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Notch信号通路在宫颈癌中的研究进展
十几年前在宫颈癌的相关研究中检测到Notch1,提示其在宫颈癌中可能发挥作用.从宫颈癌前病变发展到浸润癌的过程中,Notch受体及其配体Jagged1蛋白水平升高.Notch1协同HPV E6和E7癌基因促进宫颈鳞状上皮细胞恶变,但也有研究表明Notch1在宫颈癌中具有抑癌作用.其双重作用可能与Notch1浓度和宫颈病变不同阶段有关.此外,Notch信号主要通过PI3K/Akt和NF-κB两条途径促进宫颈细胞上皮-间质转化.Notch信号通路与宫颈癌形成及HPV之间关系较复杂,Notch信号通路的特异性和多效性,以及Notch信号通路的调控机制需要进一步深入研究.
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S100A7在子宫颈癌组织中的表达及其对子宫颈癌HeLa和CaSki细胞迁移侵袭及上皮间质转化的影响
目的 探讨S100钙结合蛋白A7(S100A7)在子宫颈癌组织中的表达及其对子宫颈癌HeLa和CaSki细胞迁移、侵袭、增殖及上皮间质转化(EMT)的影响.方法(1)选择2007年4月至2008年3月青岛大学附属医院妇科收治的因子宫颈鳞癌进行手术治疗的癌组织标本共40份作为子宫颈癌组,以同期因妇科良性肿瘤行子宫全切除术的正常子宫颈组织20份作为对照组,应用免疫组化SP法检测两组子宫颈组织中S100A7蛋白的表达.(2)通过慢病毒包装系统将重组质粒pLVX-IRES-Neo-S100A7和空质粒pLVX-IRES-Neo分别转染子宫颈癌HeLa和CaSki细胞(分别为转染组和对照组),筛选稳定表达S100A7基因的HeLa和CaSki细胞系并进行鉴定.穿膜(transwell)小室体外实验检测两组子宫颈癌细胞的迁移和侵袭能力,活细胞计数(CCK-8)法检测两组子宫颈癌细胞的增殖能力,流式细胞仪检测两组子宫颈癌细胞的细胞周期比例,蛋白印迹(western blot)法检测两组子宫颈癌细胞中EMT标志分子——上皮型钙黏蛋白(E-cad)、神经型钙黏蛋白(N-cad)、波形蛋白(Vim)和纤连蛋白(FN)的表达.结果(1)免疫组化SP法检测显示,子宫颈癌组、对照组子宫颈组织中S100A7蛋白表达水平的中位数分别为91.6和52.1,两组比较,差异有统计学意义(Z=-2.948,P=0.003).(2)本研究成功构建稳定的过度表达S100A7基因的HeLa和CaSki细胞系,转染组HeLa和CaSki细胞中S100A7 mRNA的表达水平分别为119±3和177±16,均明显高于各自的对照组(均设为1, P均<0.01);转染组HeLa和CaSki细胞中S100A7蛋白的表达强度均明显高于各自对照组HeLa和CaSki细胞.transwell小室体外迁移实验显示,转染组HeLa和CaSki细胞的穿膜细胞数分别为(572± 51)和(100±8)个,均明显高于各自的对照组[分别为(337±25)和(41±4)个;P均<0.01];应用matrigel基质的transwell小室进行细胞侵袭能力检测,结果显示,转染组HeLa和CaSki细胞的穿膜细胞数分别为(441±15)和(110±14)个,均明显高于各自的对照组[分别为(156±21)和(59±7)个;P均<0.05].CCK-8法和流式细胞仪检测显示,转染组HeLa和CaSki细胞的增殖率和细胞周期比例分别与各自的对照组比较,差异均无统计学意义(P均>0.05).western blot法检测显示,与各自的对照组比较,转染组HeLa和CaSki细胞中E-cad蛋白的表达强度均明显减弱,而N-cad、Vim和FN蛋白的表达强度均明显增强.结论 S100A7基因促进子宫颈癌HeLa和CaSki细胞的侵袭转移和EMT,可能与子宫颈癌的发生、发展有关.
