核苷酸组,以脂质体为载体转染细胞、采用激光扫描共聚焦显微术观察FITC标记的寡核苷酸细胞内定位情况.②各组细胞经同步化处理后,予体积分数为0.1的胎牛血清刺激,采用四甲基偶氮唑盐法检测NF-κB和E2F的decoy寡核苷酸对细胞增殖的抑制作用.③免疫印迹法检测增殖细胞核抗原表达水平.④流式细胞仪碘化丙啶法及磷脂结合蛋白V法分析细胞周期及细胞凋亡情况.结果:①FITC标记的寡核苷酸主要聚集于细胞核内,转染效率为(46.67±5.77)%.②体积分数为0.1的胎牛血清刺激24 h后,NF-κB decoy寡核苷酸组、E2F decoy寡核苷酸组和NF-κB+E2F decoy寡核苷酸组均可明显抑制细胞增殖[(34.96±6.35)%,(38.75±0.14)%,(49.60±5.07)%],并且decoy寡核苷酸组抑制作用普遍强于错配寡核苷酸组,联合应用组作用强于单独应用组(P＜0.01).胎牛血清刺激48 h后NF-κB decoy寡核苷酸组和NF-κB+E2F decoy寡核苷酸组仍可明显抑制细胞增殖[(36.35±5.24)%,(42.60±4.21%)],但E2F decoy寡核苷酸组增殖反而超过正常对照组[(-24.22±9.68)%](P＜0.01).③胎牛血清刺激24 h后NF-κB和E2F的decoy寡核苷酸单独或联合应用组均可降低增殖细胞核抗原的表达.④decoy寡核苷酸使停滞在DNA合成前期的细胞百分数增加,早期凋亡增加.结论:在原代培养的猪的血管平滑肌细胞,NF-κB decoy寡核苷酸和E2F decoy寡核苷酸单独或联合应用可以抑制细胞增殖,但E2F decoy寡核苷酸单独应用只能短期抑制细胞增殖,decoy寡核苷酸抑制作用主要是通过阻碍细胞周期进程、促进细胞凋亡实现的.
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应用完整原位杂交技术检测人食管癌EC9706细胞中胰岛素样生长因子1受体mRNA的表达
目的:探讨人食管癌EC9706细胞中胰岛素样生长因子1受体的表达,及其对反义寡核苷酸胰岛素样生长因子1受体mRNA表达的影响和食管癌发生、转移的意义.方法:实验于2004-09/12在河南省肿瘤病理重点实验窒完成.体外分5组培养人食管癌EC9706细胞,其中4组分别用设计合成的3条封闭胰岛素样生长因子1受体不同基因位点的反义寡核苷酸1～3及1条无关寡核苷酸转染,另一组不转染.采用完整细胞原位杂交技术观察各组EC9706细胞中胰岛素样生长因子1受体mRNA表达情况.结果:①胰岛素样生长因子1受体mRNA在食管癌EC9706细胞中呈阳性表达.②3条胰岛素样生长因子1受体反义寡核苷酸转染组EC9706细胞中胰岛素样生长因子1受体mRNA的表达无差异(2.66±0.21,2.63±0.23,2.65±0.22,P＞0.05),但均显著低于无关寡核苷酸组及无转染组(5.67±2.86,5.02±2 75,P＜0.05).结论:胰岛素样生长因子1受体反义寡核苷酸转染人食管癌EC9706细胞后,可体外抑制EC9706细胞中胰岛素样生长因子1受体mRNA的表达,从而抑制食管癌的发生和转移.为临床预防食管癌的发生、发展和转移提供了理论依据.
