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利用磁珠分选和单细胞RT-PCR筛选HIV-1 Env特异性单克隆抗体的研究
目的 建立一种简单易行的从HIV-1感染者中筛选包膜糖蛋白(envelope glycoprotein,Env)特异性单克隆抗体的方法.方法 采集HIV-1感染者抗凝全血,分离外周血单个核细胞,利用生物素标记的HIV Gp120抗原与B细胞膜上的IgG特异性结合,然后用链霉亲和素标记的磁珠分选出能够产生Env特异性抗体的记忆性B细胞.用单细胞RT-PCR法从记忆性B细胞中扩增抗体的重链可变区基因与轻链可变区的基因并克隆到表达载体中,将携带重链基因的质粒与携带轻链基因的质粒共转染293T细胞,获得HIV-1特异性人单克隆抗体,并进行抗体结合活性的鉴定.结果 从1例我国HIV-1感染者记忆性B细胞中筛选出3株对HIV-1 Env抗原有结合活性的单克隆抗体.结论 利用生物素标记抗原与记忆性B细胞特异结合,并用亲和素标记的磁珠对细胞进行分选,结合单细胞RT-PCR技术可以成功筛选出抗原特异性的单克隆抗体.
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NucliSens HIV-1 QT和Amplicor HIV-1 monitor1.5方法测定HIV-1病毒载量的比较研究
目的 进行NucliSens HIV-1 QT和Amplicor HIV-1 monitor 1.5检测相同临床样品HIV-1病毒载量值之问的比较研究.方法 收集临床样本82份,使用两种方法测定病毒载量,对病毒载量值进行统计分析.结果 未测到核酸的和两种方法病毒载量对数值之差小于0.5的占88.9%;用△log10 VL＜0.5的56份样本统计两种方法的相关性,相关系数为0.956.结论 NucliSens HIV-1 QT和Amplicor HIV-1 monitor 1.5两种方法测定的HIV病毒载量值有很好的相关性.
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应用多重巢式PCR法快速鉴定广西HIV-1主要亚型
目的 建立快速鉴定广西HIV-1主要流行亚型CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC、B和C的多重巢式PCR方法.方法 针对HIV-1 gag基因设计CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC、B和C亚型特异性引物,建立多重巢式PCR法,用该法鉴定来自广西的HIV-1毒株的亚型,并与基因测序法的鉴定结果比较.结果 多重巢式PCR法能正确鉴别5种已知亚型的样本,10份HIV阴性样本均无扩增,在72份未知亚型样本中,正确鉴定出66份,分别属于CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC、B亚型,多重巢式PCR法的灵敏度为91.7%,特异度达100%.结论 多重巢式PCR法能准确鉴定广西CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC和B亚型毒株,是一种简便、快速、低成本的亚型鉴定方法.
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广西HIV-1重组毒株env区快速基因分型方法的建立
目的 建立一种快速简便的基因分型方法,对广西HIV-1重组毒株env基因区进行亚型鉴定.方法 从HIV阳性样品中提取核酸,使用HIV-1 M组通用引物对env区进行第一轮扩增,第二轮则使用分别检测B'/C或C亚型和CRF01-AE亚型的二套特异性引物放入同一反应管中进行扩增,根据不同亚型扩增的目的带位置不同来判断亚型.将通用引物扩增出的所有样本均进行基因测序和系统树分析以验证结果.结果 50份样本中,经基因测序和系统树分析证实CRF08-BC样本3份(6%),CRF01-AE样本43份(86%),4份(8%)样本无法确定亚型.经亚型特异性引物PCR法检测得出B'/C或C亚型样本3份(100%),CRF01-AE样本39份(90.7%),灵敏度为91.3%,特异度为100%.两种方法检测结果经差异性检验显示x2=2.25,P＞0.05,差异无统计学意义,结果一致者占92%.与基因分析结果吻合.重复实验显示CRF08-BC平均重复性为100%(10/10),CRF01-AE为93.8%(61/65).结论 该方法是一种简便、快速、低成本,具有高度灵敏性和特异性的HIV-1毒株env基因区分型法,能够直接对广西HIV-1 CRF01-AE重组毒株进行鉴定.
