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基于巨噬细胞实时分析的内毒素检测评价技术研究
目的 建立一种基于体外巨噬细胞实时分析的快速、敏感的热原检测技术,为内毒素,即脂多糖(LPS)的检测提供新的方法.方法 体外培养人源性巨噬细胞THP-1,利用倒置相差显微镜观察LPS对巨噬细胞形态变化的影响,然后采用实时细胞分析仪(RTCA)实时监测不同质量浓度的LPS对巨噬细胞形态变化的影响.结果 LPS质量浓度≥10 pg/mL时,可以引起细胞形态变化,实时细胞分析系统可以通过细胞指数(CI)值实时反映这种形态变化,并且随着剂量的变化,CI值也呈剂量相关性变化.结论 实时细胞分析系统可以实时监测LPS对巨噬细胞的影响,从而提供了一个新的体外检测LPS的方法.
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新型永生化人肝细胞系HepZJ的安全性研究
目的 对新型永生化人肝细胞系HepZJ进行安全性研究.方法 获取HepZJ培养上清液,通过PCR联合琼脂糖凝胶电泳法进行支原体检测,通过显色基质法进行内毒素检测;将HepZJ细胞悬液经尾iv进入SD大鼠后观察其生存情况并于不同时间点进行剖检,通实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法分析该细胞系的生物分布;将HepZJ细胞悬液sc进入BALB/c-nu裸鼠后分析其致瘤性.结果 HepZJ支原体检测电泳图未见阳性条带;内毒素检测浓度＜2 EU/mL;SD大鼠尾iv HepZJ后生存情况良好,血液、肺脏、脾脏在不同时间点出现不同程度的GAPDH-Human和TERT-Human基因表达,血液中12h后、肺脏和脾脏中1周后基本被清除,剖检过程中未见肿块形成;裸鼠sc HepZJ后无硬性肿物形成.结论 新型永生化人肝细胞系HepZJ无支原体、细菌污染,进入体内后无明显副反应及致瘤性,具备应用安全性.
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腹内高压对兔肠道通透性及内毒素细菌移位的影响
目的观察不同程度腹内压及作用时间对兔肠粘膜通透性及内毒素、细菌移位的影响,探讨腹内高压(IAH)在腹腔间隙综合征形成及多器官功能障碍中的作用. 方法制作IAH动物模型,通过异硫氢酸荧光素葡聚糖(FITC-Dextran )和辣根过氧化酶Ⅱ型(HRP-Ⅱ)两种分子探针,观察不同程度腹内压力下肠道通透性的改变,检测IAH对肠道细菌、内毒素移位的影响. 结果腹内压(IAP)>20 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)时,门静脉血中FITC-D及HRP-Ⅱ含量显著增高(P < 0.01);IAP为 10 mm Hg作用1、2、4 h,门静脉血中内毒素含量与正常对照组相比无显著改变;20 mm Hg压力作用1 h,内毒素含量即显著增高,并随压力增高及作用时间的延长呈上升趋势.细菌培养结果显示,20 mm Hg压力下1、2、4 h,细菌到肠系膜淋巴结的移位率分别为33.3%、66.7%、100%,2、4 h各有1例移位到肝脏;30 mm Hg时2 h以内,细菌到肠系膜淋巴结的移位率为100%.所有实验组均未出现细菌至脾脏的移位. 结论当IAP>20 mm Hg时肠道通透性显著增加,门静脉血内毒素含量显著升高,细菌可移位至肠系膜淋巴结及肝脏,可能是导致腹腔间隙综合征及多器官功能障碍综合征(MODS)的重要原因之一.