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端粒酶反转录酶在长骨造釉细胞瘤中的表达
目的:端粒酶反转录酶作为端粒酶蛋白的主要组分,被称为端粒酶活性作用的限速因子,在细胞增生过程中起重要作用.观察长骨造釉细胞瘤中端粒酶反转录酶的表达及其反义寡核苷酸对其表达和细胞增生的抑制作用.方法:实验于2006-02/2007-04在沈阳市第四人民医院完成.体外培养长骨造釉细胞瘤细胞,在24,48,72 h 后采用链酶亲合素-生物素-过氧化物酶复合物法作端粒酶反转录酶免疫组织化学检测;将2.5,5.0 μmol/L 和10.0 μmol/L 不同浓度的端粒酶反转录酶反义寡核苷酸和正义寡核苷酸分别作用于体外培养的长骨造釉细胞瘤细胞,无寡核苷酸混合液的DMEM液作空白对照,采用免疫组织化学方法检测端粒酶反转录酶的表达;四甲基偶氮唑盐比色法检测在不同浓度的端粒酶反转录酶反义寡核苷酸和正义寡核苷酸作用下,长骨造釉细胞瘤细胞生长活性及其生长抑制率.结果:①体外培养的长骨造釉细胞瘤细胞可表达端粒酶反转录酶,在5.0,10.0 μmol/L 反义寡核苷酸作用下,端粒酶反转录酶的表达明显受抑制,与空白对照组比较,差异有显著性意义(P < 0.01).②端粒酶反转录酶反义寡核苷酸能明显抑制长骨造釉细胞瘤细胞增生活性,并呈剂量依赖性. 结论:一定浓度端粒酶反转录酶反义寡核苷酸能序列特异性地抑制长骨造釉细胞瘤细胞端粒酶反转录酶表达和增生活性.
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反义寡核苷酸在杜氏肌营养不良基因治疗中的应用
杜氏肌营养不良(DMD)是一种致死性X染色体连锁隐性遗传病,发病率高,患者多在30岁左右因心力衰竭和呼吸衰竭而死亡.近年来,在众多对DMD基因治疗方案中,反义寡核苷酸凭借其在肿瘤治疗和病毒控制中显示出的良好应用前景而受到研究人员的关注,他们利用反义寡核苷酸诱导基因中的特异外显子缺失以调控突变基因的表达,以此达到恢复具有功能的抗肌萎缩蛋白表达,并使DMD得到控制和治愈的目的.
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CpG基序的免疫调节作用与过敏性疾病
近来人们发现,细菌DNA和含有非甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤(CpG)基序的某些寡核苷酸具有免疫调节作用,能够诱导辅助性T细胞(Th)1型免疫应答,并抑制Th2型免疫应答.而过敏性疾病是以Th2型免疫应答占优势为主要特征的一类疾病.动物实验及临床研究表明,CpG基序可能对预防和治疗人类过敏性疾病会有一定效果.
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呼吸道病毒基因反义技术的研究进展
反义寡核苷酸是一段与mRNA特异性结合并阻断其基因表达的人工合成的DNA分子,能通过封闭或抑制病毒的关键编码基因特异性地抑制病毒复制.本文以呼吸道合胞病毒和流感病毒为例,对呼吸道病毒特异性反义寡核苷酸的作用位点、序列设计、生物利用度(化学修饰、载体运用等)进行了讨论,以期为抗呼吸道病毒新型药物的研究提供一条新途径.
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抗病毒新途径:TFO切割病毒DNA研究进展
慢性病毒感染性疾病的治疗仍是一个临床难题.近年来对三股螺旋形成寡核苷酸(TFO)的研究表明,TFO与双链DNA结合成三链DNA具有高度的序列特异性,TFO末端经金属配合物(啡咯啉铜、卟啉锰、甲磺酸去铁胺铜、乙二胺四乙酸铁)、细胞毒药物(博来霉素、玫瑰树碱)、同位素(125I、111In)、光敏物质(菲并二氢二恶英、恶唑黄、氨基-P-喹吖啶)、酶激活剂(吲哚并咔唑)等修饰,能显著提高TFO对靶DNA的亲和性和切割能力.目前已对多种病毒核酸分子内三股螺旋结构的形成进行了研究,并有学者试用卟啉锰、氨基-P-喹吖啶化合物修饰的TFO定点切割HIV基因中的靶序列,在体外实验中获得了可喜的成效.但TFO在临床的应用还有许多问题需进一步研究.
