1997～2000年我国华东地区HIV-1分离株抗原决定簇氨基酸及其编码核苷酸序列的变化

①目的对1997～2000年来自华东地区52例HIV-1分离株env基因C2～V3区序列及其V3环顶端主要中和抗原决定簇(PND)氨基酸序列的变化规律进行分析.②方法以来自同时期上述地区的HIV-1感染者PBMC基因组为模板,采用套式PCR扩增HIV-1 env基因C2～V3区片段,产物经克隆、测序.DNA测序结果经DNA Star软件分析HIV-1分离株的基因分型,比较HIV-1膜蛋白V3环顶端PND相关八肽氨基酸及其编码核苷酸序列的变化特征及出现频率并测其共享序列.③结果1997～2000年华东地区HIV-1分离株的基因分型有7个,分别属于HIV-1M亚群的A～G亚型.分离株间的基因离散率为1.2%～5.8%.同时发现了env基因双V3区变异的HIV-1自然突变株(Genbank AF220245).分析52株PND相关八肽基因序列,其中以第2、3、7位氨基酸及其编码核苷酸的变化为显著,分别为11.5%、9.6%、9.6%,且3组共享序列相关的八肽亲水性有明显差异.④结论1 997～2000年华东地区HIV-1流行呈现多个型别共同、混合流行的特征,膜蛋白PND的八肽基因序列呈现多样性变化,新的HIV-1膜蛋白双V3区变异株的发现可能与病毒重组、免疫逃避及致病机制有关.

RNA与前病毒DNA进化分析技术在判定HIV-1传播关系中的作用比较

目的 分别以HIV-1 RNA和前病毒DNA为模板进行扩增实验,比较不同实验方法对判断HIV-1阳转家庭基因关联性的效率.方法 对国家分析库中确认的阳转家庭,分别提取HIV-1 RNA和前病毒DNA,用巢式PCR扩增pol区基因,通过系统进化树和基因距离分析配对家庭基因关联性.结果 以RNA为模板扩增211份HIV-1阳性血浆,获得42份(42/211,19.91％)基因序列.其中共有12对配对家庭,确定有传播关系10对(10/12,83.33％),确定无传播关系1对(1/12,8.33％),不确定是否有传播关系1对(1/12,8.33％);以前病毒DNA为模板扩增270份HIV-1阳性全血,获得232份(232/270,85.93％)基因序列.其中共有97对配对家庭,确定有传播关系86对(86/97,88.66％),确定无传播关系7对(7/97,7.22％),不确定是否有传播关系4对(4/97,4.12％).以RNA和前病毒DNA为模板扩增的序列系统进化树Bootstrap值高度相关(r=0.86,P=0.001),基因距离差异无统计学意义(Z=-8.10,P=0.443).结论 以前病毒DNA为模板能显著提高扩增阳性率,特别是在抗病毒治疗家庭中.前病毒DNA在一定程度上可以代替RNA为模板进行扩增,判断家庭内传播的关系.

HIV-1基因型耐药检测能力验证考核品的制备和评估

目的 制备人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)基因型耐药检测能力验证考核品,并对其均匀性和稳定性进行评估.方法 选取前期检测出的5个HIV-1阳性血浆样本,其中4个具有不同耐药位点,1个对药物敏感,提取HIV-1病毒RNA,经逆转录PCR和巢式PCR获得3 100 bp的pol区基因;将目的基因与pMDTM 19-T载体连接后进行基因克隆,从阳性菌液中提取回收重组质粒并测序鉴定,后评估考核品的均匀性和稳定性.结果 5个目的基因扩增测序均成功,与载体连接后得到重组载体V1、V2、V3、V4、V5,梯度退火荧光PCR结果显示考核品退火温度为64.1℃;质粒稀释倍数≤10 000时,各个样本做荧光PCR的Ct值均小于30,因此,将每种质粒稀释10 000倍分装制成考核品;选择浓度不同的3个样本V1、V2和V3分别做均匀性检测,3组Ct值差异均无统计学意义(P＞0.05),该考核品均匀性良好;选择V1、V2、V3做稳定性检测,结果显示该考核品至少可以在室温和4℃稳定保存20 d,在-20℃和-80℃保存反复冻存5次后浓度均未发生明显变化,表明该考核品稳定性较好.结论 本研究中用克隆载体制备的HIV-1基因型耐药检测能力验证考核品均匀性稳定性良好,是一种经济便捷的HIV-1基因型耐药检测考核品制备方法.