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HIV-1 P24人源化单克隆抗体的制备及鉴定
目的 通过建立新型人源化抗HIV-1 P24单克隆抗体制备技术平台,研制1～2种抗HIV-1 P24抗体.方法 使用连接P24的磁珠分选特异性分泌P24抗体的B细胞,有限稀释后,提取总mRNA,采用逆转录和巢式PCR扩增免疫球蛋白重链和轻链基因,经测序鉴定后克隆到真核表达载体Cloning vector AbVec-hIgG1、Cloning vector AbVec-hIgKappa、Cloning vector AbVec-hIgLambda中;通过瞬时转染293T细胞得到重组抗体;使用proteinA亲和层析纯化抗体.结果 成功筛选到5对抗HIV-1 P24的人源单克隆抗体基因.结论 本研究初步成功地建立了人源化HIV-1 P24单克隆抗体的制备及纯化方法,为HIV早期诊断以及筛选其他人源化单克隆抗体奠定了基础.
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基于狂犬病病毒载体的基因工程疫苗研究进展
对HIV-1和HCV等重大传染性疾病传统疫苗研制的失败,让科学家们把目光转向开发新型疫苗研制策略.其中之一就是用减毒的重组病毒载体表达外源抗原来免疫,可以保护个体免受相应病原体的暴露威胁.一种新的手段就是从cDNA克隆拯救单股负链RNA病毒,这一技术为弹状病毒科成员用于疫苗载体和生物医学工具打开了一扇窗.
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HIV-1Tat蛋白对血脑屏障的作用及其分子机制
HIV-1感染机体后,可作用于血脑屏障(blood brain barrier,BBB)相关细胞,引起其结构和功能异常,这有利于HIV-1入侵中枢神经系统.损伤BBB的分子机制有多种,其中Tat蛋白作为HIV-1反式转录激活因子,可损伤血管内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞,降低紧密连接蛋白表达.而且一些化学物质如甲基苯丙胺,可协同HIV-1 Tat蛋白损伤BBB.本文就HIV-1 Tat蛋白对BBB的作用及其分子机制的研究进展作一综述.
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滤泡辅助性T细胞及其相关因子在HIV疾病进展中的变化研究
目的 通过对不同疾病进展阶段的HIV感染者外周血滤泡辅助性T细胞( follicular helper T cell, Tfh)进行分析,探讨Tfh及其相关因子对HIV感染疾病进程的影响,为进一步研究Tfh在HIV抗病毒治疗和疫苗研究提供科学依据.方法 本研究招募HIV-1感染者33例,根据疾病进展情况分为HIV-1长期不进展者(long-term nonprogressors, LTNP)11例、快速进展者(rapid progressors, RP)10例、HIV典型进展者(typical progressors, TP)12例,同时招募11名健康人(normal control, NC)作为对照.分离受试者外周血单个核细胞,用多色流式的方法检测 CD4+CD45RA-CXCR5+Tfh 和CD4+CD45RA-CXCR3-CXCR5+PD-1+Tfh及其表达ICOS、IFN-γ、IL-21因子的水平.此外,对血浆IL-10和CD19+B细胞频数也进行分析,探讨Tfh与CD4、B细胞的关系.结果 两个Tfh亚群比例在HIV-1感染人群均比正常对照高,CD4+CD45RA-CXCR5+Tfh在LTNP人群高,与正常对照比较差异有统计学意义(P<0. 05). Tfh相关因子ICOS、IFN-γ、IL-21在T细胞刺激剂作用下均有明显升高,ICOS+Tfh与HIV-1疾病进展呈负相关,与CD19+B细胞呈正相关(r=-0. 49,P<0. 01;r=0. 60,P<0. 05).血浆IL-10的浓度在HIV-1感染者中有明显升高,TP组高,其次为RP组(TP组vs NC组,P<0. 01;RP组vs NC组,P<0. 05).结论 外周血Tfh及其相关因子的表达在HIV-1感染者与健康对照者间差异有统计学意义,特定亚群Tfh与HIV-1疾病进展和B细胞功能密切相关.
