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性病艾滋病感染者HIV-1相关基因多态性分析及其意义
目的研究HIV-1相关等位基因CCR5、CCR2b和SDF1在性病、艾滋病感染人群中的分布,为分析这些宿主遗传因素在HIV-1感染、艾滋病发病进程中的作用提供理论依据.方法收集性病、艾滋病感染者的血液标本,提取基因组DNA,经PCR或PCR-RFLP分析,计算突变基因频率.结果 CCR2b-64I和SDF1-3＇A的突变频率较高.215例性病患者和75例艾滋病感染者CCR2b-64I的突变频率分别为18.60%和15.33%,SDF1-3＇A的突变频率分别为24.42%和23.33%.但CCR5△32的突变频率较低(0.23%),而CCR5m303等位基因突变率为0,这与中国普通汉族人和该地区普通汉族人的结果一致.结论提示在遗传机制上艾滋病对中国人构成的威胁比西方人更大.
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陕西省HIV-1分子流行病学研究
目的研究陕西HIV-1流行亚型及相互关系,分析流行时间及传播途径,为陕西省HIV的预防、控制及感染者治疗提供有力的依据.方法用PCR对15份陕西HIV-1感染者外周血单核细胞(PBMCs)样本进行扩增,获得HIV-1 env基因的核酸片段,对其C2-V3及邻区350-450个核苷酸序列进行分析,所得结果与HIV国际标准株及周边省份流行株进行比较,分析共享序列及突变序列,制作系统树,计算离散率.结果陕西流行的B、E、C亚型内基因离散率分别为3.0%,1.7%和2.3%.10个B亚型毒株与泰国、我国云南、新疆、河南和四川流行的B亚型代表株基因序列接近;2个C亚型毒株我国新疆流行的C亚型代表株接近;3个E亚型毒株与河南流行的E亚型代表株接近.结论陕西HIV-1流行株主要为B、E、C亚型,三亚型毒株在陕西的流行时间分别在2.5～3年、2～2.5和1.5～2年之间,传播来源可能为国外或周边省份传入.
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牙龈卟啉单胞菌对人类免疫缺陷病毒-1致病性的影响
人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)是以CD4+细胞缺损和功能障碍为主要表现的获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的主要病原.AIDS与牙周病有密切的关系,HIV-1的感染被广泛认为是重型牙周病的危险因素,而近来研究发现牙周病可能是HIV-1感染宿主细胞、诱导潜伏的HIV-1复制的促进因素.牙龈卟啉单胞菌(Pg)是慢性牙周炎的主要致病菌之一,该文综述Pg对HIV-1致病性的影响.
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RANTES-K慢病毒载体的构建及其慢病毒的产生和鉴定
目的:构建含cc细胞内趋化因子(CC-intrakine,KANTES-K)基因的慢病毒载体,为研究I型人免疫缺陷病毒(HIV-1)感染的基因治疗奠定基础.方法:应用PCR技术,扩增目的基因片段RANTES-K,纯化后的PCR产物定向连接入pLenti6/V5-D-TOPO(R)载体,构建慢病毒载体pLenti6/V5-R-K,并在293FT细胞中建立慢病毒株,后转染HeLa细胞观察RANTES蛋白的表达.结果:成功构建了慢病毒载体plenti6/V5-R-K,并证实RANTES蛋白可在人宫颈癌HeLa细胞系内表达.结论:慢病毒载体可介导CC-intrakine(RANTES-K)基因高效稳定转染HeLa细胞,可用于抗HIV-1感染的基因治疗.
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HIV-1辅受体配体的逆转录病毒载体的构建和表达
目的: 构建HIV-1辅受体的配体-趋化因子RANTES和SDF-1的逆转录病毒载体,并观察在NIH3T3细胞的表达.方法: 从重组质粒pCMV-R-K-S-K中获取RANTES-KDEL-SDF-KDEL基因片段,构建RANTES和SDF-1的逆转录病毒载体pLNCX-R-K-S-K,酶切鉴定并测序.采用标准的磷酸钙共沉淀法转染包装细胞Bing, G418筛选克隆细胞,制备重组病毒液,继之感染NIH3T3细胞,计算病毒滴度.间接免疫荧光检测NIH3T3细胞中RANTES、SDF-1的表达.结果: pLNCX-R-K-S-K逆转录病毒载体酶切和测序结果与预期一致,筛选出抗性克隆,制备了高滴度的重组病毒液,间接免疫荧光证实RANTES和SDF-1可表达于转染细胞.结论: HIV-1辅受体的配体、趋化因子RANTES和SDF-1的逆转录病毒载体构建成功,重组病毒可以感染NIH3T3细胞,为下一步HIV-1感染实验打下了基础.