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Bcl-2结合抗凋亡基因3参与子宫颈癌上皮间质转化的机制研究
目的 探讨Bcl-2结合抗凋亡基因3(BAG3)在子宫颈癌组织和细胞中的表达以及对子宫颈癌上皮间质转化(EMT)的作用及其机制.方法 (1)收集2015年9月至2017年3月山东大学齐鲁医院和附属省立医院病理科保存的子宫颈癌标本50份,以2015年8月至2017年3月德州市立医院妇科收治的因子宫肌瘤行子宫全切除术或行子宫颈活检患者的正常子宫颈组织50份作为对照,分别采用逆转录(RT)-PCR技术和蛋白印迹(western blot)法检测BAG3 mRNA和蛋白的表达并分析其临床意义.(2)选择子宫颈癌细胞系HeLa和SiHa细胞,以正常子宫颈上皮细胞为对照,分别采用RT-PCR技术和western blot法检测细胞中BAG3 mRNA和蛋白的表达;以下实验分为两组,即转染组[转染BAG3基因的小分子干扰RNA(si-BAG3)]和对照组[转染对照小分子干扰RNA(siRNA)],采用活细胞计数(CCK-8)法检测转染后两组HeLa和SiHa细胞的增殖情况[以吸光度(A)值表示];体外划痕实验和transwell小室实验检测转染后两组HeLa和SiHa细胞的迁移、侵袭能力(分别以愈合率和穿膜细胞数表示);建立两组子宫颈癌HeLa和SiHa细胞的裸鼠移植瘤模型,观察BAG3对移植瘤成瘤的影响,并采用western blot法检测移植瘤组织中EMT相关生物标志物[包括锌指转录因子(Slug)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、神经型钙黏蛋白(N-cadherin)、上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)]蛋白的表达.结果 (1) RT-PCR技术和western blot法分别检测显示,子宫颈癌组织中BAG3 mRNA和蛋白的表达水平分别为1.20±0.15、1.10±0.16,明显高于正常子宫颈组织(分别为0.23±0.04、0.29±0.03,P均＜0.01);子宫颈癌组织中BAG3 mRNA和蛋白的表达水平与临床分期、淋巴结转移状态均明显相关(P＜0.05),而与患者的年龄、病理分级、肿瘤直径均无相关性(P＞0.05).(2)RT-PCR技术和western blot法分别检测显示,与正常子宫颈上皮细胞比较,HeLa和SiHa细胞中BAG3 mRNA和蛋白表达水平均明显增高(P均＜0.01);转染组HeLa和SiHa细胞中BAG3 mRNA和蛋白表达水平均明显低于对照组(P均＜0.01).CCK-8法检测显示,转染后72 h,转染组HeLa和SiHa细胞的A值分别为0.88±0.08、0.92±0.09,明显低于对照组(分别为1.22±0.13、1.35±0.12,P均＜0.01);体外划痕实验检测显示,转染组HeLa和SiHa细胞的愈合率分别为(20.1±2.1)％、(21.1±2.1)％,均明显低于对照组[分别为(58.6±5.6)％、(61.7±5.4)％,P均＜0.01];体外transwcll小室实验检测显示,转染组HcLa和SiHa细胞的穿膜细胞数分别为(76±11)、(71±8)个,均明显少于对照组[分别为(131±12)、(129±14)个,P均＜0.01].裸鼠在接种转染组HeLa和SiHa细胞后的成瘤时间分别为(9.5±0.5)、(10.5±1.3)d,明显长于接种对照组HeLa和SiHa细胞后的成瘤时间[分别为(4.5±0.5)、(5.2±1.1)d,P均＜0.05];与接种对照组HeLa和SiHa细胞的裸鼠相比,接种转染组HeLa和SiHa细胞的裸鼠移植瘤组织中Slug、MMP-2和N-cadherin蛋白的表达水平均明显下降(P均＜0.01),E-cadherin蛋白的表达水平均明显升高(P均＜0.01).结论 BAG3 mRNA和蛋白在子宫颈癌组织和细胞中均高表达;BAG3通过影响子宫颈癌EMT的发生进而参与子宫颈癌细胞的增殖、迁移与侵袭过程,因而BAG3有望成为子宫颈癌治疗的有效靶点.