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HIV-1包膜蛋白2G12和2F5中和表位的改造对假病毒形成及中和活性的影响
目的 研究HIV-1膜蛋白(Env)特定中和表位的改造对功能性假病毒形成及中和活性的影响.方法 采用环形诱变及Dpn I筛选的方法对Env进行定点突变,将2G12和2F5两个中和表位整合入不含该表位的BC亚型的Env上,比较改造对假病毒的形成情况及对2G12和2F5单抗的中和活性的影响.结果 对5株假病毒(BC02、BE03、BC04、BC05和BC12)的Env特定中和表位进行改造,其中BC04和BCl2的2G12表位改造后,不能形成假病毒,BC02、BC03和BC05增加2G12和2F5两个表位后,仍能够形成假病毒,且假病毒滴度较改造前无明显变化,改造后的BC03假病毒较改造前对单抗2G12和2175的中和活性均有所提高,而改造后的BE02和BC05假病毒较改造前对单抗2F5的中和活性增强,而对单抗2G12的中和活性无变化.结论 2G12中和表位部分位点的改造影响假病毒的形成,中和表位的增加能够提高单抗2G12的中和活性,为免疫原的优化提供了新思路.
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山东省部分HIV-1流行株的亚型分析和序列特征研究
目的对山东省HIV-1流行毒株进行亚型分析,并研究其变异特征. 方法采集26份HIV-1感染者的外周静脉抗凝血,提取前病毒DNA进行体外扩增,获得包膜蛋白(env)基因的核酸片段,并对其C2-V3及邻区的核苷酸进行测定和分析. 结果基因和氨基酸序列分析表明,26份标本中存在4种亚型和重组毒株(B′、C、A、A/E),其中B′ 17株,其组内基因距离为11.69±4.19.V3环顶端四肽有6种形式,多的是GPGQ(15株)、GPGR(6株).V3环第11、25位氨基酸出现变异,并有1株呈电荷双阳性. 结论山东省HIV-1流行株亚型较多,有重组毒株出现的可能,基因发生较大变异,HIV-1传播在山东省有加快的趋势.
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我国HIV-1 B'亚型毒株gag基因变异特征研究
目的 研究我国人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)B'亚型主要流行株在宿主免疫压力下的基因变异及抗原表位的变化特征,探讨选择压力、基因离散率和抗原表位变化之间的关系.方法 从确诊的HIV-1感染者的全血样本中提取基因组DNA,经套式聚合酶链反应(PCR)扩增后,将扩增产物进行纯化和测序.然后将所得序列进行系统进化树和氨基酸变异分析,使用GCG软件包的Distance程序对P17和P24两个区段计算基因距离,用Diverge程序计算同义替换(Ks)和非同义替换(Ka)及二者之间的比值,并对我国人群中较常见的HLA型别限制的CTL表位的突变情况进行分析.结果 HIV-1 B'亚型毒株的P17区段的Ks/Ka值＜1,而P24区段的Ks/Ka值＞1;P24部分的基因离散率低于P17部分;P17区段抗原表位的保守率为34.94%,而P24区段抗原表位的保守率为67.38%;从基因离散率、所受的选择压力及抗原表位的突变率3个方面来看,HIV-1的P17区段均明显大于P24区段.结论 HIV-1 B'亚型毒株的P17区段的抗原表位变化较大,而P24区段的抗原表位相对较为保守.提示P24区段的CTL表位更适合于表位疫苗的研制.
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表达HIV-1 gag-gp120嵌合基因酵母工程菌的构建及表达条件的优化
目的构建表达HIV-1 gag-gp120嵌合基因的酵母工程菌,并优化表达条件. 方法将gag-gp120嵌合基因插入到酵母表达载体pHILS1中,构建了表达质粒pHILGP.线性化质粒电转化毕赤酵母菌GS115后进行整合,通过PCR及表达产物的SDS-PAGE和ELISA等方法筛选阳性酵母工程菌,并优化表达条件. 结果成功构建表达融合蛋白的酵母工程菌,表达量为13%左右.表达蛋白能与HIV-1阳性血清发生反应,但其相对分子质量(Mr)比预计计算的值要小.佳表达条件为:BMMY培养基,85%溶解氧,培养时间3*!d,1%甲醇诱导浓度. 结论表达的融合蛋白具有很好的抗原特异性,存在于上清中,这有利于目的蛋白的分离纯化.