急性期HIV病毒主要利用CXCR4辅助受体与疾病快速进展密切相关

目的 探讨急性HIV-1感染中病毒嗜性对疾病进展的影响以及在HIV感染初一年中病毒嗜性的变化.方法 12例急性HIV-1感染者来源于首都医科大学附属北京佑安医院男男性接触者(MSM)高危人群队列,其中7例病情进展较快(感染HIV 2年后CD4+T细胞计数＜200个/μl),5例病情进展较慢(感染HIV 2年后CD4+T细胞计数仍＞ 500个/μl).留取患者第一次HIV阳性随访点和48周随访点血浆标本,提取病毒基因组RNA,克隆HIV-1 env区的C2～V5区并测序.用Geno2pheno和PSSM软件预测共受体嗜性.结果 成功克隆和测序的病毒株中,7例快速进展患者HIV感染后第一次随访时X4嗜性病毒株比例为87.0％ (80/92),R5嗜性病毒株比例为13.0％ (12/92);感染HIV 1年时X4嗜性病毒株占91.2％ (93/102),R5嗜性病毒株占8.8％ (9/102).5例病情进展缓慢者,HIV感染后第一次随访时X4嗜性病毒株所占的比例为4.8％ (3/62),R5嗜性病毒株所占的比例为95.2％ (59/62)；HIV感染1年时X4嗜性病毒株占5.2％ (3/58),R5嗜性病毒株占94.8％ (55/58).结论 CXCR4嗜性毒株可能与HIV-1感染早期疾病进展有关,在感染第一年病毒嗜性无明显变化.

哈尔滨市39例HIV-1毒株原发耐药的变异研究

目的 分析哈尔滨市39例未经抗病毒治疗的HIV-1感染者原发耐药的情况,明确哈尔滨市HIV/AIDS患者原发耐药的耐药谱,为今后该市确定对于HIV/AIDS患者进行高效抗逆转录病毒治疗方案提供参考.方法 应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法对哈尔滨市39例未经抗病毒治疗的HIV-1感染者血浆HIV pol基因序列进行扩增,分析耐药突变位点以及对各类抗病毒药物的耐药程度.结果 39例扩增阳性的pol区基因中,系统进化树分析结果显示:B亚型共18例(46.15％),包括泰国B ' 7例(17.95％),欧美B11例(28.21％)；CRF01_AE亚型15例(38.46％); 07_BC亚型5例(12.82％)；1例出现CRF01_AE与A亚型的重组(2.56％).基因型耐药结果分析显示:针对蛋白酶抑制剂,未出现蛋白酶抑制剂(PI)主要耐药突变,9例出现次要耐药突变(L10I、A71T/V).针对核苷类逆转录酶抑制剂(NRTI)和非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTI),出现3例核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变(K219Q、T69N),导致对去羟肌苷(ddI)、齐多夫定(AZT)、司他夫定(d4T)的潜在低度耐药；出现10例非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变(V179D/E),导致对依非韦伦(EFV)、奈韦拉平(NVP)潜在低度耐药.结论 哈尔滨市未经治疗的HIV-1感染者中原发耐药的发生率出现上涨趋势,需引起足够的重视.