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谷氨酰胺双肽对严重烧伤患者内毒素血症的影响
目的探讨谷氨酰胺双肽对烧伤患者血浆内毒素水平的影响. 方法将30例烧伤面积30%～70%,Ⅲ度面积>20%TBSA的患者随机分为对照组和研究组,研究组于伤后1～1 2 d口服谷氨酰胺双肽粉剂0.5g*kg-1*d-1,对照组给予等量甘氨酸作安慰剂.检测两组伤后1、12 d血浆谷氨酰胺浓度及1、3、6、12 d血浆内毒素的浓度,记录30 d 创面愈合率和总住院日. 结果伤后第1天两组血浆谷氨酰胺浓度较正常值(659.5±35.0)μmol/L明显下降,但两组间差异无显著性意义(P >0.05),第12天对照组谷氨酰胺仍处于低浓度(401.67±65.42)μmol/L,而研究组(593. 47±68.51)μmol/L则接近正常,组间差异有显著性意义 (P<0.05 ).血浆内毒素浓度伤后第1天较正常值(0.033 Eu/ml)均明显升高(P<0.05 ),但两组间差异无显著性意义(P>0.05),第3天研究组内毒素浓度为(0.047±0.017)Eu/ml低于对照组(0.107 ±0.038)Eu/ml(P<0.05).30 d创面愈合率研究组(91±6)%明显高于对照组(85±8)%; 而研究组平均住院日(52±11)d明显低于对照组(67±21)d. 结论口服谷氨酰胺双肽可以维持烧伤患者血浆谷氨酰胺浓度,降低血浆内毒素, 促进创面愈合.
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内毒素与内皮细胞直接结合和损伤特性的研究
目的观察内毒素(LPS)和内皮细胞的结合及损伤特性.方法分离培养大鼠心肌微血管内皮细胞(MMECs),选择不同浓度的LPS及同一浓度不同时相点,作用于贴壁状态的MMECs,应用流式细胞仪、激光共聚焦荧光扫描显微镜(laser confocal scanning microscope, LCSM )进行观察和图象分析.结果 (1)随孵育时间延长,LPS作用后MMECs的OD值逐渐增加,30 min为高点,有时间依赖性.(2)LPS和MMECs共培养2 h,LPS浓度从0.031 25～2.000 00g/L,都可以使MMECs的阳性细胞数及OD值增加,0.2500g/L时是OD值的峰值,提示该浓度是LPS与MMECs的佳结合浓度,有浓度的饱和性.(3)LPS可以进入MMECs胞浆和胞核.(4)LPS可导致MMECs的核移位和脱核.结论 (1)LPS在无血清状况下可以与内皮细胞结合,并进入细胞核.(2)LPS可导致内皮细胞的直接损伤.
关键词： 激光共聚焦荧光扫描显微镜 内毒素 心肌微血管内皮细胞 -
内毒素对人脐静脉内皮细胞形态和功能-的影响
目的研究内毒素对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)形态和功能的影响,探讨内毒素对血管内皮细胞的激活全身性炎症反应、脓毒症、多器官功能衰竭中的作用.方法以体外培养的人脐静脉内皮细胞为模型,应用倒置显微镜观察内毒素对HUVEC形态的影响;ELISA双抗夹心法测定IL-6的含量;应用免疫荧光染色法,激光共聚焦扫描显微镜观察细胞间粘附分子-1(ICAM-1)的表达.结果内毒素可明显改变HUVEC的形态,使其发生长梭状变形.刺激HUVEC分泌IL-6的小剂量为1ng/ml,呈剂量依赖性增加,8 h达高峰.激光共聚焦扫描显微镜观察结果显示,LPS 10ng/ml与HUVEC作用24 h后,ICAM-1在核膜及细胞膜的表达都明显增强.结论内毒素可明显改变HUVEC的形态和功能,对增加血管通透性,促进白细胞粘附,在炎症瀑布反应的触发过程中可能起着重要的始动作用.