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HIV-1感染引起组蛋白乙酰化和增加p21WAF1表达
目的 DNA甲基化和组蛋白乙酰化是基因表达调控的主要形式.人类免疫缺陷病毒(HIV-1)可引起T淋巴细胞DNA甲基化酶上调.本文旨在明确HIV-1对细胞周期依赖激酶抑制剂p21WAF1表达的影响. 方法建立HIV-1感染的Hut 78细胞系;以RT-PCR和Western blotting分析p21WAF1表达情况;以亚硫酸氢钠修饰DNA和基因测序,研究p21WAF1基因启动子甲基化,以Western blotting和染色体免疫测定探究总组蛋白和与p21WAF1基因启动子相关的组蛋白乙酰化水平.并以GST pull-down和免疫沉淀分析HIV-1导致乙酰化及乙酰化引起p21WAF1过表达的可能机理. 结果 HIV-1感染后,其反式激活蛋白Tat与辅助转录因子P/CAF、hGCN5结合,共同刺激组蛋白H3乙酰化.尽管p21WAF1启动子部分区域有甲基化发生,但p21WAF1表达仍上调 .这可能与E2A对p21WAF1的作用有关. 结论 HIV-1感染可引起T淋巴细胞p21WAF1基因的甲基化和乙酰化紊乱,导致p21WAF1表达增强.
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HIV-1 B'亚型R5或R5/X4嗜性毒株在GHOST细胞的感染性分析
目的 分析我国HIV-1B'亚型R5或R5/X4嗜性毒株在GHOST细胞的感染性.方法 采用传统的共培养方法从HIV-1感染者PBMC中分离并培养病毒,用表达CD4和趋化因子受体CCR5或CXCR4的GHOST细胞系,测定毒株的辅助受体利用情况,使用相同病毒量即2 ng的HIV-1 p24分别感染表达不同受体的GHOST细胞系,通过流式细胞仪检测分析绿色荧光蛋白(GFP)的表达反映病毒感染细胞的能力.结果 35例B'亚型毒株利用CCR5受体,占22例(62.85%),双嗜性即CCRS/CX-CR4均阳性占13例(37.15%).GHOST-R5/X4细胞的感染性分析结果显示,R5/X4双嗜性毒株的感染性明显高于CD4＞200/ta的R5毒株的感染性(P＜0.05);R5/X4毒株与CD≤200/μl的R5毒株感染性比较差异无统计学意义(P＞0.05);CIM＞200/μl的R5毒株与CD4≤200/μl的R5毒株感染性比较差异有统计学意义(P＜0.05);GHOST-CCR5细胞感染性分析结果显示:R5/x4双嗜性毒株的感染性明显下降,与CD4＞200/μl的R5毒株的感染性比较差异无统计学意义(P＞0.05).利用相同剂量的双嗜性毒株分别感染R5、X4或R5/X4的GHOST细胞系,显示双嗜性毒株可同时利用CCR5和CXCR4辅助受体,但69.23%的R5/X4毒株以CCR5受体为主,30.77%的R5/X4毒株CXCR4受体为主.结论 HIV-1 B'亚型R5/X4病毒不仅有更广泛的宿主细胞嗜性,而且在GHOST-R5/X4细胞中感染性明显提高.持续使用CCR5受体的毒株在疾病进展的过程中虽然辅助受体的利用是一样的,但病毒感染细胞的能力增加.
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HIV-1型整合酶蛋白的表达、纯化及复性研究
目的 对HIV-1整合酶蛋白进行原核表达、纯化以及复性研究.方法 从HIV-1 HXB2中PCR扩增出全长的整合酶基因,连入原核表达载体pET-30a中,得到pET-30a整合酶表达质粒.再将质粒转人大肠杆菌BL21中诱导表达,经镍柱纯化后得到整合酶蛋白.纯化后蛋白在FoldIt复性液中进行稀释复性确定佳复性液,然后蛋白在此条件下复性并用反相柱回收,后通过对复性蛋白抽干及再溶分析复性蛋白的物理稳定性.结果 HIV-1整合酶蛋白主要以包涵体形式表达,表达量占菌体总量的10%.经镍柱纯化后蛋白的总浓度为0.9 mg/ml.蛋白的佳复性液是:Tris-Cl 55 mmol/L,NaCl 264 mmol/L,KCl 11 mmol/L,Gu-HCl 550 mmol/L,EDTA 1.1 mmol/L,以及附加成分中的GSH、GSSG.复性后蛋白抽干后再溶,溶液清亮透明,SDS-PAGE可见有寡聚体状态的蛋白.结论 成功构建了pET-30a整合酶表达质粒.纯化后蛋白的浓度较高.确定了佳的蛋白复性液.并且初步检测了复性蛋白的物理稳定性.这为蛋白体外活性研究和AIDS药物研究打下了基础.
