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斑马鱼毛细胞损伤及再生研究进展
内耳毛细胞的损伤是引起感音神经性聋的常见原因，而寻找刺激毛细胞再生的可能条件，是治疗感音神经性聋的重要方向；斑马鱼作为新兴模式生物，其胚胎及早期幼鱼通体透明，侧线毛细胞位于体表，以及生殖周期短、繁殖能力强且基因与人类基因约87%相似。鉴于斑马鱼以上生物学特性，耳科学研究者亦采用斑马鱼模型探讨毛细胞损伤及再生机制。本文拟对斑马鱼毛细胞损伤及再生的相关研究进展进行综述。
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视锥-视杆同源盒基因对斑马鱼光感受器细胞发育的影响
目的 观察斑马鱼受精卵CRX基因表达下调后,视网膜光感受器细胞外节盘的发育和视蛋白的表达.方法 实验研究.斑马鱼受精卵内显微注射CRX-寡核苷酸,使CRX基因的表达下降.通过眼球的组织学切片、电镜标本和视蛋白RNA探针的原位杂交观察光感受器细胞以及外节盘的发育和视蛋白的表达.结果 视网膜组织学观察,CRX组与对照组、空白组比较,视网膜和光感受器细胞的发育都没有明显差别.电镜观察,对照组和空白组光感受器细胞都有外节盘形成,但是CRX组未发现明显的外节盘结构.对照组和空白组斑马鱼均可在鼻侧视网膜区域观察到视紫红质(rhodopsin,Rho),视锥细胞蓝色视蛋白(SWS1)和紫外线视蛋白(SWS2)3种视蛋白的表达,CRX组3种视蛋白的表达明显减少.结论 CRX基因影响斑马鱼光感受器细胞外节盘的发育和视蛋白的表达.
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斑马鱼在眼前节胚胎发育和疾病研究中的应用进展
近年来,斑马鱼凭借其体型小、繁殖力强、生长发育快、胚胎透明等独特的生物学特性,成为人类疾病动物模型的理想选择,加之与人类眼部结构和基因的高度保守性,使斑马鱼受到眼科学领域工作者的关注.本文主要对斑马鱼在眼前节胚胎发育,包括角膜、晶状体和前房的形态发生,以及眼前节疾病(角膜病、白内障、青光眼等)方面的研究和应用作一综述.
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成骨细胞特异性转录因子osterix在斑马鱼颅颌面发育早期时空表达特征的初步研究
目的 探讨成骨细胞特异性转录因子osterix基因在斑马鱼颅颌面发育早期的表达特征,为进一步研究其在颅颌面骨骼和牙齿发育早期的分子调控机制奠定基础.方法 PCR扩增osterix基因的特异性基因片段,制备地高辛标记osterix基因的反义mRNA探针和正义mRNA探针;通过整胚原位杂交技术检测osterix基因在斑马鱼颅颌面骨骼与牙齿发育早期的转录分布,进一步比较osterix基因在颅颌面骨骼发育中的矿化表达特征;通过茜素红染色突出osterix基因在牙齿发育中的矿化表达特点.结果 成功合成osterix基因的反义和正义mRNA探针;反义探针杂交检测显示:在受精后3～4 d osterix基因开始在斑马鱼颅颌面膜内成骨部位表达,在受精后5～6 d osterix基因在牙齿特异性表达;正义探针杂交未检测到osterix基因的表达信号.osterix基因在早期尚未矿化的骨基质以及初代牙齿(3V1、5V1)、第一颗替换牙齿(4V2)的牙基质中高度表达.结论 提示osterix基因可能在斑马鱼早期未矿化骨基质转化为晚期成熟的矿化骨基质过程中,以及牙齿冠部牙基质发育矿化过程中发挥一定作用.
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超重环境对斑马鱼仔鱼早期发育和耳石形态学与化学组成的影响
目的 本研究以模式动物斑马鱼为研究对象,通过研究超重下鱼体的早期发育和耳石变化,探讨了脊椎动物前庭系统对超重环境的适应机制.方法 斑马鱼受精卵在受精后10 h分别置于1 G和5 G重力环境中,观察鱼体发育状态和耳石的形态;使用Zeiss软件比较1 G和5 G下耳石大小;使用EDAX检测耳石微化学成分含量变化.结果 1)斑马鱼从鱼卵向早期仔鱼发育过程中超重环境影响仔鱼发育,耳石形态在初期显著变大(P<0.01),其后耳石变小;2)EDAX检测表明,耳石中S和Sr含量升高,Na和Ca的含量减少;3)出现矢耳石与微耳石融合的现象.结论 超重环境影响斑马鱼早期发育,耳石的形态与微化学组成发生变化,导致耳石的功能发生变化.
