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翻白草含药血清对高糖培养肾小管上皮细胞增殖作用及其对RhoA/ROCK信号通路的影响
目的:探讨翻白草含药血清对高糖培养小鼠肾小管上皮细胞增殖及其对转分化机制的影响.方法:制备各组大鼠含药血清;10％胎牛血清(FBS)-RPMI 1640培养基培养小鼠肾小管上皮细胞,传代培养后按3 000个/孔接种于96孔培养板,分为正常组、高糖组、厄贝沙坦组及翻白草组;加入相对应6％含药血清的高糖RPMI 1640培养基;培养12,24,48,60 h时分别观察各组细胞形态,并应用噻唑蓝(MTT)比色法检测各组吸光度A;高糖培养24 h后应用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组肾小管上皮细胞小G蛋白(RhoA),Rho蛋白激酶1(ROCK1),α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和钙黏附蛋白-E(Ecadherin)蛋白表达情况.结果:高糖培养后肾小管上皮细胞由扁平不规则的多角形变为长梭形;加入相应含药血清干预后细胞呈扁平不规则的多角形;与正常组比较,12 h时高糖组肾小管上皮细胞呈明显增殖状态(P＜0.05),24,48,60 h时增殖显著(P＜0.01);与高糖组比较,12 h时翻白草组能抑制肾小管上皮细胞增殖(P＜0.05),24,48,60 h时翻白草组抑制肾小管上皮细胞增殖作用显著增强(P＜0.01);与厄贝沙坦组比较,48,60 h翻白草组能抑制肾小管上皮细胞增殖(P＜0.05);与模型组比较,翻白草组E-cadherin蛋白表达显著增加,RhoA,ROCK1和α-SMA蛋白表达显著减少(P＜0.01).结论:翻白草含药血清可以抑制高糖培养的肾小管上皮细胞增殖、抑制肾小管上皮细胞转分化,可能与RhoA/ROCK信号通路有关.
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丹参酚酸B盐对TGF-β1诱导的HK-2上皮-间充质转分化的影响
目的:研究丹参酚酸B盐(salvianolic-acid B,SA-B)对转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)诱导的人肾小管上皮细胞HK2(human human renal proximal tubular cells)转分化的影响.方法:复苏并传代培养HK2细胞,应用不同剂量的TGF-β1或同一剂量作用不同时间诱导HK2细胞发生上皮-间充质转分化(epithelia-mesenchymal transition,EMT),同时给予骨形成蛋白7(BMP-7,阳性对照)(50μg·L~(-1))和SA-B(1×10~(-5)mol·L~(-1))干预观察二者对EMT的影响.应用Western印迹法和免疫荧光法检测HK2细胞E-钙黏蛋白(E-cadherin),α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达.结果:BMP-7显著抑制了TGF-β1诱导的E-cadherin下调(P<0.05)和α-SMA上调(P<0.05);而SA-B显著抑制TGF-β1诱导的α-SMA表达增加(P<0.05),未见其抑制TGF-β1诱导的E-钙黏蛋白下调.结论:SA-B和BMP-7能够抑制TGF-β1诱导的HK2上皮-间充质转分化,其共同的作用是抑制了TGF-β1诱导的α-SMA上调,而SA-B对E-钙黏蛋白的调控作用有待进一步的研究.
