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吴茱萸生物碱类化学成分及其抗血管生成活性分析
目的:研究吴茱萸Evodia rutaecarpa果实的化学成分及其抗血管生成活性.方法:采用硅胶羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20),ODS柱色谱及半制备HPLC等方法进行分离纯化,根据理化性质和波谱数据鉴定化合物结构.采用斑马鱼模型测试化合物抑制血管生成活性.结果:从吴茱萸果实中分离鉴定了20个化合物,包括1个降柠檬苦素,为calodendrolide(1);6个吲哚类生物碱,分别为吴茱萸次碱(2),吴茱萸碱(3),goshuyuamide-Ⅰ (4),N-甲酰二氢吴茱萸次碱(5),7β-羟基吴茱萸次碱(6);11个喹诺酮类生物碱,分别为2-羟基-4-甲氧基-3-(3'-甲基-2'-丁烯基)-喹诺酮(7),1-甲基-2-正壬基-4-(1H)-喹诺酮(8),1-甲基-2-正癸基-4(1H)-喹诺酮(9),1-甲基-2-正十一烷基-4(1H)-喹诺酮(10),二氢吴茱萸卡品碱(11),1-甲基-2-正十五烷基-4(1H)-喹诺酮(12),1-甲基-2-[(Z)-6-十一烯基]-4(1H)喹诺酮(13),吴茱萸卡品碱(14),1-甲基-2[(Z)-4-十三烯基]-4(1H)-喹诺酮(15),1-甲基-2-[(Z)-10-十五烯基]-4(1H)-喹诺酮和1-甲基-2-[(Z)-6-十五烯基]-4(1H)-喹诺酮的混合物(16),1-甲基-2-[(6Z,9Z)-6,9-十五二烯基]-4(1H)-喹诺酮(17);2个酰胺,分别为N-甲基-邻-氨基苯甲酰胺(18),乙酰胺(19);1个甾醇,为β-谷甾醇(20).化合物1(20 mg-L-1),2(0.5 mg·L-1),3(5,10 μg·L-1),4(10 mg·L-1),5(50 mg·L-1),10(20 mg·L-1),11(50 mg·L-1),16(20 mg·L-1),18(50 mg·L-1)对斑马鱼节间血管表现出抑制作用.结论:化合物1～18均为吴茱萸的特征性成分,化合物1和7为首次从该植物中分离得到.化合物1～5,10,11,16,18具有抑制斑马鱼血管生成活性.
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补骨脂酚的提取纯化工艺优选及其对骨质疏松症的治疗作用分析
目的:优选补骨脂酚的提取纯化工艺,并考察其对骨质疏松症的治疗作用.方法:使用乙醇回流法提取,经D101型大孔树脂纯化,通过单因素试验优选工艺条件,冷冻干燥后得到补骨脂酚;采用斑马鱼体内试验评价补骨脂酚对骨密度和骨骼发育钙化的影响.结果:优选的工艺条件为加8倍量85％乙醇浸泡过夜,回流提取3次,每次2h,边搅拌边往补骨脂酚粗提物中加入0.2％氢氧化钠水溶液至完全溶解,过预处理好的D101型大孔树脂柱处理,上样流速1 BV·h-1,静置4h,加水6 BV洗脱,用60％乙醇2 BV洗脱,加95％乙醇4 BV洗脱,收集95％乙醇的洗脱液;制备的补骨脂酚质量分数＞80％,收率＞10％.斑马鱼体内活性研究表明补骨脂酚能提高斑马鱼骨质疏松症的骨密度,且能促进正常斑马鱼骨骼发育钙化.结论:此工艺具有绿色环保、操作简便等优点,所得补骨脂酚的纯度和收率均比较理想,可开发成预防或治疗骨质疏松症的药品和食品.
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斑马鱼神经元损伤模型在养血清脑颗粒质量控制中的应用分析
目的:探讨斑马鱼神经元损伤模型在养血清脑颗粒质量控制应用的可行性,为该制剂提供一种新型生物活性质量控制方法.方法:以养血清脑颗粒为例,采用吗替麦考酚酯诱导的斑马鱼神经元损伤药效模型对养血清脑颗粒进行神经细胞保护生物活性评价和质量稳定性检测.结果:斑马鱼神经元损伤模型作为神经细胞保护药物生物活性质控方法具有较好的精密度,日内RSD 2.2％ ～3.7％,日间RSD 1.2％;重复性(RSD 8.4％)和稳定性(RSD 4.9％)良好;在0.10～1.00 g·L-1内养血清脑颗粒对神经细胞保护率成良好的线性关系,方法学考察符合生物活性测定指导原则的要求.结论:采用斑马鱼神经元损伤模型评价养血清脑颗粒神经细胞保护作用的方法快速、稳定可靠,可作为现有质量控制方法的有效补充,为中药的生物活性质量控制研究提供一定的技术参考.
