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下调lmna基因促进斑马鱼胚胎细胞凋亡
目的 探讨利用吗啉代寡核苷酸技术(MO)下调lmna后斑马鱼胚胎细胞的凋亡机制.方法 在目的基因lmna序列中选择靶点,设计针对目的基因的吗啉代寡核苷酸序列(lmna-MO),利用显微注射技术,将lmna-MO注射到野生型斑马鱼(Tüebingen品系)胚胎中,下调斑马鱼lmna基因.采用流式细胞技术检测细胞凋亡,Western blot检测凋亡蛋白p-AKT、AKT及BCL-2的表达量.结果 注射lmna-MO后24和72 h,斑马鱼胚胎均存在细胞早期凋亡,且与药物暴露时相存在相关性(P<0.01);lmna-MO注射后24和72 h,p-AKT蛋白的表达较野生型胚胎的表达均有增加(P<0.01);AKT蛋白的表达较野生型胚胎的表达均有增加(P<0.05);而BCL-2蛋白的表达较野生型胚胎的表达均有下降(P<0.05).结论 lmna基因参与调控斑马鱼胚胎细胞凋亡过程,其机制可能与AKT蛋白及BCL-2蛋白的表达有关;p-AKT(S473)参与AKT通路活化,而lmna基因下调可促进AKT磷酸化,通过活化P13K/AKT信号通路来抑制凋亡促进细胞存活,但其并非唯一凋亡调控机制.
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长春碱增加班马鱼肿瘤耐药基因abcb4的表达
目的通过研究长春碱(VBL)对斑马鱼早期发育过程中abcb4肿瘤耐药基因表达的影响,为进一步建立抗肿瘤药物多药耐药筛选的斑马鱼模型奠定重要的实验基础.方法将长春碱稀释成不同浓度梯度的药液,在受精后0.5~1.5 h 的斑马鱼胚胎上完成药物暴露实验,计算出长春碱 IC50的数值.设置长春碱为实验组,胚胎培养液为空白对照组,分别作用于受精后0.5~1.5 h的斑马鱼胚胎,观察受精后24~120 h的斑马鱼胚胎发育情况,记录死亡、孵化及畸形的胚胎数目;收集不同组别的斑马鱼胚胎,通过实时荧光定量PCR和胚胎整体原位杂交的方法,检测斑马鱼胚胎中abcb4基因的表达量.结果计算出长春碱在斑马鱼胚胎中的IC50为3.08 μmol/L;与对照组比较,实验组的斑马鱼胚胎abcb4基因的mRNA水平明显升高(P<0.05);通过胚胎整体原位杂交的方法,在受精后120 h斑马鱼胚胎的小肠部位发现有abcb4基因阳性杂交信号,且实验组斑马鱼胚胎在脑和心脏部位发现abcb4基因阳性杂交信号.结论长春碱能明显增加斑马鱼早期胚胎中abcb4肿瘤耐药基因的表达水平,提示使用斑马鱼可以复制肿瘤耐药模型.
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新型的动物模型-可示踪胰岛β细胞发育的转基因斑马鱼
目的 建立活体可视化胰岛β细胞发育的立体表达动物模型.方法 利用分子克隆、显微注射、全胚胎原位杂交和活体摄像等方法 ,建立绿色荧光蛋白标记胰岛β细胞的转基因斑马鱼.结果 建立并筛选获得胰岛β细胞发育的转基因斑马鱼,证实荧光蛋白与内源性胰岛素的共定位表达,实现活体动态监测胰岛β细胞的发育情况.结论 胰岛β细胞的转基因斑马鱼动物模型实现在整体动物水平上研究胰岛β细胞的发育.
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斑马鱼——髓鞘损伤与再生研究的理想动物模型
脱髓鞘疾病是以多发性硬化为主要表现的自身免疫性疾病,髓鞘脱失与再生的机制不明,利用动物模型进行深入研究是一个有效途径.新型模式动物——斑马鱼具有发育快速、胚胎透明、遗传学技术成熟等优势,通过构建转基因斑马鱼可以对细胞进行活体、动态观察和基因表达模式分析,是研究髓鞘损伤与再生的理想动物模型.