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低剂量雷公藤甲素抑制Wnt3α/β-catenin信号通路活性改善高剂量D-葡萄糖诱导的足细胞转分化
探讨雷公藤甲素(triptolide,TP)改善高剂量D-葡萄糖(高糖)诱导的足细胞上皮-间充质转分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的作用和分子机制.将体外培养的小鼠永生化足细胞分为正常组(normal group,N)、高剂量D-葡萄糖组(high dose of D-glucose group,H-TP)、低剂量TP组(low dose of TP group,L-TP)、高剂量TP组(high dose of TP group,H-TP)以及甘露醇组(mannitol group,MNT),分别进行不同的干预:N组加入D-葡萄糖(D-glucose,DG,5 mmol·L-1);HG组加入HG(25mmol· L-1);L-TP组加入HG(25 mmol·L-1)+ TP(3 μg·L-1);H-TP组加入HG(25 mmol·L-1)+ TP(10 μg·L-1);MNT组加入DG(5 mmol·L-1)+ MNT(24.5 mmol·L-1).在干预后的各时间点(24,48,72 h),首先,观察TP对足细胞增殖活性的影响;其次,检测足细胞上皮细胞标志性分子(nephrin和podocin)、间充质细胞标志性分子(desmin和Ⅰ型胶原)以及EMT相关介质snail的蛋白表达水平;后,检测足细胞Wnt3α/β-eatenin信号通路关键信号分子Wnt3α和β-catenin蛋白表达水平.结果表明,HG不仅能引起足细胞nephrin和podocin蛋白低表达,desmin,Ⅰ型胶原和snail蛋白高表达,诱导足细胞EMT,而且,能促使足细胞Wnt3α和β-eatenin蛋白高表达,激活Wnt3α/β-catenin信号通路.此外,L-TP对足细胞增殖能力没有影响,与HG联合干预不仅能明显恢复足细胞nephrin和podocin蛋白表达水平,抑制其desmin,Ⅰ型胶原和snail蛋白表达水平,改善足细胞EMT,而且,能明显降低HG诱导的足细胞Wnt3α和β-catenin蛋白高表达,抑制Wnt3α/β-eatenin信号通路活性.总之,HG在体外能激活Wnt3α/β-catenin信号通路而诱导足细胞发生EMT;L-TP在体外能明显抑制Wnt3α/β-catenin信号通路活性而改善足细胞EMT,这可能是其干预足细胞EMT的作用和分子机制之一.
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Notch信号转导通路在原代肝星状细胞体外培养活化中的作用
目的 探讨Notch信号转导通路在肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)体外培养活化中的作用.方法 采用两步酶灌注法分离培养原代大鼠HSC并进行体外培养.激光共聚焦显微镜检测体外培养HSC第1天和第7天时形态、胞内维生素A、静止标志胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和活化标志α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的变化.采用RT-PCR和Western blot检测HSC体外培养0天、3天和7天时上皮-间充质转分化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)相关分子α-SMA、Ⅰ型胶原(collegen Ⅰ)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、蜗牛家族转录抑制因子1(snail family transcriptional repressor 1,Snail 1)等和Notch信号转导通路(受体Notch 1、Notch 2、Notch 3、Notch 4与靶基因Hes1、Hey1、Hey2、HeyL)的变化.使用Notch受体阻断剂DAPT干预后,检测体外培养的HSC中活化相关分子(α-SMA、CollegenⅠ、N-cadherin和Snail 1等)的改变.结果 ①初分离的HSC经7天体外培养后逐渐向肌成纤维细胞(myofibroblasts, MFs)样转化,表现为形态变长、维生素A水平和GFAP表达降低,α-SMA表达升高.②RT-PCR与Western blot结果表明,HSC体外培养存在自发EMT现象,表现为α-SMA、CollegenⅠ、N-cadherin和Snai l表达上调及E-cadherin、CK7、CK19和Desmoplakin表达下调,同时Notch 2、Notch 3及Notch靶基因Hey2、HeyL表达逐渐增加.③使用DAPT后,可显著抑制原代HSC体外活化,表现为α-SMA、CollegenⅠ、N-cadherin和Snail 1的下调及E-cadherin、CK 7、CK 19和Desmoplakin转录或蛋白表达水平上调.结论Notch信号转导通路的激活可能参与HSC的活化,可能是抗肝纤维化治疗的潜在靶点.
