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不明原因的颅内感染与博尔纳病病毒感染的研究
目的 分别检测不明原因的颅内感染患者外周血单个核细胞(PBMCs)和脑脊液有核细胞(CSFMCs)中博尔纳病病毒(BDV)p24基因,探讨不明原因颅内感染患者与BDV感染的关系及阳性患者的临床特征.方法 用荧光定量巢式逆转录聚合酶链反应(FQ-nRT-PCR)方法检测不明原因颅内感染患者及对照者PBMCs或CSFMCs中BDV p24基因片段,同时用β-肌动蛋白(β-actin)作为内参照,并总结阳性患者的临床特征.结果 PBMCs中BDV p24基因片段检测结果显示,实验组7例阳性,对照组均为阴性,差异有统计学意义(P＜0.05).实验组进行CSF检查的32例颅内感染患者中4例外周血和CSF标本BDV p24基因片段检测均为阳性,阳性基因片段产物测序后与BDV标准病毒株V和马源的BDV病毒株H1766序列比较,结果同源性分别为95.35%和98.84%,在4个位点出现基因突变(nt1649 T→C,nt1656 G→A,nt1670 C→T,nt1676 C→T);7例BDV p24基因片段阳性患者主要以精神行为异常为起病方式,患者与动物关系密切,其他临床特征无特殊.结论 贵州省遵义市部分不明原因颅内感染的发生与BDV感染有关,主要以精神行为异常为临床特征.
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ELISA检测p24抗原用于诊断HIV感染的研究现状
1 HIV感染实验诊断的研究概况HIV主要通过性接触、血液和母婴传播.近年来,欠发达国家的感染人数超过发达国家.预计到2010年我国感染HIV的人数将超过1 000万.目前测定血清HIV抗体是诊断HIV感染的常规实验方法,但是测定HIV抗体有局限性:有超过70%的HIV感染者在感染6个月后才能检测出抗体,在同性恋群体,这个数字超过80%,检测技术增加了HIV"窗口期"传播的危险[1];新生儿产生抗体需要出生1年后,来自母亲的HIV抗体会致使假阳性产生;HIV抗体持续存在,艾滋病晚期时消失,无法作为治疗监测的稳定指标.
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HIV-1 p24抗原检测的应用研究
目的:用抗HIV-1 p24单克隆抗体和多克隆抗体构建的间接ELISA试剂,检测HIV-1抗体阳性及其它样品,探讨应用的可行性.方法:采用单克隆抗体固相、兔抗HIV-1 p24抗体夹心,羊抗兔HRP结合物的间接ELISA法.结果:显示试剂盒HIV-1 p24抗原检出灵敏度为50 pg/ml(基因工程抗原);特异性99.46%;HIV抗体阳性血样阳性率3.2%;抗体阴性的特殊人群血样阳性率3.9%;抗体不确定血样阳性率为15.4%,明显高于抗体阳性和阴性组血样.病毒培养1 d,抗原效价1∶80,第3天可达1∶5 120.结论:该间接夹心HIV-1 p24抗原检测试剂灵敏度高、特异性好,可应用于HIV感染的辅助检测及病毒的基础研究.
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HIV-1 p24单链抗体的构建及其噬菌体文库筛选
目的通过噬菌体展示技术构建HIV-1 p24单链抗体库,从中筛选出高亲和力的抗体基因,为进一步单链抗体表达打下基础.方法从HIV患者的血清中提取mRNA,RTP-CR扩增出HIV-1 p24基因,扩增的产物用ClaⅠ和BstxⅠ双酶切消化后,连接到同样双酶切的pIRES1表达质粒,把构建的重组pIRES1-p24质粒免疫Balb/c小鼠.1个月后,取鼠脾细胞mRNA构建出单链抗体(ScFv)cDNA文库.该文库以噬菌粒pCANTAB5E cDNA为载体,转化大肠杆菌TG1,后用p24蛋白对表达的重组噬菌体单链抗体文库进行筛选.结果经过4轮吸附-洗脱-富集筛选,洗脱噬菌体滴度大于1010pfu/ml,ELISA及其测序表明获取了表达抗HIV1p24单链抗体的基因.结论单链抗体和噬菌体展示技术成功的应用简化了获取特异性的单链抗体基因程序.