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成年斑马鱼视神经再生期间顶盖表面纤维层和灰质层的突触形态学研究
目的研究斑马鱼视神经再生过程中神经递质的变化,探讨神经递质和神经再生的关系.方法应用斑马鱼视神经再生模型,通过电镜技术观察顶盖表面纤维和灰质层突触的形态变化.结果视神经损伤后顶盖突触变化过程大致可分4个时期:1.视神经损伤后早期顶盖突触结构的退变;突触密度和突触小泡密度均下降,空型终末密度增大,8 d时突触小泡密度降到低水平;而空型终末密度高.2.损伤后14d再生纤维大量进入顶盖;这一时期大核小泡和小核小泡密度都大量增加,但进入顶盖的纤维还没有或很少形成突触,14 d时突触密度降到低.3.损伤后21 d的特征是突触大量形成和圆形清亮小泡、扁平清亮小泡密度增加.4.再生晚期突触形态和功能恢复及精确化;100 d时突触密度和突触小泡密度都大体恢复正常,但大核小泡密度还很高. 结论兴奋性神经递质和抑制性神经递质可能对早期神经再生的启动和突触的形成起重要作用,而肽类和胺类可能对再生轴突的投射和精确化有重要作用;神经递质促进神经再生有先后顺序.
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斑马鱼胚胎发育过程成纤维细胞生长因子受体基因时序性表达
目的 探讨斑马鱼胚胎发育过程成纤维细胞生长因子(FGF)受体基因时序性表达规律.方法 分别提取发育至4、6、10、12、18、24、48及72hpf斑马鱼胚胎总RNA并反转录为cDNA,用实时定量PCR方法检测FGF受体基因(fgfrs) mRNA的相对表达量.结果 斑马鱼胚胎发育过程fgfrs mRNA动态表达水平有明显峰谷变化(P＜0.01),胚胎fgfrs开始表达阶段依次为fr1a与fgr1b(囊胚期)、fgfr4(原肠胚初期)、fgfr2(原肠胚期)及fgfr3(原肠胚后期),其表达高峰期分别在原肠胚期、原肠胚后期、体节期及胚胎发育中后期.旁系同源基因fgfr1a与fgfr1b动态表达趋势相似(r =0.830,P＜0.05).fr1a与fgfr3、fgfr1b与fgfr4、fgfr2与fgfr3 mRNA表达量之间相关分析也有意义(r值分别为-0.726,0.821及0.772,P＜0.05).结论 斑马鱼胚胎发育过程fgfrs时序性表达有一定规律性,fgfr1、fgfr4主要参与胚胎早期发育调控,fgfr2、fgfr3主要参与胚胎中、后期发育调控.fgfr1a与fr1b共表达使其调控作用具有冗余能力.fgfr1和fgfr3之间在表达上可能存在相互制约关系.
关键词： 胚胎发育 成纤维细胞生长因子受体 基因表达 实时定量聚合酶链反应 斑马鱼 -
斑马鱼胚胎发育过程中miR-9、miR-219及Dicer基因的时序性表达
目的 探讨斑马鱼胚胎发育过程中miR-9、miR-219及Dicer基因时序性表达规律.方法 取正常发育至受精后4、8、12、16、20、24、36、48和72 h(hpf)斑马鱼胚胎各约40枚,用Trizol法分别提取总RNA,茎环法反转录为cDNA,用Real-time PCR检测胚胎miR-9、miR-219及Dicer表达量.结果 miR-9、miR-219及Dicer表达水平在胚胎发育过程中呈现峰谷变化,不同发育阶段之间总的差异有统计学意义(P＜ 0.05).与胚胎发育全程的基因平均表达水平相比,miR-9在8 hpf之前表达量较低(P＜0.05),36 hpf后表达量持续增高,48 hpf和72 hpf时表达量显著高于平均水平(P＜0.01).miR-219在8 hpf之前表达量也处于较低水平(P＜0.05),20 hpf后迅速增高,24hpf时达到峰值,并持续到48 hpf(P ＜0.01).Dicer在胚胎早期(4 hpf)就有明显表达(P＜0.05),随后表达水平迅速下降,16 hpf时达到低点(P＜0.05),然后逐渐回升,直至胚胎末期.结论 斑马鱼胚胎发育过程miR-9、miR-219及Dicer时序性表达有一定规律,miR-9主要在胚胎后期表达,miR-219主要在胚胎中期表达,Dicer主要在胚胎早期表达,其次在胚胎后期,提示miR-9、miR-219及Dicer参与胚胎发育调控过程.