关键词： 细胞分离 肝纤维化 上皮-间充质转分化 肝星状细胞 Notch信号转导通路 -
长链非编码 RNA-MALAT1在高糖诱导的人腹膜间皮细胞纤维化过程中的作用
目的：探讨长链非编码 RNA（lncRNA）-MALAT1在人腹膜间皮细胞（HPMCs）高糖损伤导致的腹膜纤维化中的作用。方法将永生化的 HPMCs 分为对照组及高糖（50 mmol／L 葡萄糖）刺激1、3、5、7 d 组，使用实时荧光定量 PCR 及 Western 印迹方法，检测 MALAT1、表型转换及纤维化相关分子 E-钙黏素（E-cad）、ɑ-平滑肌肌动蛋白（ɑ-SMA）、胶原蛋白 I（ColⅠ）、胶原蛋白Ⅲ（Col Ⅲ）、纤连蛋白（Fn）、结缔组织生长因子（CTGF）在 mRNA 及蛋白水平的表达变化；给予 HPMCs 转染MALAT1的过表达慢病毒，检测 MALAT1、表型转换及纤维化相关分子 E-cad、ɑ-SMA、ColⅠ、ColⅢ、Fn、CTGF 在 mRNA 及蛋白水平的表达变化；给予高糖刺激72 h 后的 HPMCs 转染 MALAT1siRNA，再检测以上成分的 mRNA 及蛋白水平的表达变化。采用 SPSS 18．0统计软件进行数据分析。结果高糖刺激 HPMCs 后，随时间的延长，MALAT1及间质标志分子ɑ-SMA、纤维化相关分子 ColⅠ、ColⅢ、Fn、CTGF 的表达明显增加与对照组比较差异有统计学意义（mRNA 水平 MALAT1、α-SMA、ColⅠ、ColⅢ、Fn、CTGF 第7天时分别为 t ＝7．080、t ＝6．325、t ＝7．205、t ＝11．70、t ＝5．739、t ＝9．221，P ＜0．05；蛋白水平α-SMA、ColⅠ、ColⅢ、Fn、CTGF 第7天时分别为 t ＝3．429、t ＝3．846、t ＝5．274、t ＝3．751、t ＝4．093，P ＜0．05），上皮标志分子 E-cad mRNA 及蛋白水平表达逐渐下降（第7天时 mRNA t ＝7．270、P ＝0．0019，蛋白水平 t ＝5．658、P ＝0．0048）；慢病毒转染使 MALAT1上调后，MALAT1、ɑ-SMA、ColⅠ、ColⅢ、Fn、CTGF 的表达增加（mRNA 水平 MALAT1α-SMA、ColⅠ、ColⅢ、Fn、CTGF 分别为 t ＝7．151、t ＝6．495、t ＝6．068、t ＝8．660、t ＝5．283、t ＝3．230，P ＜0．05；蛋白水平α-SMA、ColⅠ、ColⅢ、Fn、CTGF 分别为 t ＝3．980、t ＝3．623、t ＝3．351、t ＝4．965、t ＝5．804，P ＜0．05），E-cad 表达下降（mRNA 水平 t ＝5．511，P ＝0．0053；蛋白水平 t ＝6．397，P ＝0．0031）；使用 siRNA 下调 MALAT1后， MALAT1、ɑ-SMA、ColⅠ、ColⅢ、Fn、CTGF 的表达下降（mRNA 水平 MALAT1、ɑ-SMA、ColⅠ、ColⅢ、Fn、CTGF 分别为 t ＝2．854、t ＝5．511、t ＝3．442、t ＝2．442、t ＝4．407、t ＝6．556，P ＜0．05；蛋白水平ɑ-SMA、ColⅠ、ColⅢ、Fn、CTGF 分别为 t ＝3．241、t ＝7．589、t ＝7．427、t ＝4．319、t ＝3．976，P ＜0．05）， E-cad 表达增加（mRNA 水平 t ＝2．865、P ＝0．0457；蛋白水平 t ＝2．823、P ＝0．0477）。结论MALAT1参与高糖刺激所引起的 HPMCs 的纤维化过程，并且可以促进腹膜纤维化的发生。
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α-酮戊二酸钠对转化生长因子β1诱导的HK-2细胞上皮-间充质转分化的影响
目的 探讨α-酮戊二酸钠对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的HK-2细胞上皮-间充质转分化(EMT)的影响.方法 TGF-β1 0.5,2和5μg·L-1分别作用于葡萄糖5和30 mmol· L-1培养的HK-2细胞72 h,通过RT-PCR法检测EMT标志物E-钙黏着糖蛋白和波形蛋白mRNA表达的变化,以选择EMT病变模型的佳诱导条件.在此基础上,观察α-酮戊二酸钠10,100和500 μmol·L-1对HK-2细胞EMT病变及G蛋白偶联受体80( GPR80) mRNA表达的影响.结果 ①在葡萄糖5和30 mmol·L-1条件下,当TGF-β1为5μg·L-1时,与对照组比较,E-钙黏着糖蛋白mRNA的降低和波形蛋白mRNA的升高明显(P＜0.01),表明HK-2细胞发生了典型的EMT病变；②选择TGF-β1 5μg·L-1和葡萄糖30 mmol·L-1制备EMT病变模型,同时加入α-酮戊二酸钠100和500 μmol· L-作用72 h,与模型组比较,E-钙黏着糖蛋白mRNA明显升高,波形蛋白mRNA明显降低,GPR80 mRNA表达增加(P＜0.01),表明α-酮戊二酸钠可逆转HK-2细胞EMT的发生.结论 在葡萄糖5和30 mmol·L-1培养条件下,TGF-β1 5μg·L-1作用72 h,HK-2细胞可出现典型的EMT病变；α-酮戊二酸钠对该病变具有抑制作用.