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5株不同亚型HIV-1毒株gp120序列特征分析及其蛋白的表达
目的 分析我国HIV-1主要亚型毒株的gp120区域的序列特征,并表达出gp120糖基化蛋白,为研究gp120的致病机制和设计疫苗奠定基础.方法 利用巢式PCR从来自于不同省份的5名HIV-1感染者外周血单个核细胞DNA中扩增全长gp120基因并测序,对序列特征进行分析,并将获得的gp120基因克隆入真核表达载体,体外表达获得gp120糖基化蛋白.结果 序列分析显示,此5条gp120序列分属HIV-1 Thai-B、BC重组和AE重组哑型,虽然亚型不同,但这些gp120序列在相同的位置都存在着一些保守的糖基化位点,且都具备相同的Furin蛋白酶第一切割位点,与参考序列比较发现,不同的HIV亚型序列中,除V3序列长度较为保守外,V1、V2、V4、V5各区域都有不同程度的缺失现象,与BC重组和AE重组亚型相比,Thai-B亚型V3的顶端环呈现出多种组合.终将这5条gpl20序列都克隆人真核表达载体并表达出糖基化的gp120蛋白.结论 在设计疫苗和检测试剂时应考虑到膜区的高变性,gp120糖蛋白的体外表达有利于进一步开展针对我国主要HIV流行毒株膜蛋白致病机制和疫苗学的研究.
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HIV-1 Vpr对细胞周期的影响和致凋亡作用的研究
目的 研究人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的vpr基因和不同变异株对宿主细胞周期和凋亡的影响,以及其致细胞周期变化和致细胞凋亡机制的两者间的可能关系.方法 将14个带有不同变异位点的中国感染者HIV-1 upr片段分别连入pcDNA3.1(+)真核表达载体,构建重组质粒.将这些重组质粒电转染Jurkat细胞,并设立保守株vpr基因转染细胞、突变株vpr-Fs基因转染细胞、空载体转染细胞和未转染细胞作为对照.经G418选择培养及RT-PCR检测目的基因转染成功后,PI染色,流式细胞仪检测被转染细胞的细胞周期分布和细胞凋亡.结果 流式细胞仪检测上述14个带有不同变异位点的HIV-1 vpr基因片段的Jurkat细胞,发现转染保守片段HIV-1 vpr的Jurkat细胞,其细胞周期出现G_2期阻滞和细胞凋亡率明显升高,但转染vpr C端截断的vpr-Fs片段的细胞、空载体peDNA3.1(+)转染细胞和未转染的Jurkat细胞无此现象.转染了,HIV-1 vpr基因序列相对应的Vpr蛋白中含有70V、85P、86G、94G突变的片段,较vpr保守片段其致感染细胞G_2期阻滞和凋亡的能力明显下降,且Vpr蛋白的AE亚型致细胞周期阻滞和致凋亡能力较其他亚型普遍为低.初步发现vpr诱导G2期阻滞百分比越高其所致凋亡率越高.结论 HIV-I vpr基因有明显的致感染细胞G_2周期阻滞和致细胞凋亡的作用,但vpr C端截断的vpr-Fs片段无此功能.首次发现中国感染者HIV-1 vpr基因表达蛋白的70V、85P、86G、94G位点突变能使其致感染细胞G_2期阻滞和凋亡的能力下降,Vpr的AE亚型致细胞周期阻滞和凋亡能力较其他亚型普遍为低.对14个变异片段的分析显示vpr诱导G_2期阻滞的程度与其致凋亡水平可能相关,提示两者的发生机制可能有一定的关联.本研究为进一步探讨HIV-1致病机制和探索可能的基因干预措施打下基础.