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宫颈鳞癌及上皮内瘤变组织E-cadherin 和β-catenin及PTEN表达相关性分析
目的:探讨E-cadherin、β-catenin和PTEN在宫颈鳞癌及上皮内瘤变组织中的表达及临床意义.方法:采用免疫组化方法检测75例宫颈鳞癌、30例宫颈上皮内瘤变(CIN)及10例正常宫颈组织中E-cadherin、β-catenin和PTEN的表达.结果:正常宫颈、CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ及宫颈鳞癌组织中E-cadherin阳性表达率依次为100.0％、85.7％、50.0％和37.3％;β-catenin异常表达率依次为0、28.6％、62.5％和84.0％；PTEN阳性表达率依次为100.0％、78.6％、56.3％和40.0％,3种蛋白在正常宫颈、CIN Ⅰ的表达与鳞癌中的表达差异均有统计学意义,在正常宫颈与CINⅡ～Ⅲ中的表达差异也均有统计学意义,P＜0.05.E-cadherin、PTEN在宫颈鳞癌中的阳性表达均与病理组织学分级、淋巴结转移及临床分期有关,P＜0.05；β-catenin异常表达与病理组织学分级、淋巴结转移有关(P＜0.05),但与临床分期无关(P＞0.05).宫颈鳞癌组织中E-cadherin与PTEN阳性表达呈正相关,与β-catenin异常表达呈负相关；β-catenin异常表达与PTEN 阳性表达呈负相关.结论:E-cadherin与PTEN表达缺失或降低及β-catenin异常表达,均在宫颈鳞癌的发生、发展及淋巴结转移中发挥重要作用,且三者之间关系密切.
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喉鳞状细胞癌组织Twist表达与上皮-间质转化相关性分析
目的 研究喉鳞状细胞癌及癌旁黏膜上皮组织中Twist蛋白的表达,分析其与喉鳞癌上皮-间质转化及侵袭转移之间的相关性.方法 采用免疫组化EnVision法检测湖州市中心医院2005-01-01-2010-12-30资料完整的74例喉鳞癌组织和30例癌旁黏膜组织中Twist、E-cadherin及N-cadherin蛋白的表达情况,统计分析三者之间的相关性以及与各临床病理指标之间的关系.结果 喉鳞癌组织Twist的阳性表达率为62.2％(46/74),明显高于癌旁黏膜组织的13.3％(4/30),x2=20.388,P＜0.01;喉鳞癌组织N-cadherin的阳性表达率为58.1％(43/74),明显高于癌旁黏膜组织的20.0％(6/30),x2=12.441,P＜0.01.39例喉鳞癌组织E-cadherin蛋白的表达明显减弱,而癌旁黏膜上皮均正常表达,两组间差异有统计学意义,x2=21.802,P＜0.01.Twist与N-cadherint蛋白表达正相关,r=0.527,P＜0.01;与E-cadherin蛋白呈负相关,r=-0.433,P＜0.01.Twist、N-cadherin蛋白过表达和E-cadherin蛋白低表达与喉鳞癌组织分级、T分期、TNM分期、甲状软骨侵犯及淋巴结转移具有相关性.Log-rank分析显示,Twist蛋白表达阳性喉鳞癌患者的5年生存率为21.7％,明显低于Twist阴性组的39.3％,P＜0.01.结论 Twist在部分喉鳞癌中表达上调,并且与肿瘤的侵袭、转移以及不良的预后相关,其促上皮-间质转化作用可能是重要机制.Twist蛋白检测对喉鳞癌患者预后的评估具有重要的参考价值,其基因也有望成为喉鳞癌的潜在治疗靶点.
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ATF3在结肠癌组织中表达及其对HCT116细胞增殖和迁移影响机制探讨
目的 激活转录因子3(activating transcription factor 3,ATF3)是转录因子ATF/CREB(cyclic AMP-respon-sive element binding protein)家族中的一员,在正常细胞中表达低,但是通过信号刺激可以诱导其短时间快速表达发挥作用.本研究旨在探讨ATF3在结肠癌中的表达及临床病理特征相关性,揭示ATF3过表达对结肠癌HCT116细胞Wnt/β-catenin信号通路和EMT的影响.方法 利用免疫组化法分析ATF3在结肠癌组织中的表达及其临床病理特征相关性.分别向HCT116细胞转染空载和ATF3过表达质粒:采用细胞增殖检测试剂盒8(cell counting kit 8,CCK8)法检测ATF3对细胞增殖的影响;利用划痕实验观察ATF3对细胞迁移的影响;采用蛋白质印迹法检测ATF3过表达对Wnt/β-catenin信号通路和EMT过程中蛋白的影响.结果 ATF3在正常结肠黏膜上皮中高表达,在癌组织及转移癌中低表达,χ2=27.2,P<0.001.细胞实验显示,转染前两组细胞增殖差异无统计学意义,t=0.60,P=0.566;与对照组相比,观察组48 h的吸光度值降低,t=4.21,P=0.003.转染质粒48 h观察组划痕愈合速度变慢;转染48 h观察组ATF3蛋白表达量明显多于对照组;观察组β-catenin、c-myc、Cyclin D1、TCF7 L2和N-cadherin蛋白表达减少,GSK-3β和E-cadherin增多.结论 ATF3过表达可以抑制结肠癌细胞的增殖和迁移;ATF3过表达可以抑制Wnt/β-catenin信号通路和上皮-间质转化,抑制结肠癌的发生及转移;ATF3可能在结肠癌的发生发展起着重要的作用.