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铅对斑马鱼胚胎发育的毒性作用
目的 探讨铅对斑马鱼胚胎发育的毒性作用. 方法 野生型AB品系斑马鱼胚胎,自受精后1h(1 hpf)起,分别用醋酸铅质量浓度为0.1、0.5、2.5、12.5 μmol/L胚胎培养液染毒至胚胎孵出或死亡,每组胚胎50枚,相差显微镜下观察胚胎发育全程并记录毒性反应,于4、8、16、24、48、72hpf进行胚胎活体摄片,以不含铅培养液孵养的胚胎作为对照.另取各组36 hpf胚胎,电镜下观察间脑神经细胞超微结构. 结果 铅暴露组胚胎死亡率明显升高(P＜0.05),在胚胎发育早期有1个高峰,而且随着铅暴露浓度增高,胚胎死亡率总体呈上升趋势(P＜0.01)；铅暴露胚胎发育异常主要见于胚胎发育早期,多表现为胚胎发育迟缓；铅暴露胚胎在发育过程中出现少数畸形,但无统计学意义；除12.5μmol/L铅暴露组外,其他铅暴露组胚胎的平均孵出时间较对照组滞后(P＜0.05)；电镜观察显示,铅暴露可引起胚胎神经细胞核固缩,细胞水肿,细胞器结构受损. 结论 铅对斑马鱼胚胎发育有明显的毒性作用,在胚胎发育早期尤为敏感；即使较低水平的铅暴露,仍可引起胚胎神经细胞的损害.
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非肌性肌球蛋白Ⅱ-B调节斑马鱼咽弓的发育
目的 探讨非肌性肌球蛋白Ⅱ(NMⅡ)家族基因在斑马鱼胚胎期咽弓的表达及其对咽弓发育的影响.方法 通过斑马鱼胚胎整体原位杂交及冷冻切片技术(n=10),观察NMⅡ家族基因在斑马鱼胚胎期咽弓的表达情况.利用软骨的阿辛蓝染色方法,将野生型对照组(n=10)和blebbistatin处理组(每个浓度n=10)的斑马鱼胚胎进行比较,分析NMⅡ对斑马鱼胚胎期咽弓发育和形成的影响.结果 受精后72 h(72hpf),NMⅡ-B在斑马鱼发育着的咽弓部位有特异性表达;120 hpf,NMⅡ-B在咽弓表达增加.Blebbistatin特异性抑制NMⅡ-B功能后,斑马鱼咽弓发生明显发育缺陷,部分软骨细胞出现显著形态改变;抑制咽弓形成的作用与blebbistatin浓度呈现剂量依赖效应.结论 NMⅡ-B通过影响咽弓软骨细胞从而调节斑马鱼胚胎期咽弓的发育.
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铜对斑马鱼鳃的损伤及其作用机制
目的 探讨铜对斑马鱼鳃的生物毒性作用及其机制.方法 设置0.05 mg /L、0.1 mg /L、0.2 mg /L 3个铜离子暴露浓度和1个对照组,研究铜离子对斑马鱼鳃组织显微和超微结构,抗氧化防御系统超氧化物歧化酶(SOD) 活性和丙二醛(MDA) 含量及免疫相关因子肿瘤坏死因子α(TNF-α) 、白细胞介素-6(IL-6) 、白细胞介素-1β(IL-1β) 水平的影响.结果 铜离子暴露组斑马鱼鳃均出现不同程度的损伤,中低浓度组以防御损伤为主,高浓度组以直接损伤为主.光学显微镜下可看到上皮细胞肿胀、脱落,表面大量黏液,鳃小片基部细胞增生甚至融合;透射电子显微镜下可观察到暴露组线粒体、粗面内质网等细胞器肿胀,线粒体嵴崩落或消失等细胞胀亡形态特征;SOD活性和MDA含量随铜离子浓度增加和暴露时间的延长出现不同程度的上升趋势,铜离子暴露对斑马鱼SOD、 MDA为诱导效应;与对照组相比,不同时间、不同浓度重金属铜处理后TNF-α、IL-6、IL-1β 水平出现不同程度的上升趋势.结论 重金属铜对斑马鱼鳃组织结构和抗氧化系统有明显的损伤,能够诱导免疫炎症反应.
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斑马鱼视网膜-顶盖系统的组织学研究
目的研究斑马鱼(Brachydanio re rio)视网膜-顶盖系统的组织结构. 方法用组织学和数理统计对顶盖结构和视神经纤维数量及其内、外径进行定量分析. 结果视网膜分为10层.顶盖分为6层,总厚度为219.73±8.31μm. 斑马鱼神经纤维总数约为78?960根,神经纤维的平均外径为0.50±0.18μm,平均内径为 0.35±0.14μm.视神经中未见到无髓神经纤维. 结论以上结果既符合脊椎动物的基本模式又反映出斑马鱼喜光、白昼活动的小型鱼个体类型的特点.
