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离体癫痫持续状态模型中抑制miR-134对树突棘的影响
目的 探讨抑制miR-134对原代培养神经元树突棘的影响.方法 ①构建大鼠miR-134抑制慢病毒载体并验证;②培养海马神经元,建立无镁离体癫痫持续状态SE模型,利用离子扫描显微镜研究miR-134抑制对癫痫持续状态SE模型中神经元树突棘密度的影响.结果 ①将一段362bp包含2个miR-134竞争结合位点的DNA片段经XhoI和EcoRI酶切后插入质粒pCDH-CMV-MCS-EG(R)FP-MCS中E(R)GFP序列的下游,该片段转录产物与miR-134互补形成稳定的复合物,从而阻止了miR-134对靶mRNA的降解或翻译抑制,得到大鼠miR-134抑制慢病毒载体;②同对照病毒组相比,miR-134抑制慢病毒预处理组经无镁细胞外液处理后(离体癫痫持续状态模型)神经元树突棘密度减少(P＜0.05).结论 MiR-134可能在树突棘重塑过程中扮演重要角色.
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miR-134miR-17～92基因簇与卵巢癌耐药的关系
目的 检测并验证miR-134及miR-17 ～92基因簇在紫杉醇耐药与敏感卵巢癌细胞中的差异表达并探讨两者参与卵巢癌耐药的可能机制.方法 2010年10月至2012年12月于中国医科大学附属盛京医院,用Affymetrix GeneChip(R)miRNA芯片对紫杉醇耐药与敏感卵巢癌细胞miRNA基因表达谱进行分析.选取差异表达明显的miR-134和miR-17 ～92基因簇,采用Real-time PCR方法进一步验证芯片结果.应用生物信息学分析软件预测miR-134和miR-17～92基因簇各自潜在的靶基因并通过Western Blot对部分靶基因进行验证.结果 与敏感卵巢癌SKOV3细胞相比,耐药卵巢癌SKOV3-TR30细胞中miR-134低表达,miR-17～92基因簇高表达.软件预测得到miR-134基因簇潜在靶基因c-Myc,MRP1/ABCC1等共128个,软件预测得到miR-17 ～92基因簇潜在靶基因BIM,PTEN,ABCA1等共30个.与敏感卵巢癌SKOV3细胞相比,耐药卵巢癌SKOV3-TR30细胞中miR-134潜在靶基因c-Myc蛋白高表达；miR-17～92基因簇潜在靶基因BIM蛋白低表达(P均＜0.05),PTEN蛋白虽表达增高但差异无统计学意义.结论 MicroRNA表达谱基因芯片可筛查出紫杉醇耐药与敏感卵巢癌细胞的差异表达基因.低表达miR-134和高表达的miR-17 ～92基因簇可能分别通过调节其潜在靶基因c-Myc及BIM蛋白表达参与卵巢癌化疗耐药.
关键词： miRNA表达谱基因芯片 卵巢癌 耐药 miR-17～92 miR-134 -
miR-134靶基因筛选与鉴定在卵巢癌耐药中的应用研究
目的 应用Hybrid-PCR技术,筛选miR-134在人卵巢癌紫杉醇耐药SKOV3-TR30细胞中潜在靶基因,为卵巢癌耐药的研究提供理论依据.方法 2011年9月至2013年9月在中国医科大学附属盛京医院通过RNA抽提,Hybrid-PCR引物设计,Hybrid-PCR及测序,BioEdit和DNAclub分析所有测序结果并运用BLAST分析确定候选靶mRNA的确切信息.后通过候选靶基因的3'UTR荧光素酶报告基因质粒及miRNA共转染HEK293细胞进行双荧光素酶报告基因检测.结果 Hybrid-PCR方法筛选出SKOV3-TR30中miR-134的潜在靶基因有:C16orf72、PNAS-105、spermidine synthase、VIM2、F-box protein 2、GAPDH、PRPF6和RPL41,成功构建以上8个靶基因3,-UTR荧光素酶报告基因质粒;通过荧光素酶报告基因检测显示miR-134对8个候选靶基因3'-UTR区均具有直接结合作用.结论 在SKOV3-TR30细胞中,运用Hybrid-PCR方法共筛选得到8个miR-134候选靶基因;miR-134可能通过调控这些靶基因在卵巢癌耐药形成中发挥作用.