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黄芩苷对人肾小管上皮细胞转分化的影响
目的:观察不同浓度的黄芩苷对TGF-β1诱导的人近端肾小管上皮细胞(HK-2)细胞转分化的影响.方法:以5 ng/ml的TGF-β1作用HK-2不同的时间(0、12、24、48和 72 h),用RT-PCR法检测α-平滑肌肌动蛋白、E-钙黏蛋白基因表达情况.以40、80、160、320 μmol/L浓度的黄芩苷与5 ng/ml TGF-β1共孵育48 h,每12 h在倒置显微镜下观察细胞形态.结果:黄芩苷干预后可抑制HK-2梭形变,抑制α-平滑肌肌动蛋白基因表达,上调E-钙黏蛋白基因表达,且在一定范围内呈剂量依赖性.结论:一定浓度的黄芩苷在体外有阻滞TGF-β1诱导的HK-2细胞转分化作用.
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针对Twist的短发夹RNA抑制A549细胞上皮-间充质转分化及体外侵袭
背景与目的:上皮-间充质转分化在胚胎发育和肿瘤转移过程中起重要作用.在发现人肺腺癌A549细胞高表达转录因子Twist的基础上,本实验研究了针对Twist的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)对体外培养的人肺腺癌A549细胞上皮-间充质转分化和体外侵袭能力的影响.方法:构建能表达针对Twist mRNA的shRNA的阳性RNA干扰(RNAi)质粒和表达不针对任何已知mRNA的shRNA的阴性RNAi质粒,分别转染至A549细胞,新霉素抗性筛选得到Twist表达受抑制的阳性RNAi细胞(Pi组)和Twist表达未受影响的阴性RNAi细胞(Ni组).针对正常(C组)、Pi、Ni三组A549细胞,分别采用RT-PCR和Western blot技术检测Twist、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和E-钙粘素表达,用Boyden小室模型检测细胞体外侵袭能力.结果:C组:Twist和α-SMA表达强阳性,E-钙粘素表达弱阳性,Boyden小室穿膜细胞数为57.4±3.4;Pi组:和C组相比,Twist和α-SMA表达显著减弱(P＜0.01),E-钙粘素表达显著增强(P＜0.01),Boyden小室穿膜细胞数显著减少(P＜0.01);Ni组:Twist、α-SMA和E-钙粘素表达,及Boyden小室穿膜细胞数皆和C组无显著差异(P＞0.05).结论:针对Twist的shRNA能有效地抑制A549细胞上皮-间充质转分化及体外侵袭能力.
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PEA3在白蛋白诱导肾小管上皮细胞损伤中的作用
目的:探讨PEA3在白蛋白诱导的肾近端小管上皮细胞损伤中的作用及机制.方法:体外培养小鼠近端肾小管上皮细胞,实验组分为对照组、空载对照组、PEA3过表达组、白蛋白造模组和PEA3处理组.实时荧光定量PCR检测PEA3转染效率.应用Annexin V-FITC/PI双染和Hoechst染色检测细胞凋亡.Western blot法和RT-PCR检测肾小管上皮细胞标志物E-cadherin、α-SMA及Vimentin的蛋白和mRNA变化水平.结果:①PEA3质粒转染后,过表达组的PEA3表达水平增高了2.5倍;②加入白蛋白刺激后,与对照组相比小管细胞凋亡增加,过表达PEA3显著抑制白蛋白诱导的小管细胞凋亡;③白蛋白刺激降低E-cadherin的表达,而增加了α-SMA和Vimentin的表达,PEA3过表达阻断白蛋白对E-cadherin的抑制作用,并降低α-SMA和Vimentin的表达.结论:PEA3可抑制白蛋白诱导的小管上皮细胞凋亡和上皮-间充质转分化.