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弓形虫P24基因编码蛋白的分子生物学研究进展
弓形虫P24基因编码的致密颗粒蛋白(GRA1)是弓形虫速殖子分泌排泄的抗原之一,存在于速殖子与缓殖子的致密颗粒中,是弓形虫诊断及制备疫苗的重要分子,在人体和动物实验感染中具有较强的免疫原性.本文综述了近年来P24,即GRA1的分子生物学研究进展及其作为钙离子缓冲剂的功能研究.
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贵州遵义地区蝙蝠脑组织BDV-P24基因片段的检测
目的 了解贵州遵义地区蝙蝠博尔纳病病毒(BDV)感染情况.方法 采用巢式逆转录聚合酶链反应(nRT-PCR)检测82例蝙蝠脑组织BDV-P24基因片段,阳性产物进行基因序列测定、同源性及分子系统树分析.结果 在82例蝙蝠脑组织中检测出7例BDV-RNA P24基因片段阳性,只有5例成功测出BDV-P24基因片段,与标准株马源Strain V相比较同源性高达99％,出现2个位点的一致性沉寂突变(nt1650T～C,nt1740G-T,突变率为0.9％),与H1766比较其同源性达97％,出现5个位点的一致性沉寂改变(nt1599A～G,nt1671T～C,nt1677T～C,nt1695G～A,nt1740G～T,突变率为2.2％),与He/80比较起同源性为96％,出现7个位点的一致性沉寂改变(nt1566 G～A,nt1581C～T,nt1659 T～C,nt1668 A～G,nt1674 T～C,nt1695 G～A,nt1740 G～A,突变率为3.1％).结论 贵州遵义绥阳地区蝙蝠存在BDV感染,与马源Strain V存在高度同源性,人感染BDV可能存在潜在的动物源性.
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弓形虫P24基因敲除转染质粒pGB/P5-P3的构建
目的构建弓形虫P24(TgP24)基因敲除转染质粒pGB/P5-P3(GRA2/ Ble-P24 5'UTR-P24 3,UTR),为TgP24基因敲除奠定基础.方法根据TgP24基因序列,设计并合成两对特异引物 (P1 to P4),采用PCR技术特异扩增TgP24基因的5,端非翻译区2.5 kb片段(P24 5'UTR)和3'端非翻译区2.89 kb片段(P24 3'UTR),将其分别亚克隆入pCR2.1-TOPO TA载体,构建质粒P24 5'UTR/TA和P24 3'UTR/TA;重组质粒P24 5'UTR/TA经KpnⅠ和BglⅡ双酶切后,再将纯化的P24 5'UTR片段亚克隆入转染质粒GRA2/Ble的KpnⅠ和BglⅡ位点,构建重组质粒pGB-P5(GRA2/Ble-P24 5'UTR);重组质粒P24 3'UTR/TA经BamHⅠ和NotⅠ双酶切后,纯化P24 3'UTR片段,再将其定向克隆到重组质粒pGB-P5的BamHⅠ和NotⅠ位点,从而构建弓形虫TgP24基因敲除转染质粒pGB/P5-P3.重组质粒经DNA序列测定证实目的片段插入正确.结果经过PCR筛选、限制性酶切及DNA测序鉴定,证实P24 5'UTR和P24 3'UTR两片段正确插入质粒GRA2/Ble的KpnⅠ和BglⅡ及BamHⅠ和NotⅠ位点, 位于药物选择ble基因的上,下游. 结论成功构建弓形虫P24基因敲除转染质粒pGB/P5-P3.