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严重烧伤患者早期短程应用高效抗生素的研究
目的探讨早期短程应用高效抗生素对严重烧伤后患者感染的防治效果。方法烧伤患者35例，烧伤面积50％～95％。根据高效抗生素使用时机分为早防组(20例，伤后6 h内开始)和迟防组(15例，伤后48 h开始)。动态检测血浆内毒素( lipopolysaccharide, LPS ) 、肿瘤坏死因子(TNFα)和白细胞介素-8(IL-8)的变化，严密观察脓毒症各项指标。结果大面积烧伤后血LPS、TNFα和IL-8明显升高，于伤后3～5 d达高峰，但早防组明显低于迟防组(P＜0.05～0.001)。伤后2周内脓毒症、内脏并发症的发生率，早防组明显低于迟防组(P＜0.05)；伤后4～7 d痂下组织菌量，早防组明显低于迟防组(P＜0.01)。结论严重烧伤早期短程使用高效抗生素，能有效预防烧伤后感染，并可降低内脏并发症的发生。
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BPI作为内毒素自然抑制物的作用研究
目的确认杀菌性/通透性增加蛋白( bactericidal/permeability increasing protin, BPI)作为机体的自然防御武器在人中性粒细胞中的存在状态。方法检测猪源BPI与内毒素( lipopolysaccharide, LPS)的结合能力及其对LPS诱导的肝库普弗细胞分泌TNFα的抑制作用，并采用流式细胞仪测定LPS刺激后PMNL中BPI的表达情况。结果猪源BPI与内毒素结合能力随着BPI浓度的增加而增加，其抑制LPS诱导肝库普弗细胞分泌TNFα的作用呈剂量效应依赖关系。在LPS刺激30 min内，BPI在PMNL表面的表达即明显增加，但并未立即释放人血。结论 BPI具有强大的中和内毒素能力，在G-杆菌感染情况下补充外源BPI可能是有益的
关键词： 杀菌性/通透性增加蛋白 内毒素 肿瘤坏死因子α -
蜕皮甾酮对内毒素所致培养脐静脉内皮细胞凋亡和坏死的影响
目的 研究蜕皮甾酮(ecdysterone EDS)对内毒素（LPS）所导致的脐静脉内皮细胞(HUVECs)凋亡和坏死的保护作用。 方法 采用体外培养HUVECs为模型，LPS作为致伤因素，EDS作为保护因素，应用流式细胞仪和荧光显微镜观测培养HUVECs凋亡和坏死的变化。 结果 正常培养的血管内皮细胞凋亡和坏死较少，LPS刺激后细胞凋亡和坏死同时增加，凋亡增加幅度大于坏死，EDS处理后凋亡和坏死同时减少。 结论 提示EDS对LPS导致的HUVECs凋亡、坏死有一定的调节作用。
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治愈大面积烧伤伴急性肾衰一例
患者,男,29岁.汽油火焰烧伤75%TBSA,5 h后入院.入院前在当地医院输液共2 500 ml,其中低分子右旋糖酐500 ml.查体:体温37.8℃,呼吸24次/min,脉搏100次/min,血压90/56 mmHg(1 mmHg＝0.133 kPa),意识淡漠,四肢冰凉.血生化检查:血钾3.81 mmol/L,钠143.40 mmol/L,氯103.80 mmol/L,尿素氮5.29 mmol/L,肌酐110.00 μmol/L.给予补液抗休克、抗感染(头孢唑啉+丁胺卡那毒素)等治疗.休克期平均尿量为80 ml/h.于伤后第5天在全麻下行切痂后自体、异体皮移植术.围手术期连续3 d应用头孢他啶(3 g/d).术后移植皮片紧贴创面,无皮下积脓,痂下组织细菌培养为阴性.第9天患者出现尿少、嗜睡、乏力、腹胀等症状,尿量为520 ml/d,血钾5.19 mmol/L,钠122.00mmol/L.氯94.00 mmol/L,尿素氮30.54 mmol/L,肌酐674.00μmol/L,内毒素(鲎试验检测)52.30 ng/L(正常值为0.8～1.02 ng/L).诊断:急性肾衰伴低钠血症.给予质量浓度为30 g/L的氯化钠及利尿合剂(多巴胺20 mg+妥拉明5 mg+速尿200 mg)处理后症状有所缓解,尿量维持在1 5ml/d左右,血钾6.04 mmol/L,钠1 30 80 mmol/L,氯95.00mmol/L,尿素氮80.12 mol/L,肌酐366.00 μmol/L,内毒素136.05 ng/L.于次日开始连续3 d进行血液透析,尿量增至4 300 ml/d,并呈增加趋势,尿素氮、肌酐和内毒素含量逐渐下降.以后又进行了4次血液透析,至伤后1个半月,患者尿量、肝肾功能及电解质含量均转为正常.在此期间还进行了烧伤面积约20%的切(削)痂植皮.伤后2个月患者病情平稳,创面愈合出院.
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脆弱类杆菌内毒素/脂多糖对正常人外周血单核细胞分泌肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β的影响
感染和脓毒性休克,至今仍然是严重烧(创)伤或大手术后患者面临的严重问题,是影响创面愈合的关键因素[1].此时患者免疫力下降,厌氧菌所致脓毒症的发生率呈上升趋势,脆弱类杆菌等条件致病菌在其中占较大比例,成为严重烧伤常见的并发症和死亡原因之一.