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趋化因子受体阻断剂与艾滋病防治
化学趋化因子受体作为协同受体,主要包括CCR5与CXCR4,为人免疫缺陷病毒(HIV-1)进入细胞所必需. HIV协同受体的发现为治疗艾滋病开辟了新的途径. 利用趋化因子拮抗剂与天然配体封闭趋化因子受体可阻止HIV的感染;以靶细胞表面的趋化因子受体为靶点治疗HIV感染的新方法已成为国内外研究的热点,现对这一方面研究进展作一综述.
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双内标PCR-ELISA定量检测技术的建立
目的:建立双内标PCR-ELISA定量检测方法,并进行标定评价.方法:制备了两种与HIV-1野生扩增片段等长的PCR 内参照HS和LS,设计了一对HIV-1 基因组gag区基因扩增引物,下游引物的5′端用地高辛修饰,可同时扩增115 bp左右的野生型和两种内参照片段.设计三套捕获探针,其5′端用生物素(Biotin)修饰,可分别与竞争PCR 产物中的野生片段和两种突变型片段杂交.同一反应管内,加入已知量但不同浓度的两种内参照及待测HIV-1 DNA标准品,它们将以相同的效率在同一个PCR管内被同时扩增并标记,酶联杂交法进行产物分析,结果用公式计算得出每单位体积待测标本中HIV-1的DNA含量.结果:公式计算出的HIV-1拷贝数与实验加入的HIV-1拷贝数这两组变量具有良好的线性关系,相关系数0.9998,批内变异系数9.48%,结果误差平均在12.58%,无非特异性扩增.结论:建立了双内标PCR-ELISA定量检测方法,该方法具有特异、灵敏、成本低等特点,利于在临床实验上推广.
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DC-SIGN受体及其信号通路在病原体感染中的作用
树突细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素分子(DC - SIGN)首先是在DC表面发现的Ⅱ型跨膜凝集素受体,能够与细胞间黏附因子2(ICAM-2)和ICAM -3结合,并能识别结合富含甘露糖的碳水化合物和含岩藻糖的多糖结构(如Lex,Ley,Lea及Leb)等病原相关分子模式,一方面可以通过受体介导的内吞、摄取、处理、提呈可溶性抗原,诱发机体对病原体的免疫应答；另一方面DC - SIGN诱发的信号通路能下调宿主免疫应答,导致病原体扩散、传播、免疫抑制和持续性感染.近年来,人们通过对许多病原体的免疫逃逸现象进行的大量研究工作,发现DC - SIGN与病毒的糖蛋白、细菌和真菌的荚膜多糖(CPS)等结合,使病原体藏匿于DC细胞而逃避溶酶体的降解,促进病原体传播实现免疫逃逸.
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重组HIV-1抗原的应用及评价
将纯化的基因重组HIV-1 P24和融合蛋白P24-gp41包被微孔板,用ELISA分别检测正常人血清和HIV-Ab国家参比品(Panel).rP24对20份HIV-Ab阳性Panel的检出率为95%(19/20),对20份HIV-Ab阳性Panel通过率为90%(18/20),P24-gp41对20份HIV-Ab阳性Panel检出率为90%(18/20),对20份HIV-Ab阴性Panel的通过率为60%(12/20);rP24和P24-gP41对正常人血清的检测结果均为阴性.结果表明研制的P24具有较高的敏感性和特异性,可作为组份抗原用于HIV抗体诊断试剂盒的生产.
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HIV-1 P24截短体与gp41截短体的融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化和鉴定
用基因重组技术将截短的HIV-1 p24基因和gp41基因连接成嵌合基因,插入质粒pGEX-4T3,构建成重组表达质粒pGEX-F.将pGEX-F转化大肠杆菌BL21.经IPTG诱导表达,pGEX-F在大肠杆菌BL21中获得了高效表达.融合蛋白P24-gp41经Glutathion-Sepharose4B亲和层析纯化后,用间接ELISA和免疫印迹检测HⅣ抗体阳性血清和正常人血清,P24-gp41只与HIV抗体阳性血清反应,证明获得的融合蛋白P24-gp41有很强的抗原特异性和免疫反应性,具有较高的应用价值.
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新疆乌鲁木齐市男性同性恋人群检测结果分析
目的 了解乌鲁木齐市男性同性恋人群(MSM)中HIV、HCV、梅毒感染情况,并应用HIV-1 BED-CEIA新近感染检测方法估计乌鲁木齐市男性同性恋人群的发病率.方法 利用网络招募方式获得求询者145名,采集血清样品143份进行HIV,HCV的ELISA初筛,对HIV阳性反应标本进行WB确证及HIV-1 BED-CEIA新近感染检测;143名求询者的样品进行梅毒RPR初筛和梅毒TPPA确认.结果 网络招募男性同性恋人群(MSM)中HIV阳性8名,检出率5.6%(8/143);HIV-1 BED-CEIA方法检出4名新近感染估计发病率6.74% (CI 0.13%～13.35%);梅毒阳性14名检出率9.8%;HCV均为阴性.结论 (1)男性同性恋人群(MSM)HIV感染率与HIV-1 BED-CEIA估计发病率较接近;(2)网络招募男性同性恋人群(MSM)梅毒的检出率比较高,其中有2名招募者HIV与梅毒合并感染;性病是HIV和HCV传播的协同因素,相对危险度均大于1(RR＞1).