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富勒烯对斑马鱼~(60) Coγ辐射生物效应修饰作用的研究
目的 研究富勒烯化合物对斑马鱼受到γ射线照射后的存活率、畸形发生率的影响及其机制,以了解富勒烯类化合物对辐射生物效应的修饰作用.方法 ~(60)Co γ射线照射下富勒烯母体纳米颗粒对斑马鱼成鱼存活率的改变,同时利用斑马鱼胚胎-幼体比较该化合物对不同照射条件下斑马鱼鱼卵及幼体畸形发生率的影响,并从活性氧(ROS)生成的改变及DNA链断裂形成探讨了其可能的作用机制.结果 光照期给药500×10~(-9)的富勒烯母体(nano-C_(60))能增强γ射线照射对成鱼的杀伤作用,在此条件下活性氧生成和DNA损伤增加,且抑制胚胎的孵出率和导致畸形的发生率增加;但避光期用药对射线效应没有明显的增强作用,除了高浓度5000×10~(-9)会抑制幼鱼的孵出率,并导致发育畸形增加.结论 富勒烯母体对斑马鱼的辐射损伤效应有增强作用,其机制可能是在光照期用药后活化并导致活性氧生成增加,并导致DNA氧化损伤增强.
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细辛脑对斑马鱼胚胎发育及运动行为的影响
目的：研究细辛脑对斑马鱼胚胎发育及运动行为的影响。方法以受精后3h（hpf）斑马鱼胚胎为实验模型，分别暴露于不同浓度（25、50、100、200和400μmol/L）细辛脑溶液中，以不加细辛脑为对照组，每隔24 h更换1次细辛脑溶液，分别在24、48、72和96 hpf等时间点用显微镜观察班马鱼胚胎发育形态，记录24 hpf胚胎自主抽动次数，48 hpf心率、畸形率和死亡率，72和96 hpf孵化率和死亡率，利用RT-qPCR检测96 hpf斑马鱼胚胎Sepn1基因表达情况，采用Noldus斑马鱼幼鱼行为视频跟踪系统评价细辛脑暴露对幼鱼运动行为的影响。结果细辛脑各实验组斑马鱼胚胎自主抽动次数随浓度增加而降低，100、200和400μmol/L组与对照组相比有极显著性统计学差异（P＜0.01）；细辛脑各实验组斑马鱼48 hpf心率显著降低，与对照组相比均有显著统计学差异（P＜0.01）；72和96 hpf斑马鱼幼鱼出现了脊柱弯曲、心包水肿、卵黄囊水肿等畸形形态；与对照组相比，100、200和400μmol/L组96 hpf孵化率均下降，具有显著性统计学差异（P＜0.01）；与对照组相比，400μmol/L组死亡率降低，有统计学差异（P＜0.05）；随着细辛脑浓度增加，96 hpf斑马鱼幼鱼运动速度和距离明显减小，200和400μmol/L组与对照组相比均有统计学差异（P＜0.05）；同时200和400μmol/L浓度组活跃度降低，与对照组相比具有显著差异（P＜0.01）；96 hpf时，细辛脑各浓度组胚胎Sepn1基因表达下降，其中100μmol/L组与对照组相比有统计学差异（P＜0.05），而200和400μmol/L组与对照组相比差异更显著（P＜0.01）。结论细辛脑对斑马鱼胚胎和幼鱼有致畸作用，并且影响其运动行为，建议婴幼儿慎用细辛脑。
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敌敌畏对斑马鱼运动行为的影响
目的 利用视频跟踪系统研究敌敌畏对斑马鱼运动行为的影响.方法 将斑马鱼浸泡在不同浓度敌敌畏(0、15、20、26、34和45 mg/L)的养殖水中,视频记录染毒后24 h斑马鱼的垂直穿梭次数、顶部停留时间、水平移动距离和水平穿梭次数的变化.结果 随着染毒浓度的增加,斑马鱼出现不规则运动.与正常对照组相比,敌敌畏45 mg/L组斑马鱼水平移动距离和水平穿梭次数明显减少(P＜0.01).同时,敌敌畏34和45 mg/L组垂直穿梭次数也显著降低(P＜0.01),敌敌畏26、34和45 mg/L组斑马鱼在观察箱顶部停留时间明显延长(P＜0.05).结论 敌敌畏对斑马鱼运动行为有抑制作用,通过视频跟踪系统对斑马鱼运动行为的观察和研究方法可广泛应用于药物行为学毒性的评价.
