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温阳益气活血方对遗传性视网膜色素变性小鼠感光细胞凋亡的影响及机制研究
目的 观察中药温阳益气活血方对遗传性视网膜色素变性小鼠视网膜感光细胞凋亡的影响,并探寻其分子机制.方法 将RDS(retinal degeneration slow)小鼠随机分为模型组和中药组,并设C57BL/6J小鼠为正常对照组,每组4雌2雄.中药组自雌雄合笼之日起开始给予温阳益气活血方(10 mg/g)灌胃,仔鼠出生后母鼠给予中药水煎液代替日常饮水,仔鼠出生7天开始给予中药水煎剂小剂量灌胃,出生21天按成年鼠剂量灌胃.模型组和正常组同时给予生理盐水灌胃.3组均于仔鼠出生后18、28、48天时采用视网膜电图(electroretinogram,ERG)检测视网膜功能,进行HE染色并计算外核层感光细胞层数,TUNEL法检测感光细胞凋亡率,免疫组织化学染色法计算视紫红质(Rhodopsin)及碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)表达.结果 与模型组比较,仔鼠出生后18天时,中药组大混合反应ERG(Max-ERG) a、b波振幅及bFGF表达明显升高(P <0.05,P <0.01);28、48天时,中药组Max-ERG a、b波振幅明显升高,外核层感光细胞层数明显增加,视网膜感光细胞凋亡率明显降低,Rhodopsin及bFGF表达明显升高,差异均有统计学意义(P <0.05,P <0.01).结论 温阳益气活血方可以有效抑制RDS小鼠感光细胞的凋亡,其机制可能与上调bFGF的表达有关.
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一个常染色体显性视网膜色素变性家系表型分析和RHO基因突变检测
目的 分析一常染色体显性视网膜色素变性(autosomal dominant retinitis pigmentosa,adRP)家系的临床表型,确定该家系与视紫红质(rhodopsin,RHO)基因的关系.方法 依据RP诊断标准及患者临床表型,确定一连续4代发病的adRP家系遗传的特点；采集家系中13位成员外周血8-10ml,提取基因组DNA；聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增RHO基因的第1-5外显子基因片段,产物纯化后直接测序；测序结果与美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)数据库上公布的核酸标准序列进行比对分析.结果 该家系临床特点为所有患者均于10岁左右出现夜盲,1例22岁出现视野损害,2例40岁左右出现视野损害,并且于50岁左右双眼相继发生急性闭角型青光眼和并发性白内障.该家系5例患者在RHO基因外显子、上下游非编码序列以及内含子及外显子拼接部中均未发现碱基改变.结论 本研究家系患者存在遗传异质性和表型异质性,RHO基因不是该家系的致病基因.
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视紫红质和Peripherin/RDS基因在视网膜色素变性家系中的突变检测
目的 对一常染色体显性视网膜色素变性(autosomal dominant retinitis pigmentosa,adRP) 家系进行视紫红质基因(rhodopsin,RHO)、盘膜边缘蛋白/ 视网膜变性慢基因(Peripherin/retinal degeneration slow,Peripherin/RDS)、视杆外节盘膜蛋白1 基因(retinal outer segment membrane protein 1,ROM1)、神经视网膜亮氨酸拉链基因(neural retinal leucine zipper,NRL) 和视锥杆细胞同源盒基(cone-rod homeobox-containing gene,CRX) 基因的突变检测.方法 采集一连续3 代发病的adRP 家系28 名成员外周血,提取基因组DNA,采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR) 和直接测序技术,对RHO、Peripherin/RDS、ROM1、NRL 和CRX 基因进行检测,结果与标准核酸序列进行比对和分析.结果 该家系成员在RHO、Peripherin/RDS、ROM1、NRL 和CRX 基因中未发现致病突变,但是在Peripherin/RDS 基因第1 外显子和第3 外显子编码区发现4 处单核苷酸改变.结论 该家系在RHO、Peripherin/RDS、ROM1、NRL 和CRX 基因中未检测到致病突变,Peripherin/RDS 基因外显子中4 处单核苷酸改变属于单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs).