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45例HIV抗体不确定结果的人群跟踪观察和分析
目的 探讨用WB检测HIV抗体产生不确定结果的特点,WB确认实验存在的问题及可能的改善措施.方法 分析实验室2004～2008年检测的标本中WB检测结果为"HIV抗体不确定"者的人群分布特点、产生条带特点、受检者随访复检及抗体转归情况.结果 "HIV抗体不确定"者人员构成中一般人群居多,"HIV抗体不确定"者随访困难,复检率较低;WB实验存在假阳性,其中P24带占绝大多数,出现机率大.结论 "HIV抗体不确定"结果与WB实验的假阳性有关,实验室应采取应对措施尽可能减少"HIV抗体不确定",并对结果进行准确解释.
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应用斑点金免疫渗滤试验快速同步检测抗HIV-1,HIV-2 IgG抗体
应用斑点金免疫渗滤试验(dotimmunogoldfiltration assay,DIGFA)建立了一种同步快速检测四种抗HIV-1/2IgG抗体的HIV诊断试纸.通过基因工程技术在大肠杆菌中表达了5种HIV抗原蛋白片段(P24,GP41,GP36,GP120V3,GP120C).这5种抗原蛋白首先被固定在硝酸纤维素膜上,然后滴加待测血清,其中的病毒抗体通过免疫反应与抗原结合,再加胶体金标记的葡萄球菌蛋白A(SPA),待其渗过膜片后,洗涤,即可形成肉眼可见的红色斑点.用已确证的21份HIV阳性血清(其中包括1份HIV-1标准阳性血清和1份HIV-2标准阳性血清)和30份阴性血清进行了试验,结果表明该快速检测方法与ELISA方法无显著差异.该检测方法不需任何仪器,仅凭肉眼即可判定结果,整个检测过程不超过5分钟.与传统的的ELISA法相比,具有方便快速,成本低廉,应用范围广等优点.同时,此HIV快速诊断试纸可以同步检测并区分针对HIV-1和HIV-2感染的不同检测标志物(抗P24、GP41、GP120和GP36抗体),这对提高快速检测的灵敏度和准确性,以及对判断HIV感染者是否临近或已进入AIDS期有着较高的应用价值.
关键词： HIV-1/2 斑点金免疫渗滤试验(DIGFA) 融合蛋白 p24 gp41 -
博尔纳病病毒通过磷蛋白调节miR-134影响人少突胶质瘤细胞的增殖研究
目的:探讨博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)在感染宿主细胞中,miR-134对人少突胶质瘤细胞(oligodendrocyte,OL)增殖水平的影响.方法:应用real-time PCR方法检测正常的OL细胞和BDV感染的OL细胞(OL/BDV)中的miR-134表达水平,同时分别将BDV phosphoprotein (P24),nucleoprotein(P40)蛋白真核表达载体转染OL细胞,检测对miR-134的作用;通过miR-134过表达和BDV感染OL细胞,采用流式细胞仪检测miR-134和BDV对OL细胞增殖的影响.结果:real-time PCR表明miR-134在OL、OL/BDV细胞中的表达出现明显差异(P=0.000),并且BDV中的P24蛋白对miR-134有明显的上调作用(P=0.000),但P40对miR-134没有明显作用(P=0.139);流式细胞仪结果显示miR-134过表达(P=0.016)和BDV感染(P=0.001)均可以抑制OL细胞的增殖能力.结论:BDV感染可通过P24蛋白上调OL细胞中miR-134的表达,进而导致细胞增殖水平下降.
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重庆地区博尔纳病病毒种系发生分析
目的 了解重庆地区博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)基因特征及其种系发生.方法 采用荧光定量巢式实时逆转录聚合酶链反应(fluorescence quantitative nested RT-PCR,FQ-nRT-PCR)检测健康牛、山羊、猪各50例以及病毒性脑炎(viral encephalitis,VE)患者20例外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)BDV p24片段,检出阳性序列和前期检出的5例重庆地区山羊和神经精神患者阳性BDV p24基因序列,与GenBank中5个国家7个动物种属33例BDV p24基因序列进行比对,分析其核苷酸和氨基酸序列同源性,重建基因系统发生树.结果 10例BDV p24 核苷酸序列一部分(1例VE患者)形成重庆独立支系,另一部分(7例动物和2例VE患者)汇聚至德国-瑞士-奥地利-日本-重庆混合支系.与BDV标准病毒株Strain V、H1766及He/80比对,9例核苷酸和氨基酸序列同源相似性分别为94%～100%和82%～100%,1例为95%～98%和89%～93%.结论 重庆地区动物和人宿主可能存在地源性BDV独立株和源于外来疫病病原传入的流行株.