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非小细胞肺癌Twist表达与EMT相关性分析
目的:探讨非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)组织转录因子Twist的表达及其与上皮-间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)的相关性.方法:选取2010-02-2011-11山东省肿瘤医院62例NSCLC患者肺癌组织和20例癌旁组织标本,采用免疫组织化学PV两步法检测Twist、EMT表型分子E-cadherin和Vimentin蛋白表达,并分析其与患者临床病理因素的相关性.结果:NSCLC组织Twist阳性表达率为64.5％(40/62),癌旁组织为5.0％(1/20),x2=21.426,P＜0.001;癌组织E-cadherin阳性表达率为54.8％(34/62),癌旁组织为100.0％ (20/20),x2=13.716,P＜0.001;癌组织Vimentin阳性表达率为51.6％(32/62),癌旁组织为10.0％ (2/20),x2=8.697,P=0.003.Twist表达增加与NSCLC分化程度(x2=6.282,P=0.043)、淋巴结转移(x2=11.806,P=0.001)和临床分期(x2 =6.277,P=0.017)有关.Spearman相关分析显示,Twist与E-cadherin表达呈负相关,r=-0.470,P＜0.001;与Vimentin表达呈正相关,r=0.429,P=0.001.结论:Twist高表达与肺癌发生发展、转移和EMT有关,Twist检测有助于肺癌评估恶性程度及预后.
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乳腺癌组织Beclin1和EMT相关分子标志物表达及其临床意义探讨
目的 探讨乳腺癌组织Beclin1和上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关分子标志物(E-cadherin,N-cadherin)表达及其临床意义.方法 采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)、免疫组织化学和蛋白质印迹法分别检测2012-12-01-2013-06-01南方医科大学珠江医院收治的67例乳腺癌和正常乳腺组织标本中Beclin1及E-cadherin、N-cadherin的mRNA和蛋白表达情况,分析Beclin1与EMT及临床病理学特征的关系.结果 乳腺癌组织和正常乳腺组织中Beclin1 mRNA的表达量分别为2.194±0.502和5.637±1.445,z=-6.806,P＜0.001;E-cadherin mRNA的表达量分别为2.647±0.717和6.538±2.045,z=-5.088,P=0.009;N-cadherin mRNA的表达量分别为6.501±0.741和3.860±0.955,z=5.928,P＜0.001.Beclin1蛋白定位于胞膜和胞质,以胞质为主;E-cadherin蛋白定位于胞膜和胞质,以胞膜为主;N-cadherin蛋白定位于胞膜和胞质,以胞质为主.乳腺癌组织和正常乳腺组织中Beclin1 蛋白表达量分别为5.531±0.848和7.871±0.817,z=-5.431,P＜0.001;E-cadherin蛋白的表达量分别为1.257±0.142和2.885±0.294,z=-4.904,P＜0.001;N-cadherin蛋白表达量分别为0.802±0.072和0.419±0.049,z=4.453,P＜0.001.Beclin1蛋白是EMT的保护因素,Beclin1蛋白与人类表皮生长因子受体(human epidermal growth factor 2,HER-2)、Ki-67和TNM分期呈负相关性,P值均＜0.05;与年龄、组织分级、雌激素受体(estrogen receptor,ER)和孕激素受体(progestrone receptor,PR)无相关关系.结论 无论mRNA水平还是蛋白质水平,乳腺癌组织中Beclin1和E-cadherin较正常乳腺组织表达均下调,N-cadherin较正常乳腺组织表达上调.Beclin1是EMT的保护因素,Beclin1与HER-2、Ki-67和TNM分期均存在负相关关系,可作为乳腺癌的预后指标,对进一步研究乳腺癌的远处转移机制提供理论参考.