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基于模式生物斑马鱼的化学毒剂作用靶标发现及应对策略
化学毒剂袭击是恐怖袭击中易采用的方式之一,需采取快速检测并对损伤快速救治等一系列应对策略.近年来,模式生物斑马鱼在毒理学和药理学等研究方面得到了广泛应用.斑马鱼研究和应用平台为多种新型化学毒剂的发现及其相关治疗药物研究提供了一种快速有效的研究策略.本文对斑马鱼在化学毒剂、潜在毒剂作用靶标发现及相关救治药物筛选中的研究进展进行综述.
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模式生物斑马鱼在中药研究中的应用
斑马鱼作为一种新的模式动物,已经在生物医学的诸多研究领域得到了广泛的应用.近年来,基于斑马鱼的中药相关研究越来越多.本文重点综述了斑马鱼应用于中药药理、毒理研究方面的成果和前景.
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斑马鱼在药物代谢中的研究进展
斑马鱼作为模式生物已经被广泛地用于药物研发的各个过程中.斑马鱼中有细胞色素P450酶(cytochrome P450,CYP450)、尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶(uridine 5’-diphospho-glucuronosyltrans ferase,UGT)等多种药物代谢酶和核受体如孕烷X受体(pregnane X receptor,PXR)、芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor,AHR)等的表达.本文综述了斑马鱼中主要的药物代谢酶和核受体的表达情况,以及在药物等外源物代谢研究中的进展.
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以斑马鱼为模式动物研究生物分子对血脑屏障的通透性
血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)是药物输送到中枢神经系统的主要障碍.目前缺乏合适的考察血脑屏障通透性的动物模型.斑马鱼是生命科学研究中重要的脊椎动物之一.本研究以可通透BBB的多肽和蛋白质为工具,对比它们在斑马鱼与小鼠体内的分布情况,探讨斑马鱼作为BBB通透功能模式动物的可行性.结果显示,斑马鱼与小鼠的BBB对物质的通透能力相似.另外,斑马鱼具有体型小、繁殖能力强、易于养殖等优势.因此,斑马鱼可能是研究物质通透BBB比较理想的模式动物.
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地塞米松影响骨骼发育的斑马鱼模型的建立
本文首次采用斑马鱼模型动物,以糖皮质激素地塞米松为模型药,以建立一种快速、高效的骨质疏松新模型.将受精后4天(4 dpf)的斑马鱼幼鱼暴露于不同浓度地塞米松溶液中,设阴性(0.5％ DMSO)对照组,28.5℃下在24孔板中培养至9 dpf,至斑马鱼头部骨骼形成.并用此模型观察依替膦酸二钠对斑马鱼头骨矿化的影响及对10 μmol·L-1地塞米松诱导的斑马鱼骨质疏松的防治作用.采用茜素红对培养9天的斑马鱼骨骼进行染色,以显微检测、数码成像方法定量分析骨骼染色区域.结果显示:与阴性对照组相比,地塞米松(2.5、10和25 μmol·L-1)组的斑马鱼头部骨骼染色面积和染色光密度值显著减少；依替膦酸二钠(15及30 μg·mL-1)能增加斑马鱼头骨矿化量并有效防止地塞米松诱导斑马鱼产生的骨质疏松.结果提示,地塞米松使斑马鱼头骨骼矿化量和骨密度显著降低,成功诱导斑马鱼产生骨质疏松.该模型亦成功验证依替膦酸二钠能防止骨质疏松的作用.
