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HIV-1中国株CN54 Gag蛋白在毕赤酵母中的表达纯化和鉴定
目的利用毕赤酵母表达系统高效表达HIV-1中国株CN54的Gag蛋白,初步确立发酵和纯化工艺.方法PCR扩增CN54 Gag基因,插入毕赤酵母表达载体pPS1.0,电转化毕赤酵母菌株GS115,G418筛选高表达工程菌,利用5L发酵罐进行高密发酵,通过SP Sepharose FF和DEAE Separose FF柱层析,用HIV-1阳性血清和p24抗原检测试剂盒对纯化后的Gag蛋白进行免疫学性质的鉴定.结果构建了高效表达CN54 Gag蛋白的毕赤酵母工程菌株,发酵罐培养的菌体密度吸光度(A600值)超过300,Gag蛋白表达量达到120 mg/L.纯化后的Gag蛋白纯度高于90%,p24检测强阳性并能够与HIV-1阳性血清发生特异的抗原抗体结合反应.结论本研究在毕赤酵母中高效表达了HIV-1中国株CN54的Gag蛋白,并进行了纯化和鉴定,为针对我国新一代HIV蛋白亚单位疫苗的研制奠定了基础.
关键词： HIV-1 HIV核心蛋白质P55 基因表达 毕赤酵母 -
河北省输血后艾滋病病毒感染暴发的追踪监测
目的 研究河北省输血后艾滋病暴发流行特征及家庭传播情况.方法 在全省范围内,通过艾滋病监测网络和输血感染重点区域的疫情普查,对在河北省某市发现的输血感染艾滋病及其导致的家庭传播进行分析,用ELISA法初筛HIV抗体,用Western-blot进行确认试验,用套式PCR进行HIV env基因扩增.对扩增产物进行亚型分析.结果 发现在河北省某市医疗机构输血后HIV感染173例,占全省输血感染的68.7%(173/252),其中医院发现89例,疾病预防控制中心发现84例.家庭传播率为32.0%(49/153),夫妻家庭传播率为17.0%(26/153),母婴家庭传播率为32.7%(32/98).输血感染者以青壮年为主,女性多于男性,输血原因以怀孕分娩及妇女病为主,其次是外伤手术.输血时间为1990年至1999年,高峰为1995年;发现时间为1999年至2009年,高峰为2003年,输血后感染者主要分布于该市境内的某康泰医院和某煤矿医院,分别占45.1%(78/173)和42.2%(73/173).病原型别为HIV-1 B'亚型.结论 该市基层医疗机构由于不对有偿供血者筛查HIV抗体,导致了输血者HIV感染的暴发.
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负载Ad5-HIVgag/env的DC疫苗在小鼠体内的免疫原性研究
目的 用Ad5-HIV gag/env负载小鼠树突状细胞(Dendritic cell,DC),探索其在小鼠体内诱导的HIV Gag/Env特异性细胞免疫应答.方法 贴壁法分离纯化BALB/c小鼠DCs,并用细胞因子诱导DC细胞成熟,采用流式细胞术鉴定其纯度.利用重组腺病毒Ad5-HIV gag/env感染DC细胞,制备DC疫苗.用所制备DC疫苗免疫小鼠,在免疫后的不同时间点,用ELISPOT方法检测小鼠体内HIV特异性细胞免疫应答水平.结果 成功培养出Ad5-HIVgag/env负载的DC疫苗;免疫荧光以及流式细胞术检测到Gag/Env抗原可在DC内有效表达;上述DC疫苗免疫小鼠后能诱导高水平HIV特异性细胞免疫反应.结论 Ad5-HIV gag/env负载的树突状细胞疫苗可以在小鼠体内诱导较强的HIV特异性细胞免疫反应.
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北京市男男性接触HIV-1感染者膜蛋白基因序列测定及亚型分析
目的 了解北京市男男性接触人群(MSM)中HIV-1的新流行趋势及膜蛋白V3环序列特征.方法 巢式聚合酶链式反应(n-PER)扩增2007年提取的北京市男男性接触HIV感染者基因组DNA样品,对膜蛋白基因C2-V3区测序,进行病毒亚型及V3环序列特点分析.结果 11例样本中,4例是欧美B亚型,5例是AE重组亚型,1例是BC重组亚型,1例是01B重组亚型.V3环顶端四肽以GPGQ和GPGR为主.结论 北京市男男性接触HIV-1感染者中重组亚型呈蔓延流行趋势.