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常染色体显性视网膜色素变性家系基因定位的研究与视紫红质基因突变的检测分析
目的:对一常染色体显性视网膜色素变性(autosomal dominant retinitis pigmentosa,ADRP)大家系进行基因定位,并检测该家系12名患者的视紫红质基因是否存在突变.方法:采用多个已知位点的遗传标记对该ADRP家系进行连锁分析,确定致病基因的大致染色体位置;在所定位的染色体区域将RHO基因作为侯选基因进行直接测序检测突变.结果:连锁分析结果发现遗传标记D3S1292,当θ=0.1时有大Lod值=2.732852,因此考虑该家系致病基因位于D3S1292附近.直接测序结果发现该家系中大部分患者在RHO基因的第3外显子序列,第182密码子的第2个碱基发生G→A置换突变,导致甘氨酸(Gly)变为天冬氨酸(Asp),命名为Gly-182-Asp突变,而在2例患者中则未发现突变;同时,在该家系正常成员以及正常对照者中均未发现此突变.结论:ADRP存在分子水平的遗传异质性,某些ADRP是由于RHO基因突变所致.但是由于本研究所涉及的ADRP家系中尚有2名患者未找到RHO基因突变,故不能将Gly-182-Asp突变认为是该家系的致病原因.在D3S1292与RHO基因之间可能存在新的基因,还需进一步研究证明.
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眼睛的维生素
科学家们总结西方发达国家在过去数十年间饮食上的不合理,为"五多三少","三少"指摄入的钙少,维生素少,食物纤维少.维生素有多种,这期先说说维生素A.维生素A通常指视黄醇,被称为抗干眼病维生素,呈脂溶性,是构成视觉细胞中感光物质视紫红质的组成成分.
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法尼基转移酶β-亚单位基因在胃癌组织中的表达
法尼基转移酶(farnesyltransferase,FTase)是一种细胞溶质中的酶,广泛存在于哺乳动物细胞、酵母及卵蛙细胞中,催化细胞多肽翻译后修饰的第一步骤(法尼基化),底物包括Ras蛋白、核纤层蛋白A、B、视紫红质激酶、磷酰化酶激酶等[1].FTase是由α和β亚单位组成的异二聚体,α亚单位识别法尼基焦磷酸,β亚单位结合至Ras蛋白[2].Ras蛋白的生物活性与法尼基化修饰有密切关系,FTase已成为抗癌治疗的一个重要靶标和研究热点.我们通过检测人胃癌和癌旁组织中FTase β亚单位mRNA表达水平,探讨FTase β亚单位基因在胃癌中的表达及其与临床病理特点的关系,了解其在胃癌诊断和预后判断中的作用和价值,为法尼基转移酶抑制剂治疗胃癌提供理论依据.
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视网膜内视觉信号传递的分子机制
视觉系统对视觉信息的加工处理是连续的.视觉从位于视网膜上的视杆、视锥两种视细胞捕捉外界光线开始,经过视网膜内部水平细胞、双极细胞和无长突细胞处理后,自视网膜节细胞发出的视觉冲动通过外侧膝状核,在大脑皮层中经过整合后,进而形成完整的视觉.在过去的几年里,人们对视觉形成的一些细节有了更深刻的认识,特别是光感受器中光传导的分子机制已基本阐明,本文就此作一综述.
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饮茶有利于保护视力
如果连续看电视4~5小时，会使人的视力暂时降低30%左右。特别是看彩色电视，会大量消耗眼中的视紫红质。视紫红质消耗较多，如不及时补充大量的维生素A，不仅会使视力减退，还会引起夜盲症等。茶叶，特别是绿茶含有多种维生素，其中包括大量的维生素A，因此饮茶有利于保护视力。
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葡萄膜炎细胞和分子基础的研究进展
葡萄膜炎是严重的致盲眼病之一,其发病机制一直受到眼科界的重视.近几十年来,随着细胞和分子水平研究的不断发展,研究者常用视网膜S抗原、视网膜光感受器间维生素A类结合蛋白(IRBP)、视紫红质等诱导敏感系动物产生实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎(EAU).