HIV-1中国流行株假病毒的建立及其初步应用

目的 构建中国境内携带荧光素酶报告基因的B、B'C及AE亚型的HIV-1假病毒,研究该假病毒在检测病毒嗜性及中和抗体试验中的初步应用,为HIV-1的研究搭建一个方便、快捷且安全的平台.方法 通过RT-PCR将3种亚型膜蛋白全长扩增,转化到表达质粒,构建膜蛋白质粒,与HIV骨架质粒共转染293T细胞,获得假病毒颗粒.假病毒感染GHOST细胞后,通过测定荧光值(RLU)来确定假病毒的感染效率、辅助受体使用情况及评价中和抗体作用.结果 携带荧光素酶报告基因的HIV-1假病毒感染CD4+CCR5+CXCR4+GHOST细胞后,经检测被感染细胞的荧光值显著大于阴性对照组,证明假病毒能够在体外有效地感染GHOST细胞；利用辅助受体抑制剂方法确定了假病毒毒株的嗜性；假病毒感染GHOST细胞可被同亚型血清中和作用所抑制,抑制率随血清稀释度增加而减小.结论 获得了携带荧光素酶报告基因的HIV-1假病毒,并初步证实了该假病毒可应用于病毒嗜性及中和抗体试验.

一组分离自男男性行为人群HIV-1毒株的近似全长序列分析

目的 对5名北京市男男性行为者体内人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)全基因组特征进行全面分析.方法 采用淋巴细胞共培养法分离出病毒,并采用RT-PCR法扩增出其近似全长基因组,测序后对其基因序列特征进行深入分析.结果 经系统进化和重组分析,分离出的5株病毒分属CRF07_BC、CRF01_AE和B亚型.病毒虽然分属不同亚型,但膜区糖基化位点的数目和分布位置都趋于保守,V3环顶端序列存在GPGR和GWGR两种形式,嗜性预测皆为M嗜性.结论 男男性行为人群中HIV-1流行毒株存在CRF01_AE、CRF07_BC和B亚型.本研究获得的全长序列将为研究HIV-1各亚型在男男性行为人群中的传播和进化提供理论依据.

1例因窗口期输血引起HIV-1感染的调查

目的 明确患者是否由窗口期输血感染HIV-1.方法 采集献血者存留样品及患者阳性样品,进行核酸提取、病毒载量检测、PCR及基因测序,对所得结果进行pol基因鉴定,同时用软件MEGA4.1进行系统发生分析.结果 2名献血者中,有1名献血者存留样病毒载量结果为37 000 IU/ml,与患者HIV-1毒株均为CRF07-BC重组亚型,其相似性为100%.结论 患者体内的HIV-1毒株为窗口期输血感染.在采供血机构推广核酸检测将更有利于临床输血的安全.

新一代抗HIV-1中和抗体的研究进展

固有免疫在急性HIV-1感染中的作用

HIV-1潜伏储存库及其控制策略

高效抗逆转录病毒治疗(HAART)是人类在治疗人类免疫缺陷病毒(HIV)感染/艾滋病(AIDS)方面取得的一个重要成就.HAART不仅可以有效控制HIV复制,将血浆病毒载量降至现有常规检测方法测不出的水平,而且能重建艾滋病患者的免疫功能[1],延长患者生命,降低死亡率.HAART体系建立时人们希望能够完全清除患者体内的HIV,达到治愈AIDS的目的,但之后发现由于病毒潜伏储存库的存在[2-3],HAART不能完全清除体内病毒,一旦停止抗病毒治疗,即发生病毒反弹.因此从初的以根除病毒为目的转变为控制病毒血症.如何彻底清除血浆中HIV,达到长期无药缓解,已成为抗病毒治疗的新课题.

HIV-1耐药性的研究进展

艾滋病是获得性免疫缺陷综合征(Acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)的简称,是由人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)引起的慢性传染病.HIV为单链RNA病毒,属反转录病毒科(Retroviridae),慢病毒属(Lentivirus)中的人类慢病毒组[1].根据HIV基因的差异,目前可将HIV分为HIV-1型和HIV-2型.HIV-2主要局限在西部非洲和西欧,北美也有少量报告,传染性和致病性均较低.包括我国在内,全球流行的主要毒株是HIV-1.HIV-1毒力较强,通过感染免疫细胞,破坏人体免疫系统,终使患者死于严重感染.自20世纪80年代后期第一种抗反转录病毒药物齐多夫定(zidovudine,AZT)问世以来[2],抗HIV药物的研发和应用得到了极大的发展.