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新疆乌鲁木齐市男性同性恋人群检测结果分析
目的 了解乌鲁木齐市男性同性恋人群(MSM)中HIV、HCV、梅毒感染情况,并应用HIV-1 BED-CEIA新近感染检测方法估计乌鲁木齐市男性同性恋人群的发病率.方法 利用网络招募方式获得求询者145名,采集血清样品143份进行HIV,HCV的ELISA初筛,对HIV阳性反应标本进行WB确证及HIV-1 BED-CEIA新近感染检测;143名求询者的样品进行梅毒RPR初筛和梅毒TPPA确认.结果 网络招募男性同性恋人群(MSM)中HIV阳性8名,检出率5.6%(8/143);HIV-1 BED-CEIA方法检出4名新近感染估计发病率6.74% (CI 0.13%～13.35%);梅毒阳性14名检出率9.8%;HCV均为阴性.结论 (1)男性同性恋人群(MSM)HIV感染率与HIV-1 BED-CEIA估计发病率较接近;(2)网络招募男性同性恋人群(MSM)梅毒的检出率比较高,其中有2名招募者HIV与梅毒合并感染;性病是HIV和HCV传播的协同因素,相对危险度均大于1(RR＞1).
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库车县维吾尔族人群HIV感染者中HCV合并感染及其基因亚型判定
目的 了解新疆库车县维吾尔族人群HIV-1和HCV流行株的亚型分布情况. 方法 检测库车县70份HIV-1抗体阳性的血浆标本的HCV抗体,并抽提血浆病毒RNA,反转录后扩增HIV-1 gag基因和构建进化树并分别与HIV-1和HCV国际标准株比较,确定被检标本的基因分型. 结果 70例HIV-1感染者中,检出HCV抗体阳性67例、占95.7％;从异性性接触者中检出HCV抗体阳性15例、占21.4％,从静脉注射吸毒者中检出HCV抗体阳性55例、占78.6％;67例成功扩增HIV-1 gag基因序列,均为CRF 07_BC亚型;67例成功扩增HCV5' UTR基因片段,分为4个亚型,以1b型为主占36.8％. 结论 新疆库车县HIV-1感染者特别是静脉注射吸毒者中HCV合并感染率较高,HIV-1以CRF 07_BC亚型为主要流行毒株,HCV则以1b和3a亚型为主要流行毒株.
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HCV和HIV-1混合感染的流行及传播途径
尽管丙型肝炎病毒(HCV)在世界人口中的感染率约3%左右(WHO,1997),这些感染者中约80%患有难于治疗的病毒血症[1],但HCV导致的死亡与过去的20年相比翻了3番,超过了获得性人类免疫缺陷病毒(HIV-1)所导致的死亡(Hepatology,1997);它是在慢性肝病患者中较严重的、以输血传播为主的病毒性肝炎.据国外报道,HCV及HIV-1混合感染率有上升趋势.在美国已有240 000人同时感染HCV及HIV-1[2];由HCV所导致混合感染的死亡率和肝细胞的癌变率在逐渐上升.许多研究表明,HCV在促使AIDS的病程发展中起重要作用.在肝病晚期,HCV导致的死亡占肝病死亡的50%[3].
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评价HIV-1抗病毒药物的重组假病毒法的建立及其初步应用
目的:探讨重组假病毒方法应用于评价抗病毒药物的可行性.方法:采用pSG3△env/TZM-b1系统,制备假病毒毒种,在不同细胞、不同重组假病毒接种量的条件下,应用重组假病毒法测定AZT的抗病毒效果.以此选择适的细胞接种量、病毒接种量,评价检测方法的重复性,用建立的假病毒检测法测定AZT、3TC、d4T、ddI的抗病毒效果.结果:细胞接种量对检测结果有一定的影响,适细胞接种量为每孔104个细胞;重组假病毒接种量对检测结果没有明显的差异;重复性检测结果显示,该方法的RSD为11.52%;用该法检测AZT、3TC、d4T、ddI的50%抑制浓度(IC50值)分别为0.0074μmol·L-1、0.5312μmol·L-1、0.0868μmol·L-1、3.4364μmol·L-1.结论:重组假病毒法可用于评价抗HIV-1药物,具有快速、简便的优点.