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早期HIV-1感染env基因的动态变异研究
目的 追踪观察HIV-1新发感染者体内CRF07_BC重组毒株膜蛋白基因的变异性.方法 从HIV-1感染者血浆中提取总RNA,通过逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)获得HIV-1 gp120全长及C2-C5区段基因.纯化后装入T载体,转化至Top10大肠埃希菌内增殖,通过蓝白斑筛选获得阳性克隆,运用PCR方法进行鉴定,后对所获得的目的克隆测序.结果从两个感染者血浆样品中获得感染后半年到2年半间多个时间点的gp120基因克隆共135个及gp120基因C2-C5区段克隆15个,分析显示这些克隆均为HIV-1 CRF07_BC亚型.随感染时间的延长,HIV-1 env基因的离散率与多样性均有增加的趋势.env基因同义突变与非同义突变比较结果显示,C1、C3与V4区段非同义突变比率比gp120基因的其他区域都高.基因多态性分析的结果显示,同一时间点内不同毒株基因在不同区段的变异是不同的,基因多样性介于0与0.066±0.028之间.结论 随着患者感染时间的推移,HIV-1膜蛋白基因的变异逐渐增大.C1、C3和V4区的高突变率提示,该基因区可能是HIV-1病毒生存与宿主免疫压力相互作用的主要位点.
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HIV-1流行毒株HIV DNA的研究
目的了解HIV-1流行毒株中HIV DNA的变异特性。方法用逆转录PCR(RT-PCR)，长片段PCR(Long-Distance PCR LD-PCR)、分子克隆、杂交和测序等对63例HIV-1感染者外周血单个核细胞(PBMC)HIV DNA进行研究。结果 57例标本可明确定型，其中B亚型43例，C亚型5例，E亚型9例。57例中31例既存在完整又存在不完整的HIV-1 DNA，19例只存在不完整的HIV-1 DNA片段，7例只有完整的HIV-1 DNA，缺失的大范围为7 759个碱基，小范围71个碱基，以多片段缺损为常见。结论 HIV DNA基因片段变异在HIV感染和流行传播中是非常重要的。
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表达HIV-1 gag基因的重组AAV2/1和Ad5疫苗免疫原性比较
目的 在小鼠体内比较表达HIT-1 gag基因的重组AAV2/1和Ad5疫苗的免疫原性.方法 分别用rAAV2/1-gag或rAd5-gag单独免疫BALB/c小鼠一次或两次,于免疫后不同时间点用CFSE染色法和胞内细胞因子染色法检测Gag特异性细胞免疫应答,用ELISA方法检测Gag特异性抗体反应.结果 单次免疫结果显示,在所有检测点rAd5-gag所诱导的Gag特异性CTL应答都比rAAV2/1-gag强,抗体反应在免疫后4周无明显差异.两次免疫后4周的检测结果表明,rAd5-gag所诱导的Gag特异性CTL应答比rAAV2/1-gag强,但抗体反应比rAAV2/1-gag组弱.结论 rAd5-gag诱导了很好的HIV-1特异性细胞和抗体反应,而rAAV2/1-gag诱导的HIV-1特异性抗体反应很强,但细胞免疫应答较弱.
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含HIV-1 gp120基因的重组腺相关病毒和重组腺病毒疫苗联合免疫的研究
目的探讨含HIV-1 gp120基因的重组腺相关病毒(rAAV)和重组腺病毒(rAdV)疫苗在BALB/c小鼠中联合免疫的效果.方法将密码子优化的HIV-1 gp120基因分别插入腺相关病毒(AAV)和腺病毒(AdV)载体质粒,构建含该基因的rAVV和rAdV载体疫苗.将两种疫苗以不同的联合方式免疫BALB/c小鼠,ELISA检测小鼠血清中的gp120特异性抗体,细胞内细胞因子染色法检测小鼠的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答.结果两种重组病毒均可表达目的基因gp120;在小鼠体内两种重组病毒联合免疫可诱导特异性的CTL应答和血清IgG抗体反应,但用rAAV初免2次,再用rAdV加强3次所诱发的CTL和血清IgG反应强.结论rAAV和rAdV疫苗联合免疫可在小鼠体内诱导特异性的CTL应答和血清IgG抗体反应.