出入境人群艾滋病病毒env基因部分序列特征和亚型研究

[目的] 对出入境人员中的HIV感染者进行病毒基因型测定,监测国内外流行的HIV毒株的状况及其变化.[方法] 用RT-PCR或直接巢式PCR方法扩增HIV env基因C2-V3区及其邻近的基因片段,然后直接进行核苷酸序列测定,与国际标准亚型序列比较确定基因型并进行系统进化分析.[结果] 2003年确认的19例HIV阳性样品中有15例扩增出目的基因片段并进行了序列测定, 确定为B亚型4例、B'亚型2例、D亚型2例、CRF01-AE重组亚型1例、CRF02-AG重组亚型6例.这些不同亚型的HIV-1感染者来自包括中国在内的6个国家.HIV-1基因型的分布与我国国内有很大不同.[结论] 出入境人群中HIV-1基因种类多且复杂,监测出入境人群HIV基因型及其变化对于发现和鉴定新型变异毒株十分重要.

四川彝族人群HIV-1辅助受体CX3CR1基因多态性分析

背景与目的: 了解四川省彝族人群中HIV-1辅助受体CX3CR1基因多态性在正常人和HIV-1感染者中的分布特点,探讨此辅助受体多态性对HIV感染的影响.材料与方法: 从202份外周血中提取基因组DNA(正常人115份,HIV-1感染者87份).用PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测V249I和T280M两种变体,检测结果用行列表χ2检验法进行统计学分析.结果: 在检测的115例正常人样品中,249I和280M等位基因频率分别为8.3%和5.7%;HIV感染者中,两种等位基因频率分别为7.5%和5.7%.249I和280M间存在明显的连锁关系.正常人和感染者的两种等位基因频率的差异无统计学意义(P＞0.05).结论: 所获得的四川彝族人群HIV-1辅助受体CX3CR1基因多态性资料有助于进一步分析四川彝族人群HIV感染和艾滋病病程的影响因素.

HIV-1耐药性基因型检测方法研究进展

为提高HIV感染患者的临床治疗效果,降低病死率,本文简述了HIV-1耐药性基因型检测方法,以供参考.

经垂直传播的HIV-1 env区突变准种改变HLA限制性CTL表位的初步研究

目的 探索经垂直传播HIV-1 env区突变准种改变HLA限制性CTL表位的方式机制.方法 从2对垂直传播的HIV-1感染者血清内提取HIV-1核酸,逆转录-套式PCR(RT-nested PCR)扩增,产物克隆后,挑选阳性克隆行CSGE分析,对优势/劣势准种克隆测序分析,对氨基酸序列中可能的CTL表位进行分析.结果 第一对母子:母亲YJ体内存在HIV-1准种env区CTL表位在其54d的女儿WYF体内都存在,而WYF体内存在一株突变准种,其CTL表位在YJ体内HIV-1准种中不存在;第二对母子:母亲CM和其12mo的儿子ZDB体内HIV-1 env准种无相同的CTL表位.结论 HIV-1在垂直传播后,随着时问的延长,母子之间HIV-1 env区突变准种所导致HLA限制性CTL表位发生改变概率增大.

TRUGENE(R)HIV-1基因型检测系统在HIV-1亚型分析中的应用

目的利用TRUGENE(R)HIV-1基因型检测系统对我国部分地区HIV感染者的血浆样本进行耐药性检测的同时进行HIV-1的亚型分析.方法采用TRUGENER HIV-1试剂盒扩增靶HIV-1序列即pol基因中长度分别为297bp的蛋白酶基因片段和621bp的逆转录酶基因片段,采用OpenGeneR DNA测序系统和数据分析软件进行测序和序列分析,利用HIVDatabase网站提供的HIV基因亚型分析软件对所得到的靶序列进行亚型分析.结果对165份标本的靶序列进行扩增和测序全部成功,采用蛋白酶基因片断和反转录酶基因片断进行亚型分析的结果非常吻合,165份标本亚型的分类与分布情况提示目前各类感染人群中的HIV-1毒株的亚型分布特点呈现出多样化和复杂性.另外,发现了一例国内尚未报道过的CRF09-cpxHIV-1的感染.结论TRUGENERHIV-1基因型检测系统可以成功的应用于HIV-1的亚型分析.