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HIV衣壳蛋白P24与TRIM22在HEK293T细胞中的表达及共定位
目的 观察人类免疫缺陷病毒(HⅣ)衣壳蛋白P24与三基序蛋白22(TRIM22)在HEK293T细胞中的共定位情况.方法 以慢病毒载体pLP1为模板,通过PCR法扩增p24编码序列,克隆至pDsRed-Monomer-N1真核表达载体.经菌落PCR、双酶切及DNA测序进行鉴定.将pDsRed-Monomer-N1-p24与pEGFP-N3-TRIM22载体共同转染HEK293T细胞,用荧光显微镜观察p24-DsRed-Monomer和TRIM22-EGFP的表达及共定位情况.结果 经菌落PCR、双酶切及测序鉴定,成功构建pDsRed-Monomer-N1-p24真核表达载体.通过荧光显微镜检测发现,p24-DsRed-Monomer和TRIM22-EGFP在HEK293T细胞中存在共定位关系.结论 HIV衣壳蛋白P24与TRIM22存在共定位.
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重组HIV-1抗原的应用及评价
将纯化的基因重组HIV-1 P24和融合蛋白P24-gp41包被微孔板,用ELISA分别检测正常人血清和HIV-Ab国家参比品(Panel).rP24对20份HIV-Ab阳性Panel的检出率为95%(19/20),对20份HIV-Ab阳性Panel通过率为90%(18/20),P24-gp41对20份HIV-Ab阳性Panel检出率为90%(18/20),对20份HIV-Ab阴性Panel的通过率为60%(12/20);rP24和P24-gP41对正常人血清的检测结果均为阴性.结果表明研制的P24具有较高的敏感性和特异性,可作为组份抗原用于HIV抗体诊断试剂盒的生产.
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HIV-1 P24截短体与gp41截短体的融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化和鉴定
用基因重组技术将截短的HIV-1 p24基因和gp41基因连接成嵌合基因,插入质粒pGEX-4T3,构建成重组表达质粒pGEX-F.将pGEX-F转化大肠杆菌BL21.经IPTG诱导表达,pGEX-F在大肠杆菌BL21中获得了高效表达.融合蛋白P24-gp41经Glutathion-Sepharose4B亲和层析纯化后,用间接ELISA和免疫印迹检测HⅣ抗体阳性血清和正常人血清,P24-gp41只与HIV抗体阳性血清反应,证明获得的融合蛋白P24-gp41有很强的抗原特异性和免疫反应性,具有较高的应用价值.
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27例HIV抗体检测不确定者结果特征及跟踪随访分析
目的 探讨“HIV抗体不确定”结果和跟踪随访的特点,揭示WB确证试验存在的问题,并提出改进措施.方法 回顾分析和评价抗体筛查、受检者随访复检及WB试验各种带型对判断HIV抗体不确定的效果.结果 27例HIV抗体不确定者的样本中,其人群分布既有一般人群,也有高危人群;S/CO值从低到高都有分布,其中S/CO值在0 ～2.9之间较多,占77.78％;另2例S/CO≥6样本WB结果为阴性,HIV初筛阳性S/CO值的高低不能做为确证阳性的判断依据;抗体不确定样本中WB带型以单一P24带型多,占59.3％,是WB试验的假阳性主要因素.结论 引起HIV抗体不确定结果的因素是多样的,除加强实验室质量控制和对不确定结果受检者的追踪随访外,必要时应结合其他检测技术及流行病学调查结果,从而作出准确诊断.