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斑马鱼视网膜再生研究进展
哺乳动物视网膜损伤后仅有非常有限的自我修复能力.与哺乳动物不同,硬骨鱼类如斑马鱼的视网膜则具有旺盛的再生能力.斑马鱼视网膜损伤后,能够再生其丢失的所有类型的神经元和胶质细胞,并恢复大部分视力.研究表明,斑马鱼视网膜再生的细胞来源是Müller细胞.近年来,关于斑马鱼视网膜Müller细胞去分化及其增殖的分子机制和信号通路的研究取得了许多新的进展.我们就斑马鱼视网膜再生的研究历史、损伤模型和再生细胞来源以及调控的分子机制等做一综述.
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斑马鱼3D解剖互动系统的制作
目的 制作斑马鱼三维(3D)解剖互动系统软件.方法 采用光学显微镜和微计算机断层扫描技术(Micro-CT)研究斑马鱼的组织构造,并收集其形态结构图像.使用Photoshop对获得的连续切片(HE染色)的图片进行校正,使用Autodesk 3ds Max 2012 64-bit-English软件进行三维模型建立.结果 获得了斑马鱼骨骼的3D成像和连续切片图像(雄鱼144张,雌鱼179张),实现了斑马鱼重要器官的3D重构,建立了斑马鱼3D解剖互动系统(V 1.0),获得了计算机软件著作权登记证书(证书号:软著登字第0989966号). 结论 斑马鱼3D解剖互动系统软件制作的完成为研究斑马鱼立体形态学奠定了基础.
关键词： 连续切片 图片校正 三维重建 微计算机断层扫描技术 斑马鱼 -
sox19b在斑马鱼胚胎眼睛发育中的作用
目的 通过抑制sox19b基因的表达,探讨sox19b基因在斑马鱼胚胎眼睛发育和形成中的作用.方法 通过显微注射sox19b吗啉寡聚核苷酸(MO)抑制sox19b基因的表达,观察胚胎发育过程中表型的变化；采用石蜡包埋组织切片及HE染色、RT-PCR和整封原位杂交等方法探讨敲除sox19b后对斑马鱼胚胎眼睛发育的调控机制.结果 敲除sox19b基因后,斑马鱼胚胎眼睛发育受到影响,表现为眼睛变小或缺失,视网膜及晶状体结构发育异常(n=57/93)；眼睛发育过程中重要调控基因rx3、pax2a及vsx2等表达明显降低,进而影响眼睛的发育和形成.结论 sox19b基因作为转录调控因子,可以通过调节眼区转录因子的表达进而影响斑马鱼胚胎早期眼睛的发育和形成.
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zdhhc17对斑马鱼集中延伸运动的调节及其机制
目的 通过抑制zdhhc17基因的表达,探讨其在斑马鱼胚胎发育过程中的作用及机制.方法 通过显微注射zdhhc17吗啉反义寡聚核苷酸(MO)抑制zdhhc17翻译,观察斑马鱼胚胎发育过程中相关表型的变化.利用斑马鱼整封原位杂交技术,检测集中延伸运动相关标记基因(dlx3b、ntl、myod1、tbx6等)的表达变化.利用RT-PCR技术,检测集中延伸运动相关调控因子mRNA表达水平的变化.结果 敲除zdhhc17基因后,斑马鱼胚胎集中延伸运动出现严重缺陷,主要表现为尾部弯曲变短(82/118),且集中延伸运动相关标记基因表达异常,钙黏附蛋白家族cdhi、padh18a mRNA水平降低.结论 zdhhc17通过调节钙黏附蛋白家族cdh1、padh18a基因的表达,进而影响细胞黏附运动,终参与调控斑马鱼胚胎集中延伸运动.
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心脏再生的研究进展
冠心病及心肌梗死的发生率正呈逐年上升趋势,成人心肌细胞有限的再生能力限制了心肌梗死后心脏功能的恢复.斑马鱼及新生乳鼠心脏再生能力的发现给该领域带来了新的方向及希望.心脏再生动物模型种类日渐丰富,不同的生物模型对于不同的研究目的有着重要的作用.本文总结了近年来心脏再生动物模型的发展,并对心脏再生机制探索中所取得的重要研究进展进行论述.
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解开体内胆固醇运输的秘密
科学家们已经发现了一种流行的抗胆固醇药物的一部分机制.Steven Forber,Ph.D,Eric Smart,Ph.D.和他们的合作者已经发现用药物Zetia治疗高胆固醇血症小鼠的小肠里有一种由2种蛋白质合成的复合物被分裂了.同时,他们用"反义"分子去阻止斑马鱼的这种复合物的形成,结果使胆固醇在小肠的吸收减少.结果表明这些蛋白质是构成小肠内未被识别的完整的胆固醇运输系统所必需的.