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力达霉素通过下调VEGF表达抑制斑马鱼胚胎血管生成
本研究采用斑马鱼胚胎模型研究力达霉素在整体动物水平对血管生成的影响.力达霉素处理胚胎后,利用形态学观察、血管染色法、转基因斑马鱼检测其对胚胎血管生成影响,以荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法检测VEGF基因的表达情况.结果显示:力达霉素处理后,胚胎出现心包水肿、血流速度减缓等症状;血管生长率降低,肠下静脉生成受到抑制.荧光定量PCR和蛋白免疫印迹检测表明,力达霉素对胚胎的VEGF mRNA表达水平没有影响,但VEGF蛋白的表达受到显著抑制.研究结果表明,力达霉素可以下调VEGF蛋白表达,从而抑制斑马鱼胚胎血管生成.
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基于肝窦内皮细胞功能评价隐丹参酮抑制血管新生的作用
观察隐丹参酮调控人肝窦内皮细胞(human hepatic sinusoidal endothelial cells,HHSEC)功能抑制血管新生的作用.本文以CCK8法测定隐丹参酮对HHSEC毒性;以内皮细胞生长因子(endothelial cell growth supplements,ECGS)诱导HHSEC增殖,以索拉非尼为阳性对照药,CCK8法、5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(5-ethynyl-2'-deoxyuridine,EdU)检测细胞增殖;免疫荧光法观察胞内血管性血友病因子(von willebrand factor,vWF)的表达;荧光探针法测定胞内一氧化氮(nitric oxide,NO)水平;管腔形成实验、斑马鱼血管新生实验评价其抑制血管新生的作用.与空白组比较,ECGS显著诱导HHSEC增殖,升高vWF表达和NO水平,10 μmol.L-1隐丹参酮能够显著抑制HHSEC的增殖,降低vWF表达和胞内NO水平;对管腔形成及转基因斑马鱼血管新生具有显著抑制作用.结果提示,隐丹参酮具有调节内皮细胞功能抑制血管新生的活性.
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基于斑马鱼毒/代同步进程法分析巴戟天配伍淫羊藿减毒作用
基于体内转化的毒性研究至关重要,但难以实时动态观察,本文提出斑马鱼毒/代(毒性/代谢)同步进程法,并用于揭示淫羊藿中毒及其配伍巴戟天后的减毒作用.将受精后1天(1 dpf)的健康斑马鱼胚胎置于不同浓度淫羊藿水煎液(YYH)、淫羊藿黄酮组分(YTF)、代表黄酮成分(朝藿定C和淫羊藿苷)及分别配伍巴戟天水煎液(BJT)的供试液中,同时设置空白溶媒(0.4％ DMSO)对照组,观察记录给药后1～5天(2～6 dpf)的鱼中毒和死亡情况,显微镜观察3 dpf斑马幼鱼形态,用SPSS16.0计算不同供试液在2～6 dpf的鱼半数致死浓度(LC50);同时,分别选取各样品的一个相对安全浓度,每天同步取药液分析淫羊藿代表黄酮成分动态代谢变化.结果表明:淫羊藿中主要黄酮成分朝藿定A/B/C和淫羊藿苷经斑马鱼作用后动态转化为以箭藿苷C和宝藿苷Ⅰ为主的代谢物,其中宝藿苷Ⅰ主要来自朝藿定A/B和淫羊藿苷,原形和代谢物均不会致鱼中毒;而箭藿苷C主要来自朝藿定C,箭藿苷C的动态增加与YYH、YTF及朝藿定C的毒性产生密切相关;配伍BJT后,淫羊藿主要黄酮成分(如朝藿定C)代谢速度减慢,伴随产生的毒性也减缓.斑马鱼毒/代同步进程法揭示淫羊藿中朝藿定C代谢转化为箭藿苷C后增加毒性,是淫羊藿潜在致毒关键黄酮成分,巴戟天通过减缓朝藿定C代谢速度而减毒.研究为中药毒性物质发现及配伍减毒提供新思路与方法.
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忍冬根的化学成分及其抗炎作用
为了研究忍冬(Lonicera japonica Thunb.)根的化学成分,采用硅胶、Sephadex LH-20等柱色谱和制备液相色谱等对其95％乙醇提取物进行分离纯化,共得到17个化合物,并通过质谱、核磁共振波谱等分别鉴定为1-oxo-(1H)-cyclopenta[b]benzofuran-7-carbaldehyde (1)、4-羟基桂皮酸(2)、绿原酸(3)、loganin aglycone(4)、咖啡酸(5)、裂环马钱素二甲基乙缩醛(6)、korolkoside (7)、松柏苷(8)、獐牙菜苷(9)、断氧化马钱子苷(10)、5-O-咖啡酰奎宁酸(ll)、3-O-咖啡酰奎宁酸甲酯(12)、3-O-咖啡酰奎宁酸乙酯(13)、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸(14)、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸(15)、grandifloroside (16)和3,4-O-二咖啡酰奎宁酸(17).其中化合物l为新化合物,化合物8为首次从该植物中分离得到,其他成分均为首次从忍冬根中分离得到.运用斑马鱼抗炎模型,测得化合物l、3、14～17具有抗炎活性.