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波形蛋白在不同类型慢性鼻-鼻窦炎中的表达及意义
目的:探讨波形蛋白(VM)在不同类型的慢性鼻-鼻窦炎中的表达和分布情况及意义.方法:将慢性鼻-鼻窦炎患者分为嗜酸粒细胞性鼻息肉(10例)、非嗜酸粒细胞性鼻息肉(12例)和不伴息肉的单纯慢性鼻-鼻窦炎(10例),将鼻中隔偏曲的肥大下鼻甲(10例)作为对照组.用免疫组织化学染色检测各组中VM的表达.并运用免疫荧光双染检测VM阳性的细胞是否同时表达上皮的连接标记上皮性钙黏蛋白,用来鉴别VM在上皮中的表达是否属于上皮来源的细胞.结果:伴和不伴息肉的慢性鼻-鼻窦炎各组以及对照组的上皮与间质中均出现VM的阳性表达.但VM阳性的细胞主要分布于黏膜的间质包括成纤维细胞、血管内皮细胞和其他间充质细胞.伴息肉的慢性鼻-鼻窦炎组VM的表达较其他组下调(P＜0.05).VM阳性的细胞为上皮来源的细胞,上皮层的VM阳性细胞尤其见于各种类型的鼻-鼻窦炎.结论:VM不仅分布于鼻黏膜的间质而且分布于黏膜上皮, 这一现象尤其见于慢性鼻-鼻窦炎,且这些VM阳性的细胞不是白细胞,可能是上皮-间充质细胞转分化的结果.VM与鼻-鼻窦炎的组织学特征密切相关,可能在慢性鼻-鼻窦炎的发病过程中发挥重要的作用.
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补体片段C3a对体外培养足细胞表型的影响
目的 探讨补体片段C3a对小鼠足细胞表型转化的影响.方法 外源性C3a干预分化成熟的足细胞,用RT-PCR、Western印迹、免疫化学和免疫荧光方法检测足细胞synaptopodin、podocin、nephrin、CD2相关蛋白(CD2AP)、成纤维细胞特异性蛋白1(FSP-1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA) mRNA和蛋白的表达.经整合素连接激酶(ILK) siRNA预处理后的足细胞再加入外源性C3a干预,用Western印迹检测nephrin和α-SMA蛋白的表达,Western印迹和免疫化学方法检测Snail和α-actinin 4蛋白的表达,细胞划痕实验观察足细胞体外迁移能力.结果 免疫化学和免疫荧光检测结果显示,分化成熟足细胞表达synaptopodin、podocin、nephrin、CD2AP,0.1 μmol/L C3a刺激24 h后其表达减少;分化成熟足细胞表达少量FSP-1、α-SMA,0.1 μmol/L C3a刺激24h后其表达增加.与对照组相比,随着C3a浓度的增加synaptopodin、podocin、CD2AP和nephrin的mRNA表达减少(均P＜0.05),FSP-1和α-SMA的mRNA表达增加(均P＜0.05).Western印迹结果显示,与对照组相比,随着C3a浓度增加,足细胞synaptopodin、podocin、nephrin、CD2AP的蛋白表达减少(均P＜0.05),FSP-1、α-SMA的蛋白表达增加(均P＜ 0.05).与C3a直接干预组比较,足细胞经ILK siRNA预处理后再加入外源性C3a,nephrin蛋白表达增加(P＜0.05),α-SMA蛋白表达减少(P＜0.05);同时,α-actinin 4和Snail的蛋白表达减弱,足细胞迁移能力下降.结论 补体片段C3a可诱导体外培养的小鼠足细胞向间充质细胞转化,ILK信号通路参与细胞表型的转化.
关键词： 补体C3a 足细胞 上皮-间充质转分化 整合素连接激酶信号通路 -
PI3K/Akt信号调节腹膜间皮细胞上皮-间充质转分化
目的 通过体内外实验探讨PI3K/Akt信号对腹膜透析腹膜间皮细胞上皮-间充质转分化(EMT)的调节作用.方法 40只12周龄ICR小鼠腹腔置管行腹膜透析,制备腹膜间皮细胞的上皮-间充质EMT小鼠模型,成膜后分为PD模型组和对照组.采用实时定量PCR、Western印迹和组织免疫荧光等方法检测腹膜组织磷酸化丝氨酸/苏氨酸激酶(pAkt)的表达及EMT相关蛋白和mRNA的表达[包括紧密连接蛋白(ZO-1)、波形蛋白(Vimentin)、纤连蛋白(FN)].体外实验观察转化生长因子(TGF)β1对人腹膜间皮细胞(HPMCs) Akt磷酸化和核转位及ZO-1、Vimentin表达的影响.采用PI3K/Akt抑制剂LY294002预处理和负显性Akt(DN-Akt)质粒转染HPMCs,抑制P13K/Akt信号,观察其对TGF-β1诱导的HPMCs细胞ZO-1、Vimentin表达的影响.结果 与对照组相比,模型组小鼠第28天壁层腹膜组织明显增厚,上皮细胞标志物ZO-1 mRNA和蛋白表达降低,间充质细胞标志物Vimentin和FN的mRNA和蛋白表达升高,Akt磷酸化水平(pAkt)也明显升高(均P＜0.01).体外实验发现:TGF-βl抑制HPMCs细胞ZO-1表达,增加Vimentin和pAkt表达(均P＜0.01),且呈浓度依赖性;LY294002、DN-Akt处理可抑制pAkt表达,对TGF-β1诱导的HPMCs ZO-1 mRNA和蛋白下调表达有明显回复作用,并抑制TGF-β1引起的Vimentin mRNA和蛋白的高表达(均P＜ 0.01).结论 PI3K/Akt信号参与调节PD腹膜间皮细胞EMT,以PI3K/Akt信号为靶点可望为腹膜纤维化的防治提供一种新途径.