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miR-134在人垂体腺瘤组织中的表达及其意义
目的:探讨垂体腺瘤患者miR-134的表达及意义,分析其表达水平与无功能垂体腺瘤(non-functioningpituitaryadenomas,NFPA)增殖侵袭能力的相关性.方法:选择2010年6月至2013年7月本院收集垂体腺瘤标本104例以及8例尸检正常腺垂体的临床资料.采用实时荧光定量PCR、免疫组织化学技术检测Ki-67、MEG3、miR-134等在NFPA组织中的表达水平,并分析数据.结果:miR-134在NFPA组织中表达水平显著低于正常腺垂体和其他类型垂体腺瘤(P＜0.01);miR-134的表达水平与NFPA患者肿瘤侵袭性、肿瘤细胞Ki-67阳性率及发病年龄呈负相关(P＜0.01).结论:miR-134表达下调可能是NFPA肿瘤发生及肿瘤呈侵袭样生长的重要因素,miR-134可作为诊断和评估NFPA预后的参考指标.
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miR-134在无功能垂体腺瘤中的表达及其与肿瘤增殖侵袭能力的关系
目的 检测miR-134在正常垂体组织和各垂体腺瘤亚型中的表达情况,分析其表达水平与无功能垂体腺瘤(NFPA)增殖侵袭能力的相关性.方法 收集垂体腺瘤标本52例(NFPA33例,PRL腺瘤5例,GH腺瘤9例,ACTH腺瘤5例)和尸检正常腺垂体4例及临床相关病例资料,利用免疫组织化学、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)等实验技术检测miR-134、MEG3和Ki-67等在各标本中的表达量,并结合病例资料分析数据.结果 miR-134在NFPA中表达水平明显低于其他类型垂体腺瘤和正常腺垂体(P＜0.01)；并且miR-134的表达水平与NFPA患者发病年龄、肿瘤细胞Ki-67阳性率及肿瘤侵袭性呈负相关(P＜0.01).结论 miR-134表达下调可能是NFPA肿瘤发生及肿瘤呈侵袭样生长的重要原因之一；miR-134有望成为用于NFPA诊疗的新靶点.
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miR-134在氧-糖缺失神经元损伤中的作用
目的 探讨miR-134在乳鼠脑皮层神经元氧-糖缺失(oxygen glucosedeprivation,OGD)致缺血损伤中的作用及其可能分子机制.方法 离体培养乳鼠脑皮层神经元10 d后,随机分为五组,正常组和OGD组,后者包括非转染组、miR对照组、miR-134抑制剂组、miR-134前体组.按照分组加入饲养液中感染24 h换液,72 h后对OGD组进行OGD处理.利用噻唑蓝(MTT)法检测神经元生存率,Western blotting检测热休克蛋白A12B(HSPA12B)表达水平,实时定量RT-PCR方法检测miR-134和HSPA12B mRNA表达水平以及通过双荧光素酶报告基因技术验证miR-134对HSPA12B mRNA 3'UTR的直接调控作用.结果 与非转染组比较,在OGD致神经元缺血损伤中miR-134前体组,miR-134的表达水平明显提高,细胞存活率明显降低,HSPA12B蛋白水平明显降低,荧光素酶活性也明显降低(P＜0.05);而miR-134抑制剂组miR-134的表达水平明显降低,细胞存活率显著提高,HSPA12B蛋白水平明显提高,荧光素酶活性也明显升高(P＜0.05);但各组之间HSPA12B mRNA水平差异无统计学意义.结论 miR-134通过负性调控HSPA12B蛋白表达水平,在CGD所致神经元缺血损伤中发挥重要作用,在mRNA水平上为治疗缺血性脑卒中提供了可能的分子靶标.
