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反义药物的研究进展
反义药物是通过基因复制、转录、剪接、转运、翻译等水平上调节靶基因的表达,干扰遗传信息从核酸向蛋白质的传递,阻止疾病相关蛋白的生物合成,从而发挥其反义作用.本文就反义药物的新进展,从反义药物的作用机制及临床研究两方面进行综述.
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第1个反义药物——福米韦生
福米韦生(fomivirsen)是FDA批准上市的第一个反义药物,由21个硫代脱氧核苷酸组成.通过对人类巨细胞病毒(CMV)mRNA的反义抑制发挥特异而强大的抗病毒作用,用于局部治疗艾滋病(AIDS)病人并发的CMV视网膜炎.疗效维持久,给药次数少,不良反应轻.本文对其药理学和临床研究作一综述.
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结缔组织生长因子反义寡核苷酸体外对人增生性瘢痕成纤维细胞凋亡的影响
目的:观察结缔组织生长因子(CTGF)反义寡核苷酸(ASODN)体外对人增生性瘢痕组织中成纤维细胞凋亡的影响并探讨其可能的作用机制.方法:体外培养的人增生性瘢痕组织中成纤维细胞, 分为CTGF-ASODN 脂质体治疗组(ASODN treatment, AT)、空白脂质体对照组(liposome control,LC) 和空白对照组(control,C),荧光显微镜观察各组CTGF-ASODN时相性分布,流式细胞术检测各组凋亡率随时相的变化,观察Fas受体表达;RT-PCR检测各组CTGF、Fas、 bcl-2 mRNA的表达.结果:AT组细胞转染24 h 后胞质内可见有大量黄绿色荧光,呈离散型、点状分布,而LC 和C 组成纤维细胞内未见荧光.转染24 h后LC组和C组成纤维细胞的凋亡率及Fas受体阳性表达率无显著差异;而AT组凋亡率及Fas受体阳性表达率明显增加,明显高于LC组和C组(P《0.01).RT-PCR结果表明,转染组CTGF mRNA相对表达量明显低于空白对照组(P《0.05),Fas mRNA表达明显高于空白对照组(P《0.01), 转染组bcl-2 mRNA与空白对照组无显著差异.结论:CTGF反义寡核苷酸体外能促进人增生性瘢痕成纤维细胞凋亡,可能与其上调Fas mRNA及其蛋白表达有关.
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VEGF反义寡核苷酸抑制C6胶质瘤细胞VEGF表达的作用和效果
目的:设计了针对VEGF的第Ⅲ外显子(exon,E3)的反义、错义和正义寡核苷酸,观察VEGF反义寡核苷酸抑制C6胶质瘤细胞VEGF表达的作用.方法:免疫细胞化学法观察反义、正义、错义寡核苷酸对C6胶质瘤细胞VE GF表达的影响;观察制备反义、正义、错义寡核苷酸的条件培养液对内皮细胞生长的抑制作用.结果:VEGF反义寡核苷酸对C6胶质瘤细胞VEGF的表达有明显抑制作用.结论:反义VEGF寡核苷酸通过抑制C6胶质瘤细胞VEGF的表达,进而抑制内皮细胞的生长.
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血管内皮生长因子反义寡核苷酸抑制大鼠脑胶质瘤生长
目的:观察血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)反义寡核苷酸对脑胶质瘤的抑制作用.方法:所有大鼠均在立体定向导引下右尾状核区注射含C6胶质瘤细胞1×106的Hank液20 μl,其中实验Ⅰ和Ⅱ组在细胞接种1、2周后分别原位注射1 mmol/L和2 mmol/L的VEGF反义寡核苷酸,对照组则在接种1、2周后原位注射20 μl的Hank液.接种2、3周后给大鼠作磁共振检查,第3周时处死所有的大鼠,观察肿瘤的生长情况,标本常规H-E染色.结果:实验组大鼠有较好的生存状态,而对照组在接种后第2周时开始出现颅内高压,至第3周时大多数大鼠处于濒危状态.实验Ⅰ组、Ⅱ组的抑瘤率分别为 91.5%和100% .结论:原位注射含VEGF反义寡核苷酸能抑制荷瘤大鼠脑胶质瘤生长.