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官颈癌SiHa/DDP细胞系EMT相关分子表达研究
目的 上皮-间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)是上皮细胞丢失其上皮细胞特性获得间质细胞特征的过程,与多种抗肿瘤药物耐药相关.本研究通过构建宫颈癌顺铂耐药细胞系SiHa/DDP,检测其与亲本细胞之间EMT相关分子的表达差异,建立EMT与宫颈癌顺铂化疗敏感性和相关性模型,为宫颈癌化疗耐药研究提供基础.方法 梯度药物浓度持续诱导建立SiHa耐药细胞系SiHa/DDP,四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测耐药指数,划痕实验及Transwell实验检测体外迁移及侵袭能力,Real-Time PCR及蛋白质印迹法检测EMT相关基因表达.结果 建立耐药细胞系SiHa/DDP(RI=4.48),该细胞侵袭及迁移能力愈合百分比为(64.89±3.91)％,较亲本细胞(17.11±4.49)％增强,t=-12.738,P=0.001;穿膜细胞计数为281.33±27.74,较新本细胞150.33±22.3增强,t=-6.375,P=0.003.mRNA水平上SiHa/DDP细胞E-cadherin,Nano及Oct4表达较SiHa细胞降低,而Snail,Vimentin及N-cadherin表达较SiHa细胞增高,蛋白水平上在顺铂(DDP)浓度0.4μg/mL条件下稳定生长的SiHa细胞株,E-cadherin下调,Snail上调.当DDP浓度稳定至2.0 μg/mL时,检测仍可见E-cadherin下调,但Snail蛋白表达消失,而GSK-3β表达明显增高.结论 耐药细胞系SiHa/DDP呈现EMT表型,SiHa细胞获得顺铂耐药性与EMT相关,SiHa/DDP细胞Snail蛋白表达降低与顺铂上调GSK-3β诱发Snail向胞质转位导致快速降解相关.EMT是另一种耐药相关机制,可能成为逆转宫颈癌耐药治疗的新靶点.
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下调miR-200a表达对结直肠癌细胞HCT116影响研究
目的 miR-200a在多种肿瘤中被证实能调控上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),然而miR-200a在结直肠癌中调控EMT的机制仍未完全阐明.本研究探讨下调miR-200a表达对结直肠癌细胞系HCT 116增殖、迁移和凋亡的影响及可能机制.方法 实验分blank组(仅加LipofectamineTM 2000)、NC组(转染miR-200a negative control)和inhibitor组(转染miR-200a inhibitor)3组,各组细胞处理48 h后,CCK-8、Transwell迁移实验和TUNEL法分别检测细胞增殖、迁移和凋亡变化,免疫细胞化学及蛋白质印迹法检测相关蛋白变化.结果 miR-200a的抑制效率为50.9％,下调miR-200a后inhibitor组细胞增殖能力显著增强(A值为1.429±0.419),F=4.009,P=0.031;Transwell迁移结果显示,inhibitor组的穿膜数量显著增加至45.67±6.779,F=102.452,P＜0.001;TUNEL结果显示,inhibitor组细胞的凋亡指数显著减低至(0.145±0.4585)％,F=19.932,P＜0.001;下调miR-200a的表达后,免疫细胞化学检测显示,E-cadherin蛋白表达减弱,Vimentin表达增强;蛋白质印迹法显示,p-AKT和p-ERK1/2的表达增强,而AKT和ERK2表达无变化.结论 在结直肠癌细胞中下调miR-200a能增强AKT和ERK信号通路活性,后两者可能诱导细胞发生EMT,终导致促进细胞增殖和迁移,抑制细胞凋亡.
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肺癌A549细胞上皮-间质转化及其对微小RNA表达的影响
目的 探讨肺癌A549细胞上皮-间质转化(EMT)对微小RNA(miRNA)表达的影响.方法 采用不同浓度的转化生长因子β1(TGF-β1)诱导肺癌A549细胞发生EMT,应用相差显微镜观察A549细胞形态学变化,采用Western blot法检测EMT相关标记蛋白表达的变化,应用miRNA芯片检测EMT前后miRNA表达的变化,应用荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCT)验证芯片结果的可靠性.结果 肺癌A549细胞发生EMT后,细胞形态拉长,细胞间连接变得疏松.肺癌A549细胞发生EMT后,上皮标记蛋白E-钙黏附素(E-cadherin)表达降低,而间质标记波形蛋白(Vimentin)和纤维连接蛋白(Fibronectin)表达上调.miRNA芯片获得51个miRNA在诱导前后有统计学意义(P＜0.05),且表达差异在2倍以上.18个表达上调,33个表达下调,其中mir-33a和mir-193a-3p的表达经诱导后分别下调了92.8%和86.5%;荧光定量RT-PCR检测mir-33a和mir-193a-3p的表达经诱导后分别下调了73.1%和56.6%.结论 EMT可影响肺癌A549细胞中miRNA的表达变化,miRNA可能通过EMT调节肺癌侵袭转移.