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斑马鱼异种异体急性髓系白血病模型的建立
目的:探讨利用人急性髓系白血病干细胞和斑马鱼建立斑马鱼白血病模型,为白血病的研究及治疗药物的筛选提供更为直接的体外研究模型和体内实验依据.方法:利用MitoRed染料对白血病干样细胞KG-1a细胞进行标记,然后通过显微注射法把KG-1a细胞植入斑马鱼胚胎的卵黄囊中,观察移植后斑马鱼胚胎的大体存活状态、细胞在斑马鱼体内的增殖和扩散转移;应用组织学切片观察移植后细胞对斑马鱼组织器官的侵袭作用.结果:KG-1a细胞植入斑马鱼胚胎的卵黄囊后,MitoRed标记的KG-1a细胞数目随时间延长而增多并逐渐扩散至整个腹腔,体外计数结果也显示植入细胞明显增殖,表明植入的白血病干细胞能够在斑马鱼体内存活,增殖并扩散.进一步的研究显示,在斑马鱼肝脏组织发现有白血病细胞的浸润,HE染色提示浸润细胞具有KG-1a细胞核型特征.结论:异种异体的人急性髓系白血病干细胞KG-1a可以植入斑马鱼体内并成功建立斑马鱼的白血病模型.该模型的建立可为白血病的研究及治疗药物的筛选提供一种更为直接高效的体外研究平台.
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健脾益气摄血方对辛伐他汀诱导斑马鱼出血模型的止血效果研究
目的:观察健脾益气摄血方对辛伐他汀诱导斑马鱼出血的止血效果并与清热凉血方比较.方法:用辛伐他汀0.5 μmol/L处理AB系斑马鱼24 h,建立斑马鱼出血模型,在严格盲态实验条件下,在大非致死量范围内,应用不同浓度实验药物处理出血斑马鱼,以出血减少率、止血率为主要观察指标,以类似脾气虚特点的血流量、血流量改善率与运动速度、运动改善率为附加指标,综合评价健脾益气摄血方的干预效果.结果:实验药物B1在浓度为500和1 000 μg/ml时出血斑马鱼的出血率分别为30％和15％,止血率分别为60％和80％;实验药物B2在浓度为500和1 000 μg/ml时出血斑马鱼出血率分别为45％和40％,止血率分别为40％和47％.表明在降低斑马鱼出血率与止血效果两方面实验药物B1优于实验药物B2.在相等浓度下,在提高出血斑马鱼血流量与血流量改善率两方面实验药物B1优于实验药物B2.在相等浓度下,在促进斑马鱼运动速度与提高斑马鱼运动改善率方面实验药物B1优于实验药物B2.结论:健脾益气摄血方对辛伐他汀诱导的斑马鱼出血有良好的止血效果,并能够改善出血斑马鱼血流量与提高运动速度,为健脾益气摄血方治疗脾不统血证提供了实验依据.
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基于斑马鱼骨质疏松模型评价一组2-乙酰苯并五元杂环类化合物的抗骨质疏松活性
目的采用地塞米松建立斑马鱼骨质疏松模型，筛选先导物G39及其结构类似物的抗骨质疏松活性。
方法斑马鱼 AB 系胚胎受精后6~72 h 浸于地塞米松溶液建模，受精后3 d分组给药直至受精后6 d，收集固定斑马鱼幼体；采用茜素红染色法显示成骨发育状况，显微拍照后以 G39为对照，进行斑马鱼头面骨成骨面积和骨矿化密度的半定量分析，比较六种2-乙酰苯并五元杂环类化合物潜在的抗骨质疏松活性。
结果 G395μg/ml 组对地塞米松导致的斑马鱼骨质疏松具有显著的改善作用，且实验结果与地塞米松大鼠模型具有一致性。以此筛选 G39衍生物体内活性，发现苯并呋喃衍生物410活性优于 G39。
结论地塞米松斑马鱼骨质疏松模型评价周期缩短、成本低，使抗骨质疏松药物体内活性批量筛选成为可能，为更快更准地发现抗骨质疏松候选药物打下坚实基础。通过本研究筛选得到了全新结构类型的抗骨质疏松化合物410，其活性较 G39更强，值得进一步研究。关键词： 抗骨质疏松 斑马鱼 2-乙酰苯并五元杂环类化合物 活性筛选