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miR-200a在腹膜透析相关性腹膜纤维化中的表达
目的 通过基因芯片技术寻找与腹膜纤维化相关的关键性miRNA,体内外实验验证其表达,确定其与腹膜纤维化的关系.方法 30只雄性昆明小鼠被分为对照组和实验组.腹腔注射脂多糖(LPS)+高糖透析液建立腹膜纤维化小鼠模型.芯片法检测腹膜组织miRNA表达谱,寻找纤维化腹膜组织中差异表达的miRNA.进一步扩大样本量,用实时定量PCR法验证差异miRNA(miR-200a)表达水平.转化生长因子β1(TGF-β1)刺激,建立体外腹膜间皮细胞上皮-间充质转分化(EMT)模型,分别用细胞免疫荧光、Western印迹、RT-PCR法检测人腹膜间皮细胞中E钙黏蛋白(E-cadherin)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)、纤连蛋白(FN)的表达变化及定位,实时定量PCR、Taqman探针法检测体外间皮细胞EMT模型中miR-200a的表达变化.结果 与对照组相比,实验组小鼠腹膜组织有差异表达的miRNA表达谱.差异倍数＞2的miRNA有8个,其中miR-200a表达明显下调(差异倍数3.31,P＜ 0.05).实时定量PCR验证了miR-200a在腹膜组织中的表达.体外TGF-β1诱导的腹膜间皮细胞EMT模型中发现:分别用TGF-β1作用1、2、3h后,腹膜间皮细胞的miR-200a表达水平明显下调,作用lh时下调了46％ (P＜ 0.05).结论 miR-200a在纤维化腹膜组织及腹膜间皮细胞EMT过程中的表达明显下调,提示miR-200a与腹膜纤维化过程密切相关.作用机制可能为其影响相关靶基因,参与调控腹膜间皮细胞EMT,影响腹膜纤维化过程.
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牛蒡子苷对晚期氧化蛋白产物诱导小鼠足细胞转分化的影响
目的 探讨牛蒡子苷对晚期氧化蛋白产物(AOPP)诱导小鼠足细胞转分化的影响.方法 用200 μg/ml AOPP刺激小鼠足细胞24h,同时加入牛蒡子苷(浓度分别为50、100、200、400 μmol/L)进行干预,采用Western blotting检测内质网应激标志性蛋白Grp78、CHOP及平滑肌激动蛋白(α-SMA)表达水平.结果 牛蒡子苷干预后可抑制小鼠足细胞Grp78、CHOP、α-SMA蛋白表达水平,且在一定范围内呈剂量依赖性.结论 AOPP可通过引起小鼠足细胞内质网应激(ERS)从而导致上皮-间充质转分化(EMT),而牛蒡子苷则可通过减轻ERS从而逆转EMT,为治疗肾脏纤维化提供新的研究方向.
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PI3K/AKT/Survivin通路在大鼠腹膜纤维化中的作用机制
目的 探讨磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/生存素(Survivin)信号通路在腹膜间皮细胞上皮-间充质转分化(EMT)中的作用.方法 20只雄性SD大鼠随机分为模型组和对照组,模型组每天给予42.5 g/L葡萄糖腹膜透析液(100 mL/kg)腹腔注射建立大鼠腹膜间皮细胞EMT模型,对照组在相同条件下予等量的生理盐水腹腔注射.两组大鼠于4周末次腹膜透析后,留取腹膜组织,采用HE和Masson染色,观察腹膜组织形态学变化并测量腹膜组织厚度,采用实时定量PCR、Western印迹和免疫组化等方法检测腹膜组织p-AKT、AKT、Survivin的表达及EMT相关蛋白和mRNA的表达[紧密连接蛋白(ZO-1)、神经-钙黏素(N-cadherin)].结果 成功建立大鼠腹膜间皮细胞EMT模型,与对照组相比,模型组小鼠腹膜组织明显增厚,上皮细胞标志物ZO-1 mRNA及蛋白表达降低,间充质细胞标志物N-cadherin mRNA及蛋白表达升高,p-AKT、Survivin蛋白也明显升高(P<0.05),AKT蛋白表达无明显变化(P>0.05).结论 PI3K/AKT/Survivin信号通路参与腹膜间皮细胞EMT的发生与发展.