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广东省珠江三角洲地区吸毒者中流行的HIV-1 ENV基因序列分析
目的 了解广东省珠江三角洲地区吸毒者HIV-1亚型的流行规律及其与国际参考株的同源性.方法 应用套式聚合酶链反应(PCR)对43例采自广东省珠江三角洲HIV-1抗体阳性的吸毒者淋巴细胞富集液,并对其核酸样品进行扩增,使用ABI377型测序仪对扩增产物测序后,对其ENV基因C2-V3段的核酸序列进行比较分析.结果 43份血样中,29份为07-BC重组亚型,与国际参考株CN.97.C54A近,基因离散率为(2.291±1.055)%,组内离散率为(3.534±1.306)%;9份为AE重组亚型,与国际参考株01AE.TH.90.CM240近,基因离散率为(8.068±0.534)%,组内离散率为(2.823±1.235)%;3份为08-BC重组亚型,与国际参考株97CNGX-9F近,基因离散率为(1.403±0.681)%,组内离散率为(1.507±0.681)%;2份为泰国B(B')亚型,与国际参考株RL42近,基因离散率为(7.335±3.330)%,组内距离为8.52%.结论 广东省珠江三角洲地区吸毒者感染的HIV-1以曾经主要在西北地区吸毒人群中流行的07-BC重组亚型为主,也存在主要以性传播途径感染的人群中流行的AE重组亚型,提示珠江三角洲地区吸毒者中流行的HIV-1亚型趋于多样化.
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含密码子优化型HIV-1 gp120基因重组腺病毒的构建及其免疫效果研究
目的构建能表达野生型和密码子优化型人免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)B亚型中国流行株gp120基因的非复制型腺病毒.方法按哺乳动物细胞偏好的密码子对HIV-1 B亚型中国流行株Ch gp42的gp120基因进行优化,合成优化基因.将野生型和密码子优化的gp120基因插入穿梭质粒,再与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化E.coli BJ5183,获得重组子,转染293细胞后获得重组病毒.分别以两种重组腺病毒疫苗免疫小鼠,ELISA检测小鼠血清中的特异性抗体,乳酸脱氢酶法检测小鼠细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应.结果获得两株重组腺病毒rad-wt.gp120和rAd-mod.gp120,能正确表达Gp120.rAd-mod.gp120比rAd-wt.gp120蛋白表达水平明显提高.重组腺病毒免疫小鼠后能产生HⅣ-1特异性的抗体及CTL反应,rAd-mod.gp120组明显优于rAd-wt.gp120组结论成功构建了表达野生型和密码子优化的HIV-1 gp120基因的重组腺病毒,能诱导HIV-1特异性体液和细胞免疫反应.
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山东省某些高危人群HIV-1感染者分子流行病学研究
目的 了解流行于山东境内HIV-1毒株的亚型分布及变异情况，分析其来源并推测其流行趋势。方法 采集了25份HIV-1抗体阳性感染者的全血分离单核细胞(PBMC)，提取前病毒DNA，经nested-PCR扩增HIV-1膜蛋白(env)基因的C2-V3区并进行序列测定和亚型分析。结果 25份HIV-1阳性感染者的PBMC样品中扩增到24份可用于序列测定的HIV-1env基因片段，经序列测定和基因分析鉴别出共有5种HIV-1M亚群基因亚型：A、B、C、E和B＇亚型。13名有偿献血人员均为B＇(泰国B)亚型，10名回国劳工及1名回国劳工的女性配偶中存在A、B、C、E四种亚型。结论 山东省HIV-1各种亚型毒株感染情况复杂，因此应加强对献血者及回国劳工等高危人群的检测和控制，以防HIV-1各亚型毒株在全省的蔓延。
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中国HIV-1感染疾病长期不进展者CCR2-64I、SDF1-3′A和CCR5△32的基因变异研究
目的探讨CCR2-64I、SDF1-3′A、CCR5△32基因变异对中国HIV-1感染疾病长期不进展者(long-term nonprogressors,LTNPs)疾病进程的影响.方法收集17例中国HIV-1感染LTNPs和39例中国HIV-1感染疾病典型进展者(typical progressors,TPs)的抗凝全血标本,用全自动核酸提取仪提取基因组DNA,采用PCR/RFLP技术对CCR2、SDF1、CCR5基因进行检测分析.结果LTNP组的CCR2-64I、SDF1-3′A基因突变率分别为50%和62.5%,TP组的CCR2-64I和SDF1-3′A基因突变率分别为23.08%、33.33%,LTNP组CCR2-64I、SDF1-3′A基因突变率明显高于TP组(P＜0.05);LTNP组有1例CCR5△32杂合突变,未发现纯合变异,而TP组未发现CCR5△32突变.结论CCR2-64I、SDF1-3′A和CCR5△32基因突变可能是中国HIV-1感染者疾病长期不进展的保护性因素之一.