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胃腺癌组织Twist蛋白的表达及其与上皮-间质转化的关系
目的 分析胃腺癌组织中Twist蛋白的表达与临床病理参数之间的相关性及其与上皮-间质转化(EMT)的关系,探讨Twist的表达在判断患者预后中的意义.方法 采用免疫组织化学SABC法检测120例胃腺癌标本及其对应癌旁组织中Twist及EMT相关蛋白上皮钙黏素(E-cad)、神经钙黏素(N-cad)的表达情况,统计分析Twist表达与患者临床病理参数的关系及其与E-cad及N-cad表达的相关性.结果 在胃腺癌组织中Twist、E-cad、N-cad阳性率分别为59.1％(71/120)、36.6％(44/120)、47.5％(57/120),癌旁组织中阳性率分别为17.5％(21/120)、93.3％(112/120)、11.6％(14/120),两种组织间各指标阳性率差异均有统计学意义(均P＜0.05).Twist的表达与肿瘤远处转移、淋巴结转移相关,且与浸润深度呈正相关(均P＜ 0.05).Twist的表达与N-cad和E-cad的表达存在相关性(P＜0.05).结论 胃腺癌组织中Twist、E-cad、N-cad的表达与癌旁组织明显不同,并且胃腺癌组织中Twist的表达与肿瘤的生物学特征密切相关;胃癌组织中Twist蛋白表达与EMT相关蛋白E-cad表达呈负相关,而与N-cad表达呈正相关.
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Brachyury基因及蛋白在肿瘤中的研究进展
人类Brachyury基因(即T基因)定位于染色体6q27区域,编码一种属于T-box转录因子家族成员的Brachyury蛋白.Brachyury蛋白的转录活性在中胚层发育和脊索的形成过程中发挥着关键作用.近期研究发现,Brachyury在人类肿瘤的发生、发展中起重要作用,与上皮-间质转化、肿瘤干细胞、细胞周期调控、肿瘤细胞衰老和放化疗抵抗均有着密切的关系.文章就Brachyury基因及蛋白在人类肿瘤中的新研究进展进行综述.
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miRNA-451调控人脑胶质瘤细胞上皮-间质转化发生的机制研究
目的 研究miRNA-451过表达后通过靶标钙结合蛋白39(CAB39)调控人脑胶质瘤细胞上皮-间质转化发生的机制,以及miRNA-451过表达对胶质瘤细胞侵袭和迁移能力的影响.方法 培养U251胶质瘤细胞,将其分为空白对照组、无义序列组以及miRNA-451 mimics处理组(简称miRNA-451组).采用实时定量PCR检测转染后U251细胞miRNA-451的表达;以Western blot法检测CAB39、E-钙黏素、N-钙黏素、波形蛋白、TWIST、人基质金属蛋白酶2(MMP-2)、人基质金属蛋白酶9(MMP-9)、Snail、蛋白激酶B(AKT)、磷酸化蛋白激酶B(P-AKT)的表达水平;通过细胞免疫荧光实验进一步验证N-钙黏素、波形蛋白的表达水平;采用划痕实验和Transwell实验检测细胞侵袭和迁移能力的变化.结果 与空白对照组及无义序列组相比,miRNA-451组的miRNA-451相对表达水平明显升高(均P ＜0.05).Western blot结果显示,与空白对照组及无义序列组相比,miRNA-451组CAB39、N-钙黏素、波形蛋白、TWIST、MMP-2、MMP-9、Snail、P-AKT的表达水平降低(均P＜0.05),而E-钙黏素的表达水平升高(均P ＜0.05).细胞免疫荧光实验结果显示,miRNA-451组的N-钙黏素、波形蛋白的表达水平相对于空白对照组明显降低(均P ＜0.05).划痕操作后24 h、48 h miRNA-451组的划痕修复率与空白对照组及无义序列组相比均明显降低(均P＜0.05).转染48 h后miRNA-451组穿过滤膜的细胞数目与空白对照组及无义序列组相比显著减少(均P ＜0.05).结论 miRNA-451可能通过降低靶标CAB39的表达调控PI3K/AKT通路,抑制人脑胶质瘤细胞中上皮-间质转化现象的发生,从而抑制人脑胶质瘤细胞的侵袭和迁移能力.