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白藜芦醇对高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化的抑制作用
目的 探讨白藜芦醇对高糖诱导人肾小管上皮细胞(HK-2)发生上皮-间充质细胞转分化(epitheliamesenchymal transition,EMT)的抑制作用及机制.方法 体外培养HK-2细胞,分为正常对照组(NG,5.5 mmol/L)、高糖组(HG,30 mmol/L)、白藜芦醇组(RES,10 μmol/L)、高糖(30 mmol/L)+白藜芦醇(10 μmol/L)组(HG+ RES)、二苯基碘(diphenyleneiodonium)组(DPI,10 μmol/L)、高糖(30 mmol/L)+ DPI(10 μmol/L)组(HG+ DPI).倒置显微镜下观察高糖对细胞形态的影响.免疫荧光检测上皮细胞标志物波形蛋白(cytokeratin)及间充质细胞标志物波形蛋白(vimentin)的表达变化,Western blot检测α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E钙黏蛋白(E-cadherin)、NADPH氧化酶亚基(NOXs)的表达变化,DCFH-DA法检测细胞内ROS水平.结果 与正常对照组相比,高糖处理后的HK-2细胞失去原有形态,呈长梭形改变,上皮细胞标志物cytokeratin及E-cadherin表达明显减少,间充质细胞标志物vimentin及α-SMA表达明显升高(P＜0.01),同时NADPH氧化酶亚基NOX1、NOX4表达明显升高(P＜0.01),NOX2无明显变化,ROS产生明显增多[(1 723.82±303.97) vs(2 579.36±353.76),P＜0.01],而加入白藜芦醇或NADPH氧化酶抑制剂DPI预孵育后,均能抑制高糖诱导的HK-2细胞EMT(P ＜0.01)和ROS[(1 803.36±199.54)或(1 837.45±266.83) vs(2 579.36±353.76),P＜0.01]产生增多,并且白藜芦醇可以明显抑制高糖诱导的NOX1以及NOX4表达升高(P＜0.01).结论 白藜芦醇可能通过抑制NADPH氧化酶降低肾小管上皮细胞ROS生成,进而抑制高糖状态下HK-2细胞EMT的发生.
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Klotho对FGF2诱导的肾小管上皮细胞上皮-间充质转分化的抑制作用
目的 探讨Klotho抑制成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor2,FGF2)诱导的肾小管上皮细胞(HK-2)上皮-间充质转分化(epithelia-mesenchymal transition,EMT)的作用及机制.方法 重组人Klotho蛋白预孵育前后,倒置显微镜观察FGF2对HK-2细胞形态的影响,免疫荧光检测上皮细胞标志物cytokeratin和间充质细胞标志物vimentin的表达变化,Western blot检测α-SMA、E-cadherin和ERK1/2的表达变化.结果 100 ng/mL的FGF2作用于HK-2细胞48 h后,HK-2细胞变成长梭形,细胞间隙明显增大,上皮细胞标志物E-cadherin的表达明显下降,间充质细胞标志物α-SMA表达明显升高(P＜0.05),提示FGF2可以诱导HK-2细胞发生EMT.而Klotho蛋白预孵育可以显著抑制FGF2诱导的EMT,并且FGF2/FGFR(FGFs受体)下游信号分子pERK1/2的表达明显减弱(P＜0.05).结论 Klotho可以通过减弱FGF2信号通路活化抑制FGF2诱导的HK-2细胞EMT,Klotho可能参与了肾间质纤维化的发生和发展.