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湖北省HIV-1流行株gag基因序列测定及亚型分析
目的 了解湖北省HIV-1感染者流行毒株亚型分布和流行趋势.方法 随机采集湖北省HIV-1感染者的抗凝全血标本,分离血浆,提取病毒RNA,用套式聚合酶链反应扩增HIV-1病毒gag基因,并进行序列测定和亚型分析.结果 对80份HIV-1感染者的样品进行扩增,得到了62份样品的HIV-1基因片段.共发现7种HIV-1亚型和流行重组株.泰国B'亚型占11.3％ (7/62),欧美B亚型占4.8％ (3/62),G亚型占4.8％ (3/62),CRF07-BC占22.6％ (14/62),CRF08-BC占6.5％(4/62),CRF01-AE占48.4％(30/62),CRF15-01B占1.6％ (1/62).在湖北省发现了CRF15-01B和G亚型.结论 湖北省存在多种HIV-1亚型和流行重组型,CRF01-AE、CRF07-BC两种重组亚型毒株为目前湖北省HIV-1流行优势毒株,应加强对HIV-1毒株亚型变异的监测,及时调整防治策略.
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河南地区HIV-1毒株Gag基因抗原表位变异特征及准种特点研究
目的 探讨中国河南地区人免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)毒株GAG蛋白抗原表位变异特征,并对其准种特点加以分析.方法 套式聚合酶链反应(Nested-PCR)扩增确认HIV阳性样本gagp17～p24基因区段并测序,PCR产物纯化后克隆,挑选克隆株鉴定为阳性后测序,以MEGA(version 3.0)等软件进行分析.结果 河南HIV毒株为B'亚型;gag基因p17区段抗原表位突变有E62G(55.80%),Y79F(48.90%),T84V(48.90%),144V(44.20%),gag基因p24区段抗原表位未见明显变异.结论 HIV-1 B'亚型毒株gag基因p17区段的4个抗原表位,存在较大变异,p24区段较为保守,适合抗原表位疫苗的研制.
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Ad5-HIVgag免疫的食蟹猴中腺病毒中和抗体与Gag特异性细胞免疫反应的研究
目的 观察不同剂量的重组腺病毒疫苗Ad5-HIVgag反复肌内注射免疫食蟹猴后,食蟹猴体内产生的腺病毒中和抗体水平及Gag特异性细胞免疫反应水平,初步探讨腺病毒中和抗体的产生对Gag特异性细胞免疫反应的影响.方法 将24只食蟹猴随机分为4组:对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组.每3周免疫1次,连续免疫5次.免疫前及免疫后不同时间点用中和实验检测动物体内腺病毒中和抗体水平,用Elispot方法检测Gag特异性细胞免疫反应水平.结果 初次免疫后3周3个实验组动物都检测到了较高水平的腺病毒中和抗体,在初次免疫后8周达到高峰,恢复期结束时略有下降.初次免疫后5周三个实验组动物都检测到了Gag特异性细胞免疫反应,除初次免疫后12周反应水平有所下降,其他时间点细胞反应呈逐渐增高趋势,但各剂量组间未见明显的量效关系.结论 在一定的剂量范围内反复多次应用Ad5-HIVgag免疫食蟹猴后,可产生针对腺病毒的中和抗体,随着免疫次数的增多Gag特异性细胞免疫反应有增高趋势,Ad5疫苗免疫后中和抗体的产生对Ad5疫苗反复应用诱导的Gag特异性细胞免疫反应抑制作用并不明显.
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国产HIV-1p24抗原检测试剂盒的评价
目的 探讨国产的HIV-1 p24抗原检测试剂盒进行药物筛选研究的可行性.方法 对国产试剂盒的使用性能与Biomerieux公司商品化的Vironostika试剂盒进行比较,评估国产试剂盒的敏感性、重复性及检验效能.结果 国产试剂盒具有较高的敏感性和重复性,在体外药效学筛选实验中国产试剂盒的阳性检出率及药物评价结果与Vironostika试剂盒差异无统计学意义(P＞0.05).结论 国产试剂盒具有较好的使用特性,在药物筛选中可以用国产试剂盒替代Vironostika试剂盒.