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乳腺癌中miR-134的表达及其与上皮-间质转化的关系
目的：探讨miR-134在乳腺癌中的表达及临床意义，分析其表达与上皮-间质转化（ epithe1ia1-mesenchyma1 transition， EMT）标志物的相关性。方法采用原位分子杂交法检测97例乳腺癌组织中miR-134的表达，同时应用免疫组化MaxVision两步法检测E-cadherin、N-cadherin、vimentin的表达，并分析三者表达与临床病理特征的关系。结果 miR-134在乳腺癌中的阳性率随组织学分级的升高而降低，其表达与HER-2表达呈负相关。miR-134的阳性率随E-cadherin表达下调及N-cadherin、vimentin表达上调而降低；E-cadherin在乳腺癌中表达下调以及N-cadherin、vimentin在乳腺癌中表达上调均与组织学分级升高、淋巴结转移和HER-2阳性以及ER、PR阴性有关。结论 miR-134在乳腺癌组织中的表达随肿瘤恶性程度的升高而下调，并与EMT关系密切，是乳腺癌的潜在生物学标志物。
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细胞游离miR-185、miR-134、miR-22和CEA组合谱对肺癌相关的恶性胸腔积液诊断价值研究
目的 研究循环细胞外miR-185、miR-134、miR-22对肺癌相关的恶性胸腔积液的诊断价值.方法 采用实时荧光定量PCR方法 (RT-q PCR) 检测58例肺癌恶性胸腔积液 (MPE) 和40例良性胸腔积液 (BPE) 中胸液3个游离miRNA的相对表达水平.曲线下面积 (AUC) 用来评估3个miRNAs和CEA的诊断价值.结果 肺癌恶性胸腔积液中miR-185、miR-134和miR-22的表达水平较BPE减少, 差异有统计学意义 (P＜0.01).miR-185、miR-134和miR-22的AUC分别为0.861 (95％CI:0.776～0.922) 、0.818 (95％CI:0.727～0.888) 和0.827 (95％CI:0.738～0.896).当3个miRNAs和CEA联合检测时, 敏感度增高到91.9％, 特异度为92.5％, AUC升高到0.942 (95％CI:0.864～0.982).结论 胸液游离miR-185、miR-134和miR-22可作为肺癌恶性胸腔积液诊断的分子标志物.
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氟西汀对CUMS模型组大鼠血浆miR-34a miR-134 miR-143表达的影响
目的 探讨血浆miR-34a、miR-134、miR-143成为抑郁行为严重程度和药物疗效的客观评估指标的可能性.方法 将40只雄性SD大鼠分为4组,干预组、模型组、模型+干预组、对照组各10只,采用慢性不可预见性应激的方法建立抑郁模型,采用旷场实验评价大鼠行为. 结果 应激前4组大鼠各项实验指标比较差异无统计学意义 (P>0.05);而应激后,模型组和模型+干预组大鼠24 h饮用1%糖水消耗量及体质量、水平运动格子数与垂直运动格子数较应激前显著减少,排便次数较应激前显著增多(P<0.05或0.01),对照组和干预组则无显著变化(P>0.05).本研究未检测到miR-143的表达水平.与对照组相比,模型组大鼠血浆miR-34a表达增强(P<0.05),miR-134表达下降(P<0.05);与模型组相比,模型+干预组、干预组大鼠血浆miR-34a表达下降(P<0.05),miR-134表达增强(P<0.05).结论 应激抑郁模型小鼠糖水代谢消耗下降,动力及探索活动减少,而氟西汀可增加糖水消耗动力及探索活动.miR-143在血浆中基本不表达,血浆miR-134与miR-34a有可能成为抑郁症的生物学标记物,值得进一步研究.
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miRNA-134的功能研究及展望
MicroRNAs(miRNAs)是在真核生物中发现的具有调控功能的内源性非编码单链RNA,可通过与靶基因mRNA的3'UTR完全或不完全配对形成双链体,引起靶基因mRNA降解或翻译后抑制.其具有广泛的基因调节功能,能够在发育时间、增殖分化、细胞凋亡、细胞应激等[1]细胞进程中进行调节.研究显示,miRNAs在调控神经系统的发育和成熟中亦发挥关键作用.