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氯化两面针碱和羟基喜树碱对斑马鱼胚胎发育的影响
目的:研究氯化两面针碱和羟基喜树碱对斑马鱼发育的影响.方法:氯化两面针碱(NC)分成5.00,3.15,2.00,1.58,1.12 mg·L-1等5个含药剂量组,各组的DMSO终浓度为0.01％,并设含0.01％ DMSO的孵化液组及对照组(纯孵化液组).羟基喜树碱(HCPr)分为16.00,10.00,6.50,4.00,2.50 mg·L-15个含药剂量组,各组的DMSO终浓度为0.01％.并设对照组(纯孵化液组)及含0.01％ DMSO的孵化液组.在显微镜下将正常发育6 h(6 hpf)和48 h(48 hpf)的斑马鱼胚胎,随机分入以上各组中,每个实验组20颗胚胎.观察药物处理至72 hpf时,胚胎的死亡和畸形情况.结果:氯化两面针碱的6 hpf实验组中,半数致死浓度(LC50)为1.66 mg· L-1,半数致畸效应浓度(EC50)为1.33 mg·L-1;48 hpf实验组中,LC50为2.51 mg·L-1,EC50为2.02 mg·L-1.羟基喜树碱的6 hpf实验组中,LC50为4.21 mg·L-1,EC50为3.29 mg·L-1；48 hpf实验组中,LC50为7.70 mg·L-1,EC50为6.18 mg·L-1.斑马鱼胚胎的死亡率和畸形率随着氯化两面针碱和羟基喜树碱药物浓度的降低和给药时间的推迟而显著降低(P＜0.01).结论:6 hpf胚胎对氯化两面针碱和羟基喜树碱的药物敏感性均大于48 hpf;氯化两面针碱对斑马鱼胚胎的发育毒性大于羟基喜树碱.
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益母草不同活性组分对血管生成的调节作用
目的:考察益母草不同活性组分对人脐静脉血管内皮细胞(HUVECS)增殖以及斑马鱼血管生成的作用.方法:运用MTT法测定益母草乙酸乙酯部位和正丁醇部位对HUVECS增殖的影响.采用斑马鱼观察益母草乙酸乙酯部位和正丁醇部位对斑马鱼体节间血管生成的影响.结果:益母草乙酸乙酯部位在3.125～50μ g/mL浓度范围对HUVECS细胞具有一定的损伤作用,在6.25～50μg/mL范围可明显抑制斑马鱼体节间血管生成,体节间血管指数显著下降(P＜0.01);益母草正丁醇部位在12.5～50μg/mL范围对sunitinib诱导的HUVECS细胞损伤具有一定的保护作用(P＜0.01).在6.25～50μg/mL范围对sunitinib诱导的斑马鱼体节间血管损伤具有明显保护作用,与模型组比较,血管指数上升(P＜0.05,P＜0.01).结论:益母草对血管生成具有双向调节作用,与其不同的药效物质密切相关.
关键词： 益母草 斑马鱼 人脐静脉血管内皮细胞 血管生成 双向调节 -
木香挥发油对斑马鱼胚胎发育毒性的初步研究
目的:探讨梯度浓度木香挥发油对斑马鱼胚胎发育的影响.方法:用梯度浓度的木香挥发油处理2、12、24hpf的斑马鱼胚胎,36h后检测木香挥发油对不同发育期斑马鱼的半数致死剂量(LD50),同时分别在加药后12、24、36h记录木香挥发油对12hpf或24hpf斑马鱼胚胎畸形率以及心脏形态和心率的影响.结果:药物作用36h后,木香挥发油对2、12、24hpf斑马鱼胚胎的LD50分别为2.35、6.83、26.9μg/mL;在浓度＞3μg/mL时,木香挥发油对12hpf的斑马鱼胚胎表现出明显的致畸性,对24hpf的斑马鱼表现出延迟发育和一定的特异性心脏毒性,导致心脏畸形、心包水肿、心率随浓度增大而减小.结论:木香挥发油对斑马鱼胚胎发育有一定毒性,而且发育期越早,毒性越大,对24hpf的斑马鱼表现为延迟发育和特定的心脏毒性.