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CD4+T淋巴细胞的活化在HIV-1感染长期非进展者及典型进展者之间差异的研究
目的 了解CD4+T淋巴细胞的活化在长期感染非进展者(LTNP)及典型进展者(TP)之间的差异,探讨HIV感染的免疫基础.方法 收集24例HIV-1感染患者(7名LTNP患者,17名TP患者)及15例健康对照的抗凝血标本,流式细胞术检测CD4+T淋巴细胞的活化标志物CD38并检测其CD4计数等指标;bDNA方法检测患者体内的病毒载量.结果 与正常人相比,LTNP患者的CD4+T淋巴细胞的活化的差异无统计学意义(P＞0.05)而TP患者的活化程度明显增高(P＜0.01);HIV感染者CD4+T淋巴细胞CD38的表达水平与CD4计数呈正相关,与病毒载量呈负相关.结论 随着疾病的进展,CD4+T淋巴细胞的活化程度逐渐增高;LTNP患者CD4+T淋巴细胞的活化程度没有明显增高可能是其疾病长期不进展的原因之一.
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26例有偿献血员HIV-1基因分型与变异特征
目的 分析某地区有偿献血人员中流行的人免疫缺陷病毒1型( HIV-1) gag、pol、env基因亚型及基因变异特征.方法 提取HIV-1感染者外周血单核细胞(PBMC) DNA,经巢式PCR( Nested PCR)扩增gag(p17-p24)、pol( PR-RT)、env(C2-V5)基因片段,纯化测序后用MEGA5.0等生物学软件对核苷酸序列进行分析.结果 23份样本为B亚型,2份为B亚型与C亚型重组,1份为CRF01_AE与B亚型重组.PR区未发现蛋白酶抑制剂主要耐药性突变,RT区检测到核苷类逆转录酶抑制剂耐药性突变M184V和非核苷类逆转录酶抑制剂耐药性突变K101E,G190A.结论 流行于该地区的HIV-1毒株以B亚型为主.大多数毒株对常规抗病毒药物仍然敏感,使用HARRT治疗方案依然有效.CXCR4型辅助受体的毒株顶端四肽多为GPGR(91.7％),提示GPGR可能与疾病的进展有关.
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中国汉族人HIV-1协同受体CXCR4基因编码区新的突变位点研究
目的对中国汉族人群HIV-1协同受体CXCR4编码区的基因多态性进行研究,为中国的获得性免疫缺陷综合征(AIDS)防治提供依据.方法 CXCR4(cDNA编号AF147204)编码区用2对引物进行PCR扩增,然后分别测序,测序样本数为48例.用DNAstar分析测序结果,寻找SNP位点.结果在编码区发现了7个SNP位点,其中3个同义突变(129位C→T、426位C→T,968 C→T),3个有义突变(38位C→T、90位A→T、712位A→C),1个终止突变(106位C→T使谷氨酸密码子变成终止密码子).其中38位C→T、90位A→T、712位A→C、106位C→T,基因突变频率为4.2%、4.2%、9.4%和3.1%.结论在CXCR4编码区找到的7个SNP位点中,4个引起氨基酸改变,1个已有报道,对HIV-1感染和AIDS病程的影响值得研究.
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HIV-1病毒感染因子基因克隆、表达、纯化及其抗体制备的研究
目的 制备HIV-1病毒感染因子(Vif)及其抗体.方法 用PCR技术从HIV-1 NL4.3cDNA质粒中扩增病毒感染因子(vif)基因,vif基因全长为579 nt(核苷酸),翻译成含192个氨基酸的蛋白质.将测序鉴定过的vif基因克隆到原核表达载体pET-32a上,以包涵体的形式在大肠埃希菌BL21(DE3)中高效表达,Vif蛋白C端融合6×His标签便于纯化及鉴定.应用酶切鉴定、SDS-PAGE及Western Blot等方法确保基因片段的正确性及表达蛋白的特异性.间接ELISA法测定兔多克隆抗体滴度.结果 成功地获得了高纯度的Vif融合蛋白,纯度可达80%以上.用其制备多克隆抗体滴度可达1:204 800.结论 获得高纯度的Vif融合蛋白及其高效价的抗体.