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TRIM33对人脑胶质瘤U251细胞生物学功能影响的实验研究
目的 观察低氧条件下TRIM33基因表达的变化情况及对胶质瘤U251细胞生物学功能的影响.方法 将U251细胞分别在低氧及常氧条件下培养不同时间,采用实时荧光定量PCR及Western blot检测TRIM33的表达变化情况.通过构建TRIM33过表达慢病毒转染U251细胞,采用Western blot检测转染后U251细胞TRIM33的表达,低氧条件下利用CCK-8检测细胞增殖,Transwell检测细胞迁移及侵袭,Western blot检测上皮-间质转化(EMT)相关蛋白的表达情况.结果 (1)与常氧条件培养的U251细胞相比,低氧条件下U251细胞中的TRIM33表达发生下调(P＜0.001).(2)与空白对照组相比,TRIM33组的TRIM33相对表达水平明显升高(P＜0.001).(3)CCK-8实验表明,与空白对照组相比,TRIM33组的细胞增殖活力差异无统计学意义(P＞0.05).(4) Transwell实验结果显示,TRIM33组的迁移及侵袭能力较空白对照组明显降低(均P＜0.05).(5)Western blot结果显示,与空白对照组相比,EMT相关蛋白即波形蛋白、N-钙黏素表达水平均明显降低(均P＜0.01),E-钙黏素表达水平显著升高(P＜0.001).结论 在低氧条件下人脑胶质瘤U251细胞TRIM33表达发生下调,过表达TRIM33可以显著抑制低氧环境对U251细胞迁移、侵袭的影响,其可能是通过影响EMT实现的.TRIM33可作为拮抗低氧微环境的潜在基因治疗靶点.
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血管生成拟态和上皮-间质转化相关标志物在鼻咽癌中的表达及与淋巴结转移的关系
目的：研究鼻咽癌中血管生成拟态（vasculogenic mimicry，VM）和上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相关标记物的表达及与淋巴结转移的关系。方法免疫组化检测82例鼻咽癌和20例鼻咽慢性炎组织E-cadherin、Twist和Vimenitn表达，CD31联合PAS染色检测VM。结果 VM在鼻咽癌组织的阳性率为28.05%，与淋巴结转移具有正相关关系（χ2=6.927， P=0.008）。27例出现E-cadheirn表达减弱甚至缺失，23例和35例出现Vimentin和Twist阳性表达，E-cadherin表达与淋巴结转移具有密切负相关关系（χ2=9.694，P=0.002）， Vimentin和Twist表达均与淋巴结转移具有密切正相关关系（χ2=6.411，P=0.011；χ2=14.576，P=0.000），VM和EMT标志物具有密切相关性（P均<0.000）。结论鼻咽癌中存在VM和EMT，存在VM和发生EMT的鼻咽癌易发生淋巴结转移，VM和EMT具有密切相关性，两者对鼻咽癌转移具有一定的预测价值。
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喉鳞状细胞癌中Snail mRNA表达及临床意义
目的 探讨Snail mRNA在人喉鳞状细胞癌(简称喉癌)组织中的表达及与临床病理特征的关系,并探讨它在喉癌发生、发展中的作用及其临床应用价值.方法 应用原位分子杂交方法检测Snail mRNA在60例喉癌、30例喉不典型增生和20例喉慢性炎症组织中的表达.结果 60例喉癌组织中Snail mRNA的阳性表达率为70%(42/60),分别高于喉不典型增生组织20% (6/30)和喉慢性炎症组织5% (1/20),差异均有显著性统计学意义(χ(2)=18.131,P<0.01;χ(2)=22.946,P<0.01).SnailmRNA与喉癌的甲状软骨累及、淋巴结转移、远处转移、病理分级、TNM分期有关(P均<0.05),而与性别、年龄无关(P均>0.05).结论 Snail高表达可能是喉黏膜恶性转变的重要生物学标志,对预测喉癌浸润转移有重要意义.