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舒心安神膏对斑马鱼运动行为的影响
目的:利用视频跟踪系统研究舒心安神膏对斑马鱼运动行为的影响.方法:将斑马鱼浸泡在不同浓度舒心安神膏和膏方中各单味中药的养殖水中,视频跟踪系统记录给药后斑马鱼的轨迹图、运动速度、运动长度、运动时间等,同时给予光周期刺激,观察斑马鱼的运动活性.结果:光照条件下,桂枝汤组、龙骨牡蛎组、乌梅山茱萸组、熟附子、砂仁、乌梅、山茱萸可增强斑马鱼运动活性(P＜0.05).黑暗条件下,四逆汤、熟附子、山茱萸、乌梅山茱萸组斑马鱼运动活力显著高于空白对照组(P＜0.05);舒心安神膏组、四逆桂枝甘草龙牡组、桂枝汤组、干姜和砂仁斑马鱼幼鱼运动活性显著降低(P＜0.05).结论:舒心安神膏对斑马鱼的运动行为有一定的抑制作用,不同组成药物对斑马鱼运动行为影响不同.
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丹红注射液对斑马鱼促血管作用的研究
目的:研究丹红注射液(DHI)对斑马鱼节间血管(ISV)的促进作用,测适宜的药效指标值,为DHI谱-效相关质量评价系统的建立提供药效学基础.方法:通过PTK787抑制血管内皮生长因子表达的方法,建立斑马鱼ISV损伤模型,通过模型组中不同浓度DHI的加入,观察斑马鱼ISV生长状态,确定加药浓度.按照预实验的造模和给药方法,检测各给药组ISV长度、计算ISV生成率,考察DHI对促进斑马鱼ISV生长的作用.结果:PTK787组ISV长度均下降,与正常对照组相比有显著性差异(P＜0.05).加DHI治疗各组ISV长度增长明显,与PTK787组比较有显著性差异(P＜0.05),30μLDHI组与正常对照组相比无统计学差异.不同批次DHI促血管生成率在40％-80％之间.结论:DHI对斑马鱼ISV具有明显的再生功能,对血管损伤有修复保护作用,方法可靠、数据可信,结果稳定.
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斑马鱼体表类穴位与类经络结构的初步观察
目的:探讨斑马鱼是否存在类经络与类穴位结构.方法:将成年斑马鱼活体经10μmol/LDiA水溶液染色,麻醉后在荧光显微镜下观察.结果:DiA荧光标记物呈亮圆点状,若干标记物聚集在一起形成簇状,有规律地分布于身体各个部位.在躯体部,标记物从背部到腹部沿躯干纵轴形成4条线,背侧线、背外侧线、外侧线和腹侧线.在高倍镜下观察,又可依据其神经联系的不同将外侧线分为外侧上线和外侧下线,将腹侧线分为腹外侧线和腹侧线.结论:斑马鱼体表感觉器官分布有一定的规律性,若干感觉器官聚集在一起形成簇,若干簇又有规律地沿躯体长轴排成线,类似于传统经络与穴位.
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斑马鱼模型在中医药研究中的应用
目前,斑马鱼模型的使用正逐渐拓展到生命体多个系统的发育、功能和疾病的研究中,其在中医药领域的研究也越来越多:主要集中在中药毒理研究、代谢研究和重大疾病中药成分活性筛选等方面的研究,本文将就斑马鱼在筛选模型、现代生物技术与传统中医中药研究相结合的新型模式等应用情况进行探讨,以期有益于中医药事业的现代研究的迅速发展.
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不同配伍比例当归补血汤化学成分及促血管新生作用比较
目的：研究不同配伍比例对当归补血汤化学成分和促血管新生作用的影响。方法采用高效液相色谱法测定不同配伍比例当归补血汤中的主要化学成分阿魏酸、毛蕊异黄酮苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素含量；采用转基因斑马鱼模型比较不同配伍比例当归补血汤的促血管新生作用。结果随着黄芪含量的增加，不同配伍比例煎液指标成分综合得分有上升趋势，且在黄芪与当归之比为8∶2与5∶1时综合得分高。对于斑马鱼血管损伤模型，血管恢复率排名前3位的配比分别是黄芪与当归之比为5∶1、6∶1和2∶1。结论从化学成分及促血管新生疗效综合分析，黄芪与当归经典配伍比例（5∶1）好于其他比例。
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高效快速降脂动物模型研究
探讨斑马鱼作为降脂药物筛选模型的可行性以及盐酸小檗碱(BBR)对高脂斑马鱼的影响.用含4％胆固醇饲料喂养3月龄斑马鱼0,2,4,8,14,20,25,30 d,检测血清总胆固醇含量的变化;测定对照组、高胆固醇组、0.01％辛伐他汀组、0.1％BBR组和0.2％ BBR组斑马鱼血清总胆固醇(TC)、总甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)的水平;RT-PCR检测肝脏HMGCR,LDLR和CYP7A1a mRNA的表达水平;油红O染色检测肝脏中脂肪含量的变化.结果显示4％胆固醇喂养斑马鱼后血清TC水平升高且有时间依赖性,20 d基本达到稳定水平;BBR组斑马鱼血清TC,TG和LDL-c水平显著下降,肝脏HMGCR mRNA的表达下降,LDLR和CYP7A1a mRNA的表达升高,脂肪含量减少.4％胆固醇饲料喂养斑马鱼20 d即可建立高脂斑马鱼模型,研究结果为进一步开展降脂药物的筛选奠定基础.