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经小脑延髓池局部应用反义寡核苷酸对脑组织TNF-α表达的影响
目的:观察TNF-α反义寡核苷酸对TNF-α的阻断作用. 方法:用DNA合成仪合成17聚体的TNF-α正义寡核苷酸和反义寡核苷酸.24只犬随机分为对照组和实验组(包括人工脑脊液组、正义链组和反义链组).实验组动物用已建成的颅脑爆炸伤模型装置致伤,伤前经小脑-延髓池分别注入人工脑脊液、TNF -α正义寡核苷酸和TNF-α反义寡核苷酸,比较3组动物脑组织TNF-α mRNA表达的变化. 结果:与人工脑脊液组和正义链组相比,伤前经小脑-延髓池脑内局部应用TNF-α反义寡核苷酸组,颅脑爆炸伤后脑组织内TNF-α mRNA表达量明显减少(P <0.01).结论:经小脑延髓池局部应用反义寡核苷酸可有效阻断颅脑爆炸伤后脑组织TNF-α的表达.
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应用c-myc反义寡核苷酸防治自体静脉移植物内膜增生的实验研究
目的:研究局部应用反义寡核苷酸c-myc对自体静脉移植物内膜增生的防治作用,为反义技术防治血管内膜增生的早期临床应用提供实验依据.方法:30只新西兰兔颈外静脉间置于同侧颈总动脉后随机分成对照组、蛋白胶组、正义组、反义组及错配组,以医用生物蛋白胶分别溶解反义、正义及错配的c-myc基因片段(330μg)后直接涂于静脉移植物外膜.术后28 d取材制片,显微镜进行形态观察,并用计算机图像分析系统测量和计算内膜厚度、中膜厚度及二者之比值,内膜面积、中膜面积及二者之比值,以q检验行统计学分析.结果:反义组增生内膜厚度较对照组降低36.77%,内膜面积降低48.22%,对照组、蛋白胶组、正义组及错配组间内膜厚度及内膜面积均无明显差异(P>0.05);各组间中膜厚度及中膜面积均无明显差异(P>0.05).结论:医用生物蛋白胶携载反义寡核苷酸c-myc局部用于静脉移植物外膜能显著防治其内膜增生,有效防止管腔狭窄.
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TNF-α反义寡核苷酸对颅脑爆炸伤后脑组织含水量的影响
目的:探讨TNF-α反义寡核苷酸对颅脑爆炸伤后脑组织含水量的影响.方法:18条犬随机分为人工脑脊液组(ACSF)、正义链组和反义链组,利用已建成的颅脑爆炸伤模型装置致伤,伤前经小脑-延髓池分别注入ACSF、TNF-α正义寡核苷酸和TNF-α反义寡核苷酸,比较3组动物脑组织含水量的变化.结果:伤前经小脑-延髓池脑内局部应用TNF-α反义寡核苷酸组,颅脑爆炸伤后脑组织内含水量较ACSF组和正义链组明显减少(P<0.05).结论:TNF-α反义寡核苷酸可以减轻颅脑爆炸伤后脑水肿.
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bcl-2 mRNA反义寡核苷酸对胃癌SGC-7901细胞端粒酶活性的影响
目的探讨bcl-2反义寡核苷酸(antisense phosphorothioate oligodeoxynucleotide,ASODN)对胃癌SGC-7901细胞端粒酶活性的影响.方法应用脂质体瞬时转染法介导bcl-2反义寡核苷酸,处理人胃癌细胞系SGC-7901后,分别采用Northem blot、Westem blot检测bcl-2 mRNA、蛋白表达,用端粒微孔板杂交法检测端粒酶活性.结果bcl-2 ASODN处理的胃癌SGC-7901细胞端粒酶活性明显受到抑制,并与ASODN的浓度和处理时间有关.结论bcl-2反义寡核苷酸可抑制胃癌细胞端粒酶活性.