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TGFβ和bFGF对晶状体上皮细胞的转分化作用
晶状体上皮细胞的转分化是后发性白内障和前囊下白内障的主要病理改变.目前研究发现有多种调控因素参与晶状体上皮细胞转分化的发生发展过程,其中转化生长因子β(TGFβ)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等生长因子在此过程中起着至关重要的作用,另外细胞外基质等一些因素也与之密不可分.本文就近年来关于TGFβ和bFGF对晶状体上皮细胞的转分化作用、两者的协同作用的研究作一综述.
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慢病毒介导miRNA-184体外转染对人晶状体上皮细胞上皮间质转分化的影响
目的 观察慢病毒介导miRNA-184体外转染对TGF-β2诱导人LEC发生上皮间质转分化(EMT)时其基因表型的影响.方法 实验研究.构建pL/IRES/GFP-miR-184质粒,经慢病毒介导体外转染由TGF-β2诱导而发生EMT的人LEC,利用QRT-PCR检测转染0、6、24 h后人LEC中相关基因E-钙黏蛋白(CDH1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白(VIM)表达水平的变化,并与阴性对照慢病毒侵染组进行比较.采用单因素方差分析进行统计学分析.结果 成功构建pL/IRES/GFP-miR-184质粒,经慢病毒介导转染由TGF-β2诱导而发生EMT的人LEC 24 h后,上皮细胞标志性基因CDH1相对表达量保持相对不变,24 h时为6.30E-06,而对照组则下调,24 h时为1.37E-06,差异有统计学意义(F=261.78,P＜0.01);间质细胞标志性基因α-SMA和VIM的相对表达量均保持相对不变,24 h时分别为1.55E-02和4.61E-04,而对照组则均上调,24 h时分别为2.09E-02和6.73E-04,差异有统计学意义(F=26.21,P=0.007;F=17.91,P=0.013).结论 miRNA-184经慢病毒介导转染人LEC后,能抑制其由TGF-β2诱导所发生的EMT相关的基因表型变化.
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TAK1促进人晶状体上皮细胞上皮间质转化的体外研究
目的 探讨转化生长因子活化蛋白激酶1(TAK1)在LEC上皮间质转化中的作用.方法 实验研究.构建TAK1-pcDNA3和转化生长因子活化蛋白激酶1结合蛋白1(TAB1)-pcDNA3表达载体,采用脂质体介导转染技术将TAK1-pcDNA3和TAB 1-pcDNA3表达载体瞬时转染入人LEC系人晶状体上皮(HLE)B-3细胞中,免疫印迹法测定验证过表达效果.免疫印迹法及免疫荧光染色检测LEC中TAK1、磷酸化的TAK1、E-cadherin和纤维连接蛋白的表达.采用实时定量PCR分析LEC中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原的表达.计量资料比较采用Student'st检验、单样本的t检验或单因素方差分析(多重比较采用LSD检验).结果 通过构建人TAK1-pcDNA3和TAB1-pcDNA3表达载体获得TAK1和TAB1共同过表达的HLE B-3细胞.免疫印迹法测定TAK1蛋白表达量,TAK1-pcDNA3过表达组(1.00±0.03)与对照组(0.19±0.09)对比:t=8.02,P＜0.01;TAB1蛋白表达量,TAB1-pcDNA过表达组(1.00±0.02)与对照组(0.22±0.08)对比:t=7.63,P＜0.01.TAK1和TAB1共同过表达促使HLE B-3细胞内的E-cadherin表达下调:免疫印迹法测定E-cadherin蛋白表达量/Beta-actin,对照组、TAK1和TAB1共同过表达组、TAK1过表达组、TAB1过表达组分别为1.00±0.02、0.12±0.03、0.98±0.09、0.92±0.08(F=31.03,P＜0.01);而纤维连接蛋白表达上调:免疫印迹法测定纤维连接蛋白表达量/Beta-actin,对照组、TAK1和TAB1共同过表达组、TAK1过表达组、TAB1过表达组分别为0.11±0.03、1.00±0.05、0.16±0.04、0.21±0.05(F=35.12,P＜0.01),TAK1和TAB1共同过表达使LEC发生上皮间质转化.HLE B-3细胞在TGF-β2的刺激下明显发生上皮间质转化,但这种效果被TAK1 siRNA和TAK1化学抑制剂所抑制.结论 TAK1可诱导HLE B-3细胞发生上皮间质转化.