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内毒素/脂多糖对小鼠腹腔巨噬细胞膜Toll样受体2及4表达的影响
内毒素/脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革兰阴性菌内毒素的主要成分,是导致感染和中毒性休克乃至患者死亡的重要原因之一.目前临床上尚无既能杀菌又能中和LPS的有效手段[1].因此加强对LPS致病机制的深入研究,将有助于寻找新的治疗中毒性休克的途径.本研究采用双荧光抗体标记法,通过流式细胞仪观察LPS刺激后小鼠腹腔巨噬细胞(Mφ)胞膜上Toll样受体(TLR)2和TLR4表达的变化,以探讨其致病机制.
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抗内毒素研究进展
内毒素(endotoxin)是革兰阴性菌细胞壁外膜的结构成分之一,其化学本质为脂多糖(lipopolysac-charide,LPS).LPS主要由O特异性侧链、核心多糖、脂质A(lipid A)3部分组成,其中lipid A为其毒性中心.在创伤、感染引起的全身炎症反应综合征(SIRS)及脓毒症中,内毒素是重要的致病因子.近年来虽然大量广谱、高效抗生素的应用为临床治疗感染性疾病提供了有力的措施,但并没有从根本上改变脓毒症患者高病死率的现状.
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Toll样受体与脓毒症的研究进展
脓毒症系感染引起的全身性炎症反应,进一步可发展为脓毒性休克和多器官功能障碍综合征,是严重创、烧伤患者死亡的主要原因之一,但其确切的发病机制迄今尚未完全阐明.以往研究表明,多种病原微生物的细胞壁成分[如革兰阴性菌的内毒素(LPS)、革兰阳性菌的肽聚糖(PGN)和脂磷壁酸(LTA)等]具有强大的抗原刺激能力,均可通过与细胞表面的蛋白质受体-CD14结合,促进单核/巨噬细胞、中性粒细胞及淋巴细胞等活化,并释放大量炎症介质,终导致失控性炎症反应.
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严重烧伤后的肠源性感染
1962年,肖光夏等[1]提出了肠源性感染的概念,1965年,Markley等在实验中观察到,无菌烧伤动物的生存率高于普通烧伤动物.无菌动物在烧伤前服用大肠杆菌组的生存率明显低于未服菌组.说明在严重烧伤后,肠道内细菌可能参与整个病程的发展.1983年,马利等[2]以异硫氰荧光素标记肠道菌,进行烧伤动物的体内示踪,证明了严重烧伤后的肠道菌能移位到血液与肝、脾、肺、肾.随后,彭毅志等[3]以直接荧光标菌法,在荧光显微镜下,直接观察到组织匀浆中存在游动的示踪活菌.府伟灵等[4]用丫啶橙荧光素标菌,发现少量肠道菌还可布散至烧伤创面痂下组织,并加用PUC载体菌示踪,限制性内切酶图谱证明其同源性.1990年,郭力[5]等也报道了厌氧菌、真菌也可由肠道移位.1994年,刘友生等[6]以125Ⅰ标记肠道内毒素,进行了动物体内示踪,放射自显影显示,烧伤后3 h所示踪的内毒素颗粒已出现肝脏库普弗细胞与邻近肝窦的肝细胞,伤后6～12 h可达峰值.