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两种新型抗HSV药物的进展
近年来发现4-氧代二氢喹啉类和含有非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸序列的寡脱氧核苷酸为抗单纯疱疹病毒的新药.多项研究表明,4-氧代二氢喹啉类有良好的口服利用率及中等程度的血浆清除率,不仅对核苷酸聚合酶产生抑制,还可以抑制细胞内的病毒复制.含有非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸序列的寡脱氧核苷酸不直接抑制病毒感染细胞,而是通过刺激免疫系统来起作用.两种药物经研究证明对HSV有良好的抑制作用.
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反义核酸技术及其在皮肤科的应用
针对各种癌基因、功能蛋白、生长因子及其受体设计的反义寡核苷酸已有效用于调控致病或异常基因表达,成为治疗各种疾病包括各种皮肤病的有效手段.综述了近年来反义核酸技术在皮肤病基础研究和临床研究的新进展,特别是反义寡核苷酸体内外的稳定性、细胞通透性、透皮性、临床应用方面的新研究结果.并对这一领域存在的问题进行了总结,展望了这一技术的应用前景.
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环氧合酶-2反义寡核苷酸对Colo-16细胞增殖及环氧合酶-2表达的影响
目的 研究环氧合酶(COX)-2反义寡核苷酸(AsODN)对人皮肤鳞状细胞癌细胞株Colo-16细胞体外增殖的抑制作用及COX-2表达的影响.方法 人工合成COX-2 AsODN,利用脂质体将不同浓度(50,100,200,400 nmol/L)反义寡核苷酸转染入Colo-16细胞,免疫荧光显微镜观察转染情况;采用噻唑蓝(MTT)法检测Colo-16细胞的增殖情况;Western印迹及半定量逆转录PCR检测Colo-16细胞COX-2蛋白和mRNA表达水平.结果 不同浓度的COX-2 AsODN对Colo-16细胞体外增殖均具有抑制作用(P<0.05).400 nmol/L反义组在48 h抑制率高,达60.3%;COX-2 AsODN转染Colo-16细胞后,COX-2蛋白和mRNA表达明显下调,50、100、200、400 nmol/L组COX-2蛋白灰度值分别为0.763±0.070、0.600±0.065、0.430±0.074、0.251±0.045,与阴性对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05);COX-2 mRNA表达量随COX-2 AsODN浓度的增加而减少,50、100、200、400 nmol/L组COX-2 mRNA灰度值分别是0.778±0.025、0.602±0.041、0.417±0.031、0.297±0.051,各组间COX-2 mRNA表达差异有统计学意义(F=132.48,P<0.01).结论 COX-2 AsODN对Colo-16细胞的体外增殖有抑制作用,并能下调COX-2蛋白及其mRNA在Colo-16细胞中的表达,提示COX-2 AsODN有潜在治疗皮肤鳞状细胞癌的作用.
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角蛋白17反义寡核苷酸对银屑病SCID小鼠模型的作用
目的 建立重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠银屑病动物模型,观察角蛋白17(K17)反义寡核苷酸(ASODN)对银屑病动物模型的作用.方法 将斑块状银屑病患者的皮损移植于SCID小鼠,构建银屑病SCID小鼠模型.然后分别以脂质体介导的K17 ASODN、正义寡核苷酸(SODN)及单纯乳剂基质作用于皮损,大体及H-E染色观察皮损改变,RT-PCR以及免疫组化检测K17的变化.结果 成功构建了SCID小鼠银屑病动物模型:与SODN组及单纯乳剂基质对照组相比,K17 ASODN治疗组皮损炎症恢复明显加快,组织学评分显著降低(P＜0.01),K17 mRNA水平以及蛋白表达水平也均有不同程度降低.结论 K17 ASODN能够显著改善SCID鼠移植模型的银屑病病理改变,有望成为一种新的治疗措施.