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HIV-1拉米夫定(3TC)耐药毒株的体外诱导培育和鉴定
目的通过体外传代培养,将我国HIV-1药物敏感毒株诱导为拉米夫定耐药毒株.方法在MT4细胞-中国HIV-1B'亚型CNHN24毒株培养系统中加入0.008 μmol/L拉米夫定,逐渐增加药物浓度进行传代和培养,每隔3～5代测定半数抑制浓度(IC50),并用RT-PCR法扩增pol区基因,进行基因型耐药性分析.将表型和基因型耐药结果与敏感株进行比较.结果培养6代后,IC50由野生毒株的0.018 μmol/L逐渐提高到0.15 μmol/L;第7代时,IC50突然增加到大于2048 μmol/L;pol区的184位氨基酸由甲硫氨酸(M)突变为异亮氨酸(I).去除药物继续培养5代,IVC50仍维持＞2048 μmol/L,pol区184位氨基酸仍为异亮氨酸,没有发生回复突变.结论在国内首次用中国HIV-1毒株诱导培育出可能稳定传代的3TC耐药株,可用于HIV-1耐药性的研究和HIV-1药物的药效学评价.该耐药株已申请国家专利.
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河南省部分艾滋病患者抗病毒治疗的临床效果以及基因型耐药性分析
目的了解河南省部分地区HIV-1感染者抗病毒治疗临床效果,分析服药依从性与治疗效果关系;与未进行抗病毒治疗的患者相比较,分析治疗后病毒耐药性突变发生和流行情况. 方法通过问卷调查、CD4+细胞测定评价抗病毒治疗的临床效果;用RT-PCR方法扩增HIV-1 pol区基因,进行基因型耐药性分析. 结果接受抗病毒治疗的人群中,坚持服药的病人55.08%病情明显好转,而未坚持服药的病人仅有6.78%病情明显好转,服药依从性对病情趋势变化具有显著影响(P＜0.05);接受抗病毒治疗的病人CD4+淋巴细胞均值为(429.38±7.89)个/μl,未治疗的病人CD4+淋巴细胞均值为(201.43±8.72)个/μl,治疗后患者CD4+淋巴细胞计数显著高于未治疗的患者(P＜0.05);基因型耐药性检测结果表明,相对于未经治疗的患者,经过抗病毒治疗的患者对逆转录酶抑制剂的耐药性突变显著高于未治疗的患者(χ2=19.4285, P＜0.05);治疗人群与未治疗人群对蛋白酶抑制剂的耐药突变差异无统计学意义(χ2=0.3478, P＜0.50);耐药性突变主要发生在CD4+淋巴细胞＜200个/μl病人中. 结论用国产抗病毒药物治疗可取得较好的临床效果,服药依从性对治疗效果有重要影响,治疗后耐药性突变发生率显著升高,因此提高服药的依从性、减少耐药性病毒的产生和传播十分重要.
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HIV-1感染者CD4+T细胞受体基因多样性特点及其与病毒载量的相关性
目的 分析HIV-1感染者CD4+T细胞受体(TCR)基因的多样性特征及其与病毒载量的相关性.方法 应用抗CD4单克隆抗体从25份HIV-1感染者和10份HIV-1阴性对照样本外周血单个核细胞(PBMC)中分离CD4+T细胞,提取细胞总RNA,然后通过逆转录及巢式多聚酶链反应(nestedPCR)对TCR 22个Vβ基因家族的互补决定区3(CDR3)进行扩增,利用ABI3700测序仪对扩增的PCR产物进行扫描,定分析HIV-1感染者TCRCDR3区多样性变化特征及其与病毒载量的相关性.结果 HIV-1感染者CD4+T细胞TCR CDR3区平均D(distance)值显著高于正常对照组(P＜0 05),TCR Vβ基因各家族CDR3长度谱型成寡克隆分布,TCR CDR3区的紊乱与病毒载量呈正相关(r=0 494,P＜0 05);HIV-1感染引起TCR多样性的改变不仅表现在不同Vβ基因家族上,而且也表现在CDR3长度上,其中感染者Vβ8、Vβ22、Vβ23基因家族的变化与正常人差异有统计学意义.结论 HIV-1感染能引起CD4+T细胞TCR基因多样性的减少及高斯(Gaussian)分布的破坏,TCR CDR3区的紊乱与病毒载量呈正相关.