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抗生素诱导革兰阴性杆菌释放内毒素
感染尤其是革兰阴性杆菌感染，仍然是严重烧、创伤患者的主要死亡原因之一[1]。据报道，某些敏感的抗生素虽能杀灭细菌，使血培养结果转阴，但临床病情却继续恶化，革兰阴性细菌感染的死亡率并未明显降低[2]。专家认为，这种恶化的原因很可能是抗生素在杀灭细菌的同时，诱导其释放大量的内毒素（ endotoxin, ED)进入血循环所致[3,4]。
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髓样分化蛋白2在内毒素/脂多糖激活人脐静脉内皮细胞中作用的实验研究
目的探讨髓样分化蛋白2(MD-2)在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中的表达及其在内毒素/脂多糖(LPS)激活HUVEC中的作用. 方法分离、培养HUVEC,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)方法,检测LPS刺激前后HUVEC 的MD-2 mRNA及其蛋白表达水平,用目的条带吸光度(A)值表示;HUVEC转染0.5、1.0、2.0 μg MD-2突变质粒(MD-2C95Y)及2.0 μg pEF-BOS空载体质粒、2.0 μg MD-2质粒后, 观察LPS刺激对HUVEC核因子(NF)κB活性和其分泌白细胞介素(IL)8能力的影响, NF-κB的测定值用A450 nm表示. 结果 LPS刺激前, HUVEC MD-2 mRNA及蛋白有表达, LPS能明显上调其表达水平, 并呈一定的时间和剂量依赖性 .LPS刺激前MD-2蛋白A值为25 196±1 723,明显低于0.01 mg/L LPS刺激6 h的A值(58 817±3 241,P<0.01);转染MD-2C95Y能明显抑制LPS对HUVEC NF-κB的激活和IL-8的分泌. 结论 MD-2在LPS激活/损伤HUVEC效应中具有重要的地位.
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连续肾替代治疗对严重烧伤脓毒症患者血浆内毒素和细胞因子水平的影响
目的分析连续肾替代治疗(continuous renal replacement therapy,CRRT)对严重烧伤脓毒症患者血浆内毒素和细胞因子水平的影响. 方法对10例应用CRRT及10例应用常规疗法治疗的严重烧伤脓毒症患者血浆内毒素和细胞因子(TNFα、IL-1β、IL-6、IL-8)浓度变化进行比较分析. 结果严重烧伤脓毒症患者应用CRRT后血浆内毒素、细胞因子浓度较治疗前明显下降,其下降速度与常规治疗组比较差异有非常显著性意义(P<0.01). 结论严重烧伤脓毒症患者应用CRRT能有效降低血浆内毒素和细胞因子浓度.
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杀菌性/通透性增加蛋白模拟肽中和内毒素作用的研究
目的观察4种杀菌性/通透性增加蛋白(BPI)模拟肽(10342、10343、10344、10345)体内外中和内毒素(LPS)的作用. 方法采用定量鲎基质显色法测定BPI模拟肽体外中和LPS的能力; 采用尾静脉给药方法, 观察BPI模拟肽对LPS攻击小鼠的保护作用;测定BPI模拟肽对LPS血症模型大鼠TNFα及IL-6影响. 结果 BPI模拟肽具有中和LPS的能力,中和能力随浓度增加而增加,其中10342的作用强;不同BPI模拟肽对LPS血症小鼠具有强大的保护作用,保护率达90%,并可明显降低LPS血症模型大鼠各时相点血清TNFα及IL-6水平. 结论杀菌性/通透性增加蛋白(BPI)模拟肽不仅具有体外中和LPS的能力,而且对LPS血症动物具有强大的保护作用.
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烫伤合并金葡菌感染大鼠组织CD14 mRNA的改变
目的探讨细菌脂多糖受体CD14在烫伤合并金黄色葡萄球菌(金葡菌)感染中的变化规律及其意义. 方法采用大鼠20%总体表面积Ⅲ度烫伤合并金葡菌攻击造成脓毒症模型,动态检测心、肝、肺、肾等重要器官中CD14 mRNA表达的改变,同时观察内毒素在动物循环及主要脏器内的分布特点. 结果烫伤合并金葡菌脓毒症早期,各脏器内毒素含量即明显高于正常对照组,并于2～6 h达峰值,其中以肝、肺组织内毒素水平升高幅度为显著(P<0.05).而血浆内毒素水平亦于伤后2 h显著高于正常对照组(分别为0.305 6 EU/ml和0.125 0 EU/ml, P<0.05).与此同时,小肠组织中二胺氧化酶的活性明显降低(P<0.05).烫伤合并金葡菌感染后,各组织CD14 mRNA的表达亦呈不同程度升高(P<0.05),其中肺脏改变尤为显著,伤后6、24 h肺脏CD14 mRNA表达分别为正常对照组的1.80和1.81倍. 结论烫伤合并金葡菌攻击可导致内毒素移位和组织CD14 mRNA表达不同程度升高,CD14基因表达的上调可能与移位内毒素的刺激作用有关.