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反义寡核苷酸抑制人恶性黑素瘤A375细胞乙酰肝素酶mRNA及其蛋白的表达
目的 研究乙酰肝素酶反义寡核苷酸(ASODN)对人恶性黑素瘤A375细胞乙酰肝素酶mRNA及其蛋白表达的影响.方法 分空白组、无关序列(N-ODN)组和反义(ASODN)组,以脂质体包埋后分别转染人恶性黑素瘤细胞株A375,采用原位杂交、免疫组化法检测乙酰肝素酶mRNA及其蛋白表达的变化.结果 转染24 h后,ASODN组A375细胞乙酰肝素酶mRNA表达较对照组、N-ODN组均显著下调(P均＜0.01);转染48 h后,与对照组、N-ODN组相比,ASODN组A375细胞的乙酰肝素酶蛋白水平均显著下降(P均＜0.01).结论 乙酰肝素酶ASODN可下调A375细胞乙酰肝素酶mRNA及其蛋白的表达.
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角质形成细胞生长因子受体反义寡核苷酸对HaCaT细胞增殖的影响
目的研究角质形成细胞生长因子受体反义寡核苷酸(KGFR ASODN)对角质形成细胞生长因子(KGF)促HaCaT细胞增殖效应的抑制作用.方法HaCaT细胞体外培养,采用绘制生长曲线、MTT实验、集落形成实验研究KGFR ASODN对KGF促增殖效应的抑制作用.采用流式细胞仪研究KGFRASODN对KGFR表达的影响.结果反义序列1和反义序列2均可抑制HaCaT细胞的生长速度(P＜0.05).高于0.25μg/mL质量浓度反义序列1和反义序列2均可抑制KGF介导的HaCaT细胞增殖(P＜0.05).高于0.25μg/mL质量浓度反义序列1和反义序列2都可抑制KGF诱导的HaCaT细胞集落形成(P＜0.05).HaCaT细胞存在KGFR基础表达,高于0.25μg/mL质量浓度反义序列1和反义序列2均可抑制HaCaT细胞KGFR表达(P＜0.05),抑制率呈浓度依赖性,正义序列核苷酸(S-ODN)对KGFR表达无抑制作用(P＞0.05).结论KGFR ASODN可有效抑制KGFR表达,进而抑制KGF介导的HaCaT细胞过度增殖.
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K17反义寡核苷酸对角质形成细胞增殖和K17表达的影响
目的 研究脂质体介导角蛋白17(K17)反义寡核苷酸对培养人角质形成细胞增殖和K17表达的影响.方法 利用脂质体将人工合成的正义、反义及错配K17寡核苷酸基因片段导入体外培养的人角质形成细胞系HaCaT,应用MTT法检测其对HaCaT细胞增殖的影响,以逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测K17 mRNA水平的变化,并以蛋白质印迹法、免疫荧光细胞化学结合激光扫描共聚焦显微镜检测K17蛋白水平的改变.结果 脂质体介导的K17反义寡核苷酸转染HaCaT细胞后,细胞增殖受到明显抑制,同时细胞中K17 mRNA和蛋白的表达明显下降,而正义寡核苷酸组、错义寡核苷酸组及空白对照组均无明显变化.结论 应用反义技术封闭K17基因,可以阻遏角蛋白K17基因和蛋白的表达,抑制角质形成细胞的体外生长和增殖能力.
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核因子-κB反义寡核苷酸抑制紫外线诱导的HaCaT细胞反义分泌白介素6
目的探讨核因子-κB(NF-κB)反义寡核苷酸转染体外培养的HaCaT细胞反义株HaCaT后,对紫外线(UV)诱导的HaCaT细胞反义分泌炎症因子白介素6(IL-6)的抑制作用.方法蛋白质印迹方法测定不同剂量中波紫外线(UVB)辐射HaCaT细胞反义后NF-κB p65的变化;逆转录-聚合酶链反应测定NF-κB p65反义寡核苷酸转染后p65 mRNA表达的变化;酶联免疫吸附测定法测定NF-κB p65反义寡核苷酸转染后紫外线辐射的HaCaT细胞反义分泌IL-6水平.结果 10、20、30 mJ/cm2UVB辐照HaCaT细胞反义后均可显著促进NF-κB p65表达(P＜0.05),不同浓度的NF-κB p65反义寡核苷酸转染后对30mJ/cm2 UVB诱导的p65 mRNA表达和IL-6分泌均有显著抑制作用(P＜0.05).结论脂质体介导的NF-κB p65反义寡核苷酸转染HaCaT细胞反义,可以抑制UV辐射诱导的HaCaT细胞反义产生IL-6,表明UV诱导HaCaT细胞反义产生IL-6可能是通过UV激活NF-κB p65的表达产生的.