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视网膜色素变性视紫红质基因突变检测分析
目的 研究视网膜色素变性患者视紫红质基因突变及其与临床表现的关系.方法 应用聚合酶链反应和直接测序技术,对33例视网膜色素变性先证者进行了视紫红质基因整个编码区及内含子外显子拼接区的突变筛选,其中常染色体显性遗传5例、常染色体隐性遗传8例,散发患者20例;同时应用裂隙灯、眼底镜、动静态视野计和视网膜电流图对患者进行临床检测.随机收集50例正常人进行对照检测.结果 发现1例散发患者有视紫红质基因P347L突变,呈杂合子,密码子347由CCG变成CTG.该患者13岁出现夜盲,46岁时视力和视野损害较重,视网膜电图检查杆体和锥体无反应.眼底显示视盘萎缩,血管变性,视网膜可见大量骨细胞样色素沉着.结论 视紫红质基因P347L基因突变患者有较为严重的临床改变;而且P347L突变被认为是该患者的病因.
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骨髓间充质干细胞分化为光感受器样细胞的体外诱导和微环境研究
背景 近年来间充质干细胞(MSCs)在眼科方面已成功诱导分化为角膜细胞、视网膜神经节细胞(RGCs)、视网膜神经样细胞等,但诱导成为光感受器细胞及其微环境的研究尚少. 目的 研究骨髓MSCs(BMSCs)在体外定向分化为光感受器样细胞的可能性及其所需的微环境. 方法 分别将第2代BMSCs细胞株和视网膜色素上皮(RPE)细胞株进行常规培养和传代,取第4代人BMSCs细胞株及第3代RPE细胞株用于实验.将BMSCs分为诱导组和对照组,诱导组的BMSCs与含有20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、20 μg/L表皮生长因子(EGF)及20 μg/L脑源性神经营养因子(BDNF)的骨髓干细胞培养基(MSCM)及RPE细胞的条件培养液共培养进行BMSCs的诱导分化,而对照组的BMSCs仅用MSCM培养基进行培养,倒置显微镜下观察分化细胞的形态学变化.采用免疫细胞化学法检测RPE细胞诱导BMSCs3、5、7d时细胞中视紫红质蛋白的阳性表达率,以鉴定分化细胞的表型.采用逆转录PCR(RT-PCR)法检测RPE细胞诱导BMSCs 5 d、7d时细胞中视紫红质和恢复蛋白mRNA的表达情况. 结果 培养的BMSCs形态均一,呈纺锤形或梭形,RPE细胞形态均一,呈多边形或六边形,细胞内充满色素颗粒,生长良好.诱导后的部分BMSCs呈神经样细胞形态,细胞变圆,突起增长,突起末端可见一级、二级分支,相互间连接呈网状.免疫细胞化学法检测表明,诱导组细胞诱导后第3、5、7天细胞中可见视紫红质的表达,表达率分别为(5.83±0.29)％、(20.36±0.32)％和(29.80±2.30)％,明显高于对照组的(0.71±0.35)％、(2.56±0.24)％和(2.32±0.42)％,差异均有统计学意义(t3 d =41.510,ts d=107.290,t7 d=30.036,P＜0.01).RT-PCR法检测显示,诱导后5d、7d诱导组细胞中视紫红质和恢复蛋白mRNA表达的灰度值均明显高于对照组,差异均有统计学意义(视紫红质mRNA:ts d=103.506,t7 d=122.584,P＜0.01；恢复蛋白mRNA:t5 d=106.674,t7 d=189.992,P＜0.01). 结论 采用含bFGF、EGF及BDNF的条件培养基与RPE细胞培养液体外共培养后BMSCs能够诱导分化成光感受器样细胞.