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黄地安消胶囊对高糖高脂诱导的斑马鱼血管病变保护作用研究
选取受精后5 d(days post-fertilization,dpf)不同品系斑马鱼,白天和晚上交替给予0.2％高脂饲料8h和3％葡萄糖溶液16 h,连续4d,建立糖尿病斑马鱼模型,随机分为模型组、黄地安消胶囊(260 mg·L-1)组、吡格列酮(32 mg·L-1)组,给药组分别水溶暴露给予相应药物,同时设置正常对照组.每组设置30尾斑马鱼,容量为25 mL,28℃培养箱孵育4d.检测黄地安消胶囊对斑马鱼眼底血管壁厚度、胰岛β细胞荧光强度、巨噬细胞荧光强度、血流速度的改善作用;RT-PCR技术检测血管内皮生长因子(vegfaa)和血管紧张素转化酶(ACE)的表达.结果显示,与模型组比较,黄地安消胶囊能够明显降低血管壁厚度,增加胰岛β细胞和巨噬细胞荧光强度表达,增加体内血流速度,同时降低斑马鱼ACE和vegfaa基因表达,提示黄地安消胶囊可能通过调节ACE和vegfaa基因表达改善斑马鱼血管病变.
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莪术醇对斑马鱼的血管生成活性及作用机制研究
目的:初步研究莪术醇促进血管生成的活性及作用机制,为临床用药提供依据.方法:采用斑马鱼生物模式,观察莪术醇对斑马鱼胚胎体节间血管生长、成鱼剪尾后血管再生和仔鱼切尾后组织再生情况.采用相对荧光定量PCR法检测仔鱼切尾后体内血管内皮生长因子(VEGFA)及受体(VEGFR2)基因的表达.结果:莪术醇能使斑马鱼胚胎体节间血管侧生出新的血管,使成鱼剪尾后血管再生加快,使仔鱼切尾后尾部再生加快.且莪术醇能提高仔鱼体内VEGFA及VEGFR2基因的表达量,促进仔鱼切尾后的尾部再生.结论:莪术醇能促进斑马鱼的血管生成,提高仔鱼切尾后体内VEGFA及VEGFR2基因的表达量,促进尾部再生.
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斑马鱼在药物筛选中的应用
与其他模式动物相比,斑马鱼在药物的活性成分筛选方面具有独特的优势,近年来在药物研究开发中受到越来越多的重视.该文着重就斑马鱼在中药有效部位研究、中药单体筛选、天然产物和药物“老药新用”的应用前景以及药物的早期毒理评估等方面的新研究进展进行了综述,以期为广大中药研究开发人员在中药新药研发方面提供借鉴参考.
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斑马鱼——一种可用于中药药效和毒性筛选的鱼类模型
斑马鱼是一种用于生长发育和遗传研究的重要模式生物,过去10余年来,被广泛应用于环境毒物的监测,已经被用于环境中许多化学物质如有害重金属、农药以及卤代芳香烃化合物等致癌物的累积效应和毒性研究.近年来,该模型越来越多地应用于药物筛选和毒理学研究.斑马鱼具有活体、高通量的优点,尤其适用于中药混合物的药效和毒性筛选,在中药新药研究领域具有较广的应用前景.
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斑马鱼在中药研究中的应用
斑马鱼模型作为一个整体的动物模型,其体积小、高通量、费用低、周期短,且实验结果可靠,在药物研究领域广泛应用.中药是一个复杂的系统,其有效成分及作用机制是中药现代化发展的研究热点之一,随着先进技术和方法的不断改进,斑马鱼在中药研究中的应用逐渐深入,并且已经在活性筛选、毒理、代谢研究等方面表现出优越性.该文主要介绍了近年来斑马鱼在中药研究中应用的概况,以期能为中药基础研究提供新的思路和方法.