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顶体反应抑制剂4'-乙酰胺苯基4-胍基苯甲酸酯(AGB)具有阻断HIV-1进入细胞的作用
目的:研究4'-乙酰胺苯基4-胍基苯甲酸酯(AGB)抗HIV-1活性及作用靶点.方法:通过AGB对宿主细胞的毒性实验、合胞体抑制实验、融合阻断实验、对HIV-1感染细胞的保护作用实验和对HIV-1急性感染细胞p24抗原产生的抑制作用等试验,观察AGB对HIV-1复制的影响和作用机制.结果:AGB抑制HIV-1ⅢB诱导C8166细胞形成合胞体,EC50为39.5μg/ml;抑制HIV-1感染细胞上清中HIV-1 p24抗原的表达,EC50为33.36μg/ml;阻断HIV-1慢性感染H9细胞与正常C8166细胞间融合的作用.结论:AGB具有阻断HIV-1进入宿主细胞的作用,是一种有前景的具杀精子作用的杀微生物剂.
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HIV-共受体CCR5的三维结构及与其拮抗剂TAK 779相互作用的比较分子模拟
目的：研究HⅣ-1的共受体CCR5与其拮抗剂TAK779的相互作用机制。方法：用比较分子模拟方法建立CCR5受体的三维结构模型；通过量子化学计算得到TAK779分子的结构参数和优几何构型；用DOCK4.0程序将TAK779分子对接到CCR5受体的结合位点上。结果：通过分子力学优化得到了CCR5受体的三维结构模型，配体的结合口袋位于第三、五、六、七跨膜区，组成结合口袋的氨基酸残基主要为 Thr105、Leu107、Tyr108、Gly111、Phe112、Ser114、Cly115、Lys197、Glu283、Gly286、Met287、Cys290；TAK779与CCR5受体的相互作用方式为氢键、静电和疏水作用；配体与受体的结合能为-51.606 kcal/mol.结论：上述模型有助于进一步理解膜受体识别HIV-1病毒的分子机制并设计新的HTV-1抑制剂。
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HIV-1 SF2株env基因C1与C3区的嵌合表达
①目的构建HIV-1 SF2株env基因C1与C3区嵌合片段的克隆并在大肠杆菌中表达.②方法用DNAstar软件辅助设计引物,以含有HIV-1 SF2株前病毒基因组的9B1R6质粒为模板,PCR法分别扩增出env基因C1和C3段;两个片段经KpnⅠ酶切、T4连接酶连接和扩增后,再将经EcoRⅠ、SalⅠ双酶切的嵌合片段插入表达载体pGEX-4T-2中,构建重组表达质粒pGEX-4T-2/C1C3;重组质粒经酶切、测序鉴定后,以TSS法转入大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达融合蛋白和SDS-PAGE电泳分析表达蛋白图谱.③结果经酶切和测序分析,插入片段大小、方向和读码框架正确,无碱基错配,表明成功构建pGEX-4T-2/C1C3克隆;重组克隆在大肠杆菌DH5α中经IPTG诱导,高效表达出相对分子质量为4.3万的融合蛋白.④结论重组质粒pGEX-4T-2/C1C3的构建和表达成功,为进一步研究该表达蛋白的活性和HIV疫苗的研制奠定了基础.
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山东省HIV-1分离株env基因C2-V3区序列测定
①目的了解山东省l型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)的分子流行病学特征.②方法应用套式聚合酶链反应扩增8例HIV-l前病毒基因组的env基因C2-V3区,扩增产物纯化后与pGEM-T载体连接,克隆于大肠杆菌中,提取阳性克隆的重组质粒进行测序,用PHYLIP软件分析核苷酸及氨基酸序列.③结果8株HIV-1毒株V3环顶端的四肽基序均为GPGR,氨基酸变异不显著,各株间基因离散率为1.0%～5.29%,侧翼区碱基的变异频率明显高于V3区,并发现1例毒株出现双V3环现象.④结论山东省的HIV-1分离株以B亚型HIV-1毒株为主,同时发现的双V3环变异现象,可能是HIV-1毒株逃避宿主免疫系统攻击的一种新模式.
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云南瑞丽县IDUs人群HIV-1感染者毒株env基因C2-V3区序列的测定
①目的了解云南瑞丽县1994年以后静脉药瘾(IDUs)人群HIV-1感染者分离株的分子流行病学特征.②方法运用套式聚合酶链反应扩增HIV-1 env基因C2-V3区,将扩增片段纯化后与pEGM5zf(+)载体连接,再克隆入大肠杆菌,提取重组质粒,使用DNA自动测序仪进行序列测定.③结果与此地区1989年分子流行病学资料比较,V3区变异不显著,未发现新的亚型与毒株.④结论 5株HIV-1毒株进化关系非常密切,这一地区IDUs人群中HIV-1的流行毒株仍以美欧HIV-1 SF2株为主.