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MiR-134在MA诱导神经元损伤中的表达及其对神经诱发动作电位的影响
【目的】探讨微小非编码RNA分子miR-134在甲基苯丙胺（MA）诱导PC12神经细胞损伤中的表达变化及其对神经兴奋性的影响，为理解MA导致神经损伤的机制提供实验基础。【方法】将处于对数生长期的PC12细胞分为对照组和MA组。MA组应用800μmol/L MA处理，建立体外神经元损伤模型，观察培养神经细胞损伤及细胞凋亡情况；采用实时荧光定量PCR技术测定miR-134的表达水平变化；并构建miR-134干扰载体，抑制miR-134后分析神经诱发动作电位的变化。【结果】MA可明显诱导PC12细胞损伤，神经突起变短，细胞凋亡数目增多；荧光定量PCR结果显示miR-134表达升高；电生理学检测结果显示，干扰miR-134后诱发动作电位增多。【结论】高浓度MA诱导神经细胞损伤、诱发神经元凋亡并升高miR-134表达，沉默miR-134表达，可增加神经兴奋性。本实验为阐明MA的神经损伤机制，以及miR-134在神经元毒性损伤及神经兴奋性中的可能作用提供了实验依据。
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人miR-134真核表达载体的构建及其鉴定
目的:构建包含外源性miR-134前体的真核表达载体,并使其在人类少突胶质瘤(oligodendroglia,OL)细胞中表达,为进一步研究miR-134的功能及作用靶标提供技术支持.方法:从人类OL细胞基因组DNA扩增miR-134前体,将所得目的片段克隆到pEGFP-N1载体上,重组质粒经测序鉴定后将其转染至人类OL细胞中,荧光倒置显微镜观察增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的表达情况,并采用荧光定量PCR检测miR-134基因水平的表达.结果:pEGFP-miR-134重组质粒经酶切、PCR鉴定可见目的条带与预期结果一致,经测序可见插入序列正确.将重组质粒转染OL细胞后,荧光定量PCR结果示pEGFP-N1空质粒转染组与空白对照组的miR-134表达水平无统计学差异(P=0.882);pEGFP-miR-134质粒转染组miR-134表达水平是pEGFP-N1空质粒转染组的52倍,两者具有统计学差异(P=0.023).结论:通过构建真核细胞表达质粒可以高效表达外源性microRNA分子,为后续的研究奠定实验基础.
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博尔纳病病毒通过磷蛋白调节miR-134影响人少突胶质瘤细胞的增殖研究
目的:探讨博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)在感染宿主细胞中,miR-134对人少突胶质瘤细胞(oligodendrocyte,OL)增殖水平的影响.方法:应用real-time PCR方法检测正常的OL细胞和BDV感染的OL细胞(OL/BDV)中的miR-134表达水平,同时分别将BDV phosphoprotein (P24),nucleoprotein(P40)蛋白真核表达载体转染OL细胞,检测对miR-134的作用;通过miR-134过表达和BDV感染OL细胞,采用流式细胞仪检测miR-134和BDV对OL细胞增殖的影响.结果:real-time PCR表明miR-134在OL、OL/BDV细胞中的表达出现明显差异(P=0.000),并且BDV中的P24蛋白对miR-134有明显的上调作用(P=0.000),但P40对miR-134没有明显作用(P=0.139);流式细胞仪结果显示miR-134过表达(P=0.016)和BDV感染(P=0.001)均可以抑制OL细胞的增殖能力.结论:BDV感染可通过P24蛋白上调OL细胞中miR-134的表达,进而导致细胞增殖水平下降.
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MiR-134通过靶向调节KRAS抑制786-0肾透明细胞癌细胞上皮间质转化过程
目的 探索miR-134在肾癌组织中的表达并研究其对肾透明细胞癌细胞786-0上皮间质转化的影响.方法 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测miR 134在20对肾癌组织和786-0细胞中的表达情况;miR-134模拟物转染786-0后,划痕实验和Transwell实验分别检测肾癌细胞迁移和侵袭能力的改变情况,Western blot检测细胞中靶蛋白KRAS及其相关信号通路蛋白表达情况;双荧光素酶报告基因检测miR-134与KRAS 3'-UTR结合情况.结果 MiR-134在20对肾癌组织和786-0细胞中明显低表达(P＜0.01);miR-134模拟物转染后能够抑制肿瘤细胞侵袭(P＜0.01)和迁移的能力(P＜0.05),显著降低肿瘤细胞中KRAS蛋白的水平(P＜0.05)并抑制RAS/MAPK/ERK通路中关键蛋白p-ERK的表达(P＜0.05);双荧光素酶报告基因显示miR-134能与KRAS 3’-UTR结合,显著降低荧光值(P＜0.05).结论 MiR-134在肾透明细胞癌中显著低表达,能通过靶向抑制KRAS表达调控下游RAS/MAPK/ERK通路活性,阻滞786-0细胞上皮间质转化过程,抑制肿瘤细胞的侵袭和转移.