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基于斑马鱼M-Act/Tox一体化评价的抗骨质疏松中药高效筛选思路与方法
日益显现的壮骨中药肝损伤问题为临床应用带来挑战,抗骨质疏松中药筛选有必要兼顾有效性与安全性,而代谢转化至关效应与毒性,故全面考虑代谢-效/毒一体的筛选具有意义.评价模型和化合物(含代谢物)数量严重制约早期在体、高效筛选.参考课题组前期相关研究及国内外文献,提出斑马鱼代谢模型、骨质疏松模型及毒性评价法有机整合可建立M-Act/Tox(metabolism-action/toxicity)一体化的抗骨质疏松中药高效筛选法.突破量微成分无法在体、高效及一体化评价的难点和盲点,实现基于体内过程且兼顾有效性与安全性的全方位抗骨质疏松中药高效筛选,对加速发现安全有效的抗骨质疏松创新中药具有意义.
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二维斑马鱼模型联合色谱技术高效筛选中药抗骨质疏松活性成分的思路与方法
目的:提出以二维斑马鱼模型联合色谱技术突破评价模型和化合物数量制约,建立高效筛选中药抗骨质疏松活性成分新方法.方法:根据本课题组相关研究及国外有关文献资料,依据斑马鱼骨质疏松模型可高效评价活性,斑马鱼代谢模型可高效富集代谢产物,现代色谱联用技术可高效分离、分析中药成分,提出三者有机联合有望高效解码中药抗骨质疏松体内、外药效物质.结果与结论:该方法使中药成分特别是量微成分与代谢产物的富集、分离分析、在体抗骨质疏松活性筛选简单、高效,充分体现中药药效物质含原形成分及代谢产物,具“多成分,多靶点,整体作用”的特点,为中药抗骨质疏松活性成分的早期、快速发现提供新思路与方法.
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相同摩尔浓度下淫羊藿苷及朝藿定C单体在斑马鱼骨质疏松模型中的活性研究
目的 用泼尼松龙诱导的斑马鱼骨质疏松模型评价相同摩尔浓度下淫羊藿苷和朝藿定C单体的抗斑马鱼骨质疏松作用.方法 将受精后4日的斑马鱼胚胎分为S组(0.5％二甲亚砜DMSO)、A组(泼尼松龙25μmol/L,0.5％ DMSO)、B组(2 IU/L鲑降钙素,泼尼松龙25μmol/L,0.5％ DMSO)、C组(淫羊藿苷1.5μmol/L,泼尼松龙25μmol/L,0.5％ DMSO)、D组(淫羊藿苷15μmol/L,泼尼松龙25μmol/L,0.5％DMSO)、E组(淫羊藿苷150μmol/L,泼尼松龙25 μmol/L,0.5％ DMSO)、F组(朝藿定C 1.5 μmol/L,泼尼松龙25 μmol/L,0.5％ DMSO)、G组(朝藿定C 15μmol/L,泼尼松龙25 μmol/L,0.5％ DMSO)、H组(朝藿定C 150μmol/L,泼尼松龙25μmol/L,0.5％ DMSO).所有培养液均含有0.5％ DMSD.将各组幼鱼放置与24孔板中,每日更换培养液,在恒温环境28.5℃培养箱中,培养至第9天处死,以茜素红染色.用显微镜对斑马鱼颅骨腹侧进行观察,定量分析将成像染色区域.结果 与S组比较,A组骨矿化累计光密度值降低(P＜0.01);B组骨矿化累计光密度值升高(P＜0.01).而C、D、E组随浓度增加矿化面积呈微弱的递增趋势(P＜0.05).与A组比较,B组累计光密度值增高明显,差异有统计学意义(P＜0.01),C、D组差异无统计学意义(P＞0.05),而E组明显升高(P＜0.05).F、G组随浓度增加,矿化面积呈递增趋势,颅骨染色累计光密度值升高(P＜0.05),H组内斑马鱼胚胎无存活.E、F、G组间比较,差异无统计学意义(P＞0.05).S组斑马鱼头颅骨染色清晰,脊椎骨及两旁鳃骨染色清晰.A组在相同染色区域的强度明显减少.B组在相同条件下呈现骨组织成骨加快,矿化面积明显增多,骨组织深染等特点.C、D、E、F、G组,在染色中颅骨矿化程度逐渐增加,椎骨及两侧腮骨矿化面积及染色强度递增,以椎骨改变为显著,但均未达到B组的染色强度.结论 斑马鱼骨质疏松模型是一种简单、高效的中药成分筛选模型,低浓度朝藿定C在该模型中的活性优于淫羊藿苷,高浓度朝藿定C的可能毒性作用还需要深入研究.