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高尿酸通过TLR4/NF-κB信号通路诱导肾小管上皮细胞上皮-间充质转化的作用研究
目的 探讨尿酸诱导肾小管上皮细胞上皮-间充质细胞转化(epithelia-mesenchymal transition,EMT)的作用及机制.方法 采用不同质量浓度的尿酸预孵育肾小管上皮细胞(HK-2)48 h,通过倒置显微镜观察尿酸对HK-2细胞形态的影响,Western blot检测Fibronectin、α-SMA和E-cadherin蛋白表达变化.Real-time PCR检测炎症因子IL-1 β、IL-6以及TNF-α mRNA的表达变化,免疫荧光检测上皮细胞标志物cytokeratin和间充质细胞标志物vimentin的表达变化.结果 与正常组相比,15 mg/dL的尿酸处理HK-2细胞48 h后,HK-2细胞间隙增大,呈长梭形改变.间充质细胞标志物Fibronectin、α-SMA表达明显升高,而上皮细胞标志物E-cadherin的表达明显下降(P＜0.05).同时,高浓度尿酸诱导了HK-2细胞炎症因子IL-1β、TNF-α的表达升高(P＜0.05),TLR4/NF-κB信号通路活化,而靶向抑制NF-κB信号通路活化可以显著抑制尿酸诱导的EMT.结论 高尿酸可以通过活化TLR4/NF-κB信号通路诱导肾小管上皮细胞EMT的发生,靶向干预NF-κB信号通路可以显著抑制尿酸诱导的肾间质纤维化.
关键词： 尿酸 TLR4/NF-κB信号通路 上皮-间充质转分化 炎症因子 -
Smad7而非Smad6基因可抑制TGF-β诱导肾小管上皮-间充质转分化
目的:观察Smad6和Smad7基因能否抑制TGF-β诱导肾小管上皮-间充质转分化.方法:构建产生表达Smad6和Smad7基因的无辅毒腺相关病毒载体, 再将病毒颗粒分别转染入人肾小管上皮细胞(HKC), 细胞随机分为正常对照、 TGF-β1组、 Smad7 组、 LacZ组、 TGF-β1+Smad7或Smad6组、 TGF-β1+LacZ组.10 μg/L TGF-β1添加入培养液孵育15、 30、 60、 120 min和3 d.Western blot测定TGF-β1和Smad6或Smad7基因转染对细胞p-Smad2、 E-cadherin、α-smooth muscle actin(α-SMA)表达的影响, ELISA法测定培养上清羟脯氨酸的含量的变化, 倒置显微镜观察细胞形态变化.结果:与未加TGF-β1细胞相比, 添加TGF-β1后15、 30、 60、 120 min胞内Smad2磷酸化水平明显增加, 30 min时表现大.10 μg/L TGF-β1与HKC孵育72 h后, 细胞α-SMA和羟脯氨酸量合成增加, E-cadherin表达减少;细胞形态变长, 呈纺锤状细胞, 失去鹅卵石样的形状.Smad7基因转染可抑制TGF-β1诱导Smad2磷酸化, 抑制细胞α-SMA和羟脯氨酸合成, 增加E-cadherin表达, 维持培养细胞的上皮样形态, 相反, Smad6没有这样的作用.结论:Smad7而不是Smad6基因转染能抑制TGF-β1诱导肾小管上皮-间充质转分化, 这些作用可能与Smad7阻断Smad2磷酸化有关.
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RNA干扰抑制Snail表达对A549细胞上皮-间充质转分化及体外侵袭的影响
目的:研究用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术抑制转录因子Snail表达后,对人肺腺癌A549细胞上皮-间充质转分化表型和体外侵袭能力的影响.方法:构建能表达针对Snail的小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)的RNA干扰载体(Snail siRNA vector)和表达不针对任何已知mRNA的siRNA的阴性对照RNA干扰载体(control siRNA vector),分别转染A549细胞,新霉素抗性筛选得到Snail表达受抑制的A549-siSnail细胞和Snail表达未受影响的A549-siControl细胞.针对非转染(A549-nontransfection)、A549-siSnail、A549-siControl三组细胞,分别采用RT-PCR和Western blot技术检测Snail、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和E-钙粘素表达,用Boyden chamber模型检测细胞侵袭能力.结果: A549-nontransfection组:Snail和α-SMA表达强阳性,E-钙粘素表达弱阳性；A549-siSnail组:和A549-nontransfection组相比,Snail和α-SMA表达显著减弱(P<0.01),E-钙粘素表达显著增强(P<0.01),Boyden chamber穿膜细胞数显著减少(P<0.01)；A549-siControl组:Snail、α-SMA和E-钙粘素表达,及Boyden chamber穿膜细胞数和A549-nontransfection组无显著差异(P>0.05).结论: 通过RNA干扰阻滞Snail表达能有效地抑制A549细胞上皮-间充质转分化及体外侵袭能力.Snail可能在肺腺癌上皮-间充质转分化及侵袭过程中扮演重要角色,抑制Snail表达可能成肺腺癌治疗的可行策略.