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冷饭藤化学成分及其毒性评价的研究
为研究民间药冷饭藤的化学成分,采用硅胶、MCI HP20凝胶、Sephadex LH-20凝胶等柱色谱技术对其藤茎的70％丙酮提取物进行分离和纯化,得到20个化合物,根据化合物的理化性质和波谱数据鉴定化学结构为:heteroclitalignan A(1)、kadsulignan F(2)、kadoblongifolin C(3)、schizanrin F(4)、heteroclitalignan C(5)、kadsurarin (6)、kadsulignanO(7)、eburicol (8)、meso-dihydroguaiaretic acid (9)、kadsufolin A (10)、tiegusanin M(11)、heteroclitin B (12)、(7'S)-parabenzlactone (13)、angeloylbinankadsurin B (14)、propinquain H (15)、quercetin (16)、kadsulignan P (17)、schizanrin G (18)、micrandilactone C (19)和(-)-shikimic acid (20).化合物1、5、8、11～15、18、20为首次从冷饭藤中分离得到.本文应用斑马鱼模型对化合物1～10进行毒性评价,观察其对斑马鱼胚胎发育、心脏功能的影响,发现经化合物7、9和10处理后,斑马鱼胚胎出现水肿、心率明显下降,说明化合物7、9和10对斑马鱼心脏发育具有干扰作用.
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模式生物斑马鱼对川续断皂苷Ⅵ的代谢研究
首次采用模式生物斑马鱼研究续断中主要活性成分川续断皂苷Ⅵ的代谢,探索斑马鱼用于微量中药皂苷类成分代谢的可行性及合理性.采用高效液相色谱-电喷雾质谱检测,Zorbax Extend C18 (150 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱,0.05％甲酸乙腈-0.05％甲酸水梯度洗脱,正、负离子模式同时检测,根据准分子离子峰获得化合物分子量信息,通过与文献数据或对照品对照,鉴定川续断皂苷Ⅵ经斑马鱼暴露24 h后的药液及鱼体中的代谢产物.结果川续断皂苷Ⅵ经斑马鱼作用后,产生了脱去1分子、2分子及全部糖基的5种脱糖基代谢产物和1个羟基化产物,这与川续断皂苷Ⅵ在大鼠体内的代谢机制一致,提示斑马鱼对川续断皂苷Ⅵ的代谢具合理性,更具有化合物用量少,成本低、简单、高效的优势,特别是能体现在体代谢的综合结果,有望成为快速预测少量中药成分代谢、补充现有模型不足的全新的、模式生物代谢模型.
关键词： 斑马鱼 川续断皂苷Ⅵ HPLC-ESI/MS -
二维斑马鱼模型联合色谱技术评价朝藿定A及其代谢物宝藿苷Ⅰ抗骨质疏松活性
以二维斑马鱼模型联合色谱技术筛选朝藿定A及其代谢物宝藿苷Ⅰ的抗骨质疏松活性,建立高效筛选中药抗骨质疏松活性成分新方法.用斑马鱼成鱼对朝藿定A的0.5％ DMSO溶液进行代谢,代谢液浓缩后用LC-MS分析、HPLC捕获代谢产物宝藿苷Ⅰ,用斑马鱼骨质疏松模型评价朝藿定A和宝藿苷Ⅰ的活性.结果表明朝藿定A和宝藿苷Ⅰ均能防止泼尼松龙诱导斑马鱼骨质疏松.该方法使朝藿定A的量微代谢产物得到富集、分离分析,通过在体斑马鱼抗骨质疏松模型简单、高效的筛选朝藿定A及代谢产物宝藿苷Ⅰ的抗骨质疏松活性,为早期、快速发现中药量微成分及其代谢物的抗骨质疏松活性提供新思路与方法.