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不同抗原修复法对视网膜石蜡切片相关功能蛋白表达检测的影响
目的 比较4种抗原修复法对视网膜组织抗原修复的效果.方法 分别应用胰蛋白酶消化、高压加热、水浴加热和微波法对视网膜组织切片进行抗原修复,比较400例胞内视黄醛结合蛋白(CRALBP)、视紫红质和视蛋白免疫组织化学染色效果.结果 4种方法对3种蛋白的阳性表达无影响(P＞0.05),但在组织完整性和背景染色方面差异有统计学意义(P＜0.01).胰蛋白酶消化法效果稳定,抗原表达强,背景清晰,组织完整.而高压加热、水浴加热和微波修复导致组织脱失皱褶、细胞核龟裂,且背景染色强.结论 在视网膜组织病理学检测中,胰蛋白酶消化法是较理想的抗原修复方法.
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视紫红质基因启动子的分离及视网膜特异表达载体的构建
目的分离视紫红质基因启动子,构建以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的视网膜特异表达载体,为今后视网膜细胞特异的靶向基因转移,特别是为视网膜疾病的基因治疗提供工具.方法根据小鼠视紫红质基因5'端DNA顺序合成引物,通过PCR技术从小鼠基因组DNA中扩增524 bp DNA片段,然后插入质粒pEGFP-1 GFP编码基因上游的多克隆位点处,构建表达载体pmRho-EGFP.采用脂质体包裹pmRho-EGFP,转染体外培养的人视网膜色素上皮(RPE)细胞及其他来源的细胞;注射到SD大鼠视网膜下或玻璃体腔内;或通过电穿孔直接转移到RCS大鼠腓肠肌内.GFP表达采用荧光显微镜观察.结果pmRho-EGFP在体外培养的人RPE细胞中的表达水平明显高于其他组织来源的细胞;体内转染实验证明pmRho-EGFP可在大鼠视网膜神经细胞中表达,但在大鼠腓肠肌中不表达.结论小鼠视紫红质基因5'端524 bp片段具有基本的启动子活性,能够调控基因在视网膜神经细胞及色素上皮细胞中表达,并具有一定的组织和细胞特异性.
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一汉族常染色体显性遗传视网膜色素变性家系视紫红质基因检测分析
背景 视紫红质(RHO)基因是常染色体显性遗传视网膜色素变性(adRP)常见的致病基因,错误折叠的RHO突变型蛋白积聚在内质网从而引起内质网应激(ERS)是其引起视网膜色素变性(RP)的主要发病机制之一. 目的 检测—汉族adRP家系的致病突变基因,探讨其遗传学基础. 方法 对参与研究的所有家系成员进行详细的眼科检查.利用新一代测序技术(NGS)对该家系进行189个遗传性视网膜疾病相关基因的目标区域捕获测序,数据经分析滤过,候选突变进行Sanger测序验证和致病性评估.构建视紫红质-增强型绿色荧光蛋白质粒(RHO-pEGFP),包括RHOWr-pEGFP-N1野生型和RHOP53R-pEGFP-N1突变型质粒,转染人视网膜色素上皮(RPE)细胞系(ARPE19)和人肾胚293细胞系(HEK293)培养24 h,用细胞免疫荧光法观察野生型和突变型RHO-GFP融合蛋白在细胞内的定位；采用荧光定量PCR (Q-PCR)及Western blot法检测ERS关键因子X盒结合蛋白-1(XBP1)在细胞中的表达.结果 该汉族家系共5代,遗传模式符合常染色体显性遗传,家系中患病者眼底特征为RP.NGS数据经分析过滤后获得惟一可能致病突变RHO p.P53R,Sanger测序验证该错义突变在该家系中呈共分离,现存的11例患者均呈杂合子.野生型RHO-GFP融合蛋白呈绿色荧光,分布于呈红色荧光的内质网及细胞膜,而突变型RHO-GFP融合蛋白仅积聚在内质网.与转染RHOP53R-pEGFP-N1野生型的细胞相比,转染RHOP53R-pEGFP-Nl突变型的HEK293细胞中XBP1表达上调了(1.28±0.09)倍.表达突变型蛋白的HEK293细胞内XBP1 mRNA中被特异性地剪切了26个碱基的内含子,转染突变型蛋白的HEK293细胞中XBP1蛋白水平表达明显高于转染野生型、转染空pEGFP-N1质粒细胞及未转染细胞.结论 RHO p.P53R是该家系的致病突变基因,该突变型RHO蛋白不能有效地从内质网向细胞膜转运,蓄积在内质网,引起蛋白折叠错误,发生ERS.