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hTERT反义寡核苷酸抑制Hut78细胞端粒酶活性及诱导细胞凋亡的研究
目的探讨人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因反义寡核苷酸对皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)细胞株端粒酶活性及细胞生长的影响,为CTCL基因治疗提供新的基因靶点.方法采用脂质体介导的基因转染方法,将不同浓度(10μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L)的寡核苷酸分别导入CTCL细胞株Hut78中;分别于不同的时间,应用端粒酶重复序列扩增及酶联免疫吸附方法(PCR-ELISA)、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、流式细胞仪技术等动态观察转染细胞中端粒酶活性、hTERT mRNA表达以及细胞凋亡的变化.结果经hTERT反义寡核苷酸(AODN)作用72 h后,细胞端粒酶的活性明显下降,hTERT mRNA的表达减弱,并可观察到细胞凋亡,凋亡细胞发生率为13.05%.细胞生长抑制作用有明显的时效性,以30μmol/L、72 h时下降明显.而有义寡核苷酸(SODN)组和对照组以上指标均无明显变化(P＞0.05).结论hTERT反义寡核苷酸可显著抑制CTCL细胞的端粒酶活性,抑制细胞生长增殖,诱导细胞凋亡.
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反义寡核苷酸阻遏角蛋白14的表达
目的研究脂质体介导角蛋白K14反义寡核苷酸(ASODN)阻遏人角质形成细胞K14基因和蛋白的表达及抑制体外增殖活性的效果.方法人表皮角质形成细胞原代培养,3～10代用于实验,利用脂质体将人工合成的正义、反义及错配K14寡核苷酸基因片段导入角质形成细胞,应用流式细胞仪、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组化(SABC)方法检测反义寡核苷酸对角质形成细胞的细胞周期、K14基因和蛋白表达的影响.结果脂质体介导的K14反义寡核苷酸转染角质形成细胞后,能有效地抑制角质形成细胞中K14基因的表达;48 h后可阻遏K14蛋白表达;流式细胞仪检测见反义寡核苷酸处理组细胞周期发生明显改变,G1期细胞百分率上升,S期细胞百分率下降.而正义寡核苷酸组、错义寡核苷酸组及空白对照组均无此变化.结论应用反义技术封闭K14基因,可以阻遏角蛋白K14基因和蛋白的表达,并可以抑制体外培养的角质形成细胞的增殖.
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125I标记三链形成寡核苷酸对肝癌细胞生长的抑制作用
目的 探讨125I标记的三链形成寡核苷酸(TFO)对肝癌细胞的抑制作用,为HBV相关肝细胞癌(HCC)的基因治疗提供实验依据.方法 合成能与HBV前S基因特异结合的TFO,并以125I标记(125I-TFO);分125I-TFO、等量TFO、相同活度125I和空白对照4组与HepG2.2.15细胞共同培养,通过ELISA法检测培养前后各组细胞上清中乙型肝炎e抗原(HBeAg)和乙型肝炎表面抗原(HBsAg)含量的变化,以四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测各组细胞存活率.结果 125I-TFO标记率＞93%,稳定性较好,37℃放置12 h放化纯90.8%,48 h 81.1%,72 h 73.2%;125I-TFO组在转染48 h对HepG2.2.15细胞合成HBeAg及HBsAg的抑制作用强,对HBeAg和HBsAg表达的抑制率(74.5%和45.2%)及细胞杀伤率[72 h田胞增殖抑制率为(31.6±2.5)%]高于其他实验组(P＜0.01).结论 125I-TFO可以抑制HBV抗原表达,杀伤肝癌细胞,为制备抗HBV、抗HCC的放射性基因治疗药物提供依据.