关键词： 常染色体显性视网膜色素变性 视紫红质 新一代深度测序 内质网应激 -
汉族常染色体显性视网膜色素变性一家系的连锁分析及突变筛查
背景 原发性视网膜色素变性(RP)有明显的遗传异质性和表型异质性,目前已确定的致病基因较多,确定患病家系的致病基因是进行基因治疗的基础. 目的 对患常染色体显性遗传性RP(ADRP)的一个汉族家系进行致病基因的定位和基因突变分析.方法 此家系的5代21名成员纳入研究,包括12例ADRP患者和9名表型正常者.12例患者进一步接受中心视野、间接检眼镜、眼电图(EOG)、视网膜电图(ERG)检查.对22个已知的ADRP致病基因所在染色体位点进行连锁分析,以确定该家系与疾病连锁的染色体区域,随后对该区域附近的候选基因视紫红质(RHO)进行直接测序评估其突变情况. 结果 间接检眼镜检查该家系先证者眼底表现符合原发性RP表现,EOG和ERG表现为波形记录不到,视野呈向心性缩小.两点连锁分析结果显示,该家系致病基因位点与遗传标记D3S1292连锁,在θ=0.0时得到大优势对数(LOD)值为3.6671.候选的RHO基因直接测序结果发现,该家系所有患者第53位密码子的第2个核苷酸均出现了C→G的突变,致其氨基酸由脯氨酸变为精氨酸(Pro53Arg),而该家系正常成员中未发现此突变. 结论 RHO基因的错义突变Pro53Arg与RP疾病出现共分离现象,可确定为该ADRP家系的致病基因.
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光敏蛋白——心电生理研究的新工具
光敏蛋白是一类在生命体内能够应答光信号而产生生理学反应的蛋白.随着越来越多的光敏蛋白被发现,它们的结构特点、功能特点,以及其在细胞内外离子流动及细胞信号传递方面的生理意义也逐渐被发现.光敏蛋白的应用促进了光遗传学的发展,通过光敏蛋白的感光特性来实现光控制靶细胞的电生理活动.光遗传学技术具有兴奋抑制双向调节、操作简单、微创精准、高时空分辨、可定量重复等优势,其在心电生理研究、心律失常防治、模拟心脏再同步化改善心功能,以及心脏多功能干细胞研究等方面有巨大的应用前景.
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视紫红质在视网膜变性疾病中作用机制的研究进展
视紫红质是感光细胞中的一种视色素,在光线的接收和视觉电位的产生方面具有重要的生理作用,视紫红质接到的过度光信号传导是光性视网膜变性的主要因素.本文就视紫红质的研究现状,及其在视网膜变性中的作用机制做一综述.
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常染色体显性视网膜色素变性家系视紫红质基因突变的检测分析
目的观察一个常染色体显性视网膜色素变性(autosomal dominant retinitis pigmentosa,ADRP)家系的视紫红质(rhodopsin,RHO)基因突变特征. 方法抽取20个ADRP家系成员外周血3～5 ml并提取DNA;聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增RHO基因第1～5外显子基因片段, 用直接测序法对20个DNA样本进行RHO基因突变检测. 结果该家系中10例ADRP患者的RHO基因的第182密码子发生G→A置换突变(Gly-182-Asp),而在2例患者和8个未患病家系成员中均未发现此突变. 结论 Gly-182-Asp突变不一定是ADRP家系的致病原因;在RHO基因附近可能存在新的基因, 但还需要进一步研究证明.
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视网膜色素变性视紫红质部分基因序列检测
建立了重盐、异丙醇提取视紫红质(RHO)基因DNA序列检测方法. 结果显示正常人RHO第5外显子基因所选277碱基排列与Nathans-Hogness报道的基因密码一致.RHO基因直接提取法不能用于序列测定.该法与酚提取法相比,时间缩短数个小时,成本降低50%.
