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应用斑马鱼模型评价纳米粒子毒性机制的研究进展
纳米科学是21世纪重点支柱领域之一.目前纳米粒子的生物安全性体外实验已取得了一些研究成果,但其体内安全性评价,由于受到限制而进展缓慢.而斑马鱼是纳米粒子体内生物安全性评价的佳模式生物.本文就目前国内外开展的纳米粒子体内毒理学的研究方法和成果以及以斑马鱼作为模式生物研究纳米粒子体内毒性机制的优势进行了综述.
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纳米氧化锌暴露对斑马鱼胚胎心脏发育的毒性效应和机制研究
目的 观察纳米氧化锌暴露对斑马鱼胚胎心脏发育及大鼠心肌细胞(H9c2)的毒性作用及可能机制.方法 对纳米氧化锌材料进行表征化处理.斑马鱼胚胎在受精后4 h(4 hpf)暴露纳米氧化锌颗粒0.5,2.5,5.0和10.0 mg·L-1 24～96 h,计算胚胎存活率,并于胚胎17 hpf时间点,收集并用实时定量PCR测定中胚层脊索同源(noto),T盒16(tbx16),过短同源a(ta)和tbx6 mRNA表达;观察斑马鱼72 hpf心率.将心肌细胞标记红色荧光蛋白Tg(cmlc2.nuc-dsRed)的斑马鱼交配取胚胎,染毒纳米氧化锌2.5和5.0 mg·L-1,计数72 hpf胚胎心肌细胞数目.大鼠心肌细胞(H9c2)与纳米氧化锌0,0.1,0.5,1,5.0和10.0 mg·L-1共培养24 h,Alamar Blue方法检测细胞活力,透射电子显微镜观察线粒体超微结构,化学发光法和Seahorse仪分别检测细胞ATP和耗氧率水平.结果 纳米氧化锌在双蒸水中的粒径分布为(331±3)nm.48 hpf的斑马鱼胚胎纳米氧化锌LC50为21.81 mg· L-1.暴露纳米氧化锌2.5 mg·L-1后,17 hpf斑马鱼胚胎的心脏发育关键基因noto,ta和tbx6表达降低(P＜0.05).72 hpf斑马鱼暴露纳米氧化锌5.0 mg·L-1,心率为153 min-1,与正常对照组相比降低12.6％(P＜0.01),心肌细胞数目减少15.5％(P＜0.01).纳米氧化锌0.5 mg·L-1可引起大鼠心肌细胞(H9c2)细胞活力降低(P＜0.05)以及线粒体出现空泡化现象.与细胞对照组相比,细胞ATP减少25.7％(P＜0.05),耗氧率减少27.2％(P＜0.01).结论 低剂量纳米氧化锌暴露对斑马鱼心脏发育有一定影响,主要表现为心率降低和心肌细胞数目减少,这些变化可能与心脏发育相关基因表达减少以及细胞线粒体结构和功能损伤有关.
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补骨脂水煎液和醇提物对斑马鱼骨骼发育的影响及其毒性作用
目的 研究补骨脂水煎液(WD)和醇提物(EE)促骨骼发育与安全性的差异.方法 将受精后3d(3 dpf)斑马鱼幼鱼暴露于泼尼松龙(PN)25μmol·L-1和WD或EE 0.1,1,10和100 mg生药·L-1,以及依替膦酸二钠(ED)30 mg·L-1溶液中,隔天换液至9 dpf处死.茜素红染色光学显微镜观察斑马鱼头骨骨矿化面积和骨密度,荧光定量PCR法检测9 dpf斑马鱼骨保护素(OPG)和NF-κB受体活化因子配体(RANKL)mRNA表达.另将1 dpf斑马鱼胚胎置于EE 10,20,30,35,40,50和60 mg生药·L-1、WD 10,50,100,125,150,175,200和500 mg生药·L-1、补骨脂素(PS)12.5,25,50,100,200和400μmol·L-1及补骨脂酚(BK)1,5,10,25和50 μmol·L-1溶液中,光镜检测3 dpf斑马鱼胚胎形态,观察记录给药后2～9 dpf胚胎或幼鱼死亡数,SPSS软件计算4,6和9 dpf LC50;另用速率法检测6 dpf斑马幼鱼谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)活性.结果 与模型组相比,EE 0.1 mg生药·L-1和WD 1 mg生药·L-1能显著增加斑马鱼头部骨骼染色面积和骨密度(P＜0.01),提示增加骨矿化量;且WD和EE1 mg生药·L-1均上调OPG mRNA、下调RANKLmRNA表达水平(P＜0.01),OPG/RANKL比值显著提高(P＜0.01).EE,WD,PS和BK可致斑马鱼心包、卵黄囊肿大,GOT活性降低(P＜0.01),WD和PS的LCso值分别为EE和BK的4～7倍和4.3～20倍.结论 EE较WD促骨骼发育活性强,且毒性更大,提示脂溶性特征性成分可能是起效或致毒的关键成分.
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斑马鱼高血脂模型在山青之片质量控制中的应用研究
目的:探讨斑马鱼高血脂模型在山青之片质量控制中的应用.方法:用高脂肪饮食诱导的斑马鱼高血脂模型对山青之片进行生物活性评价和质量稳定性检测.结果:斑马鱼高血脂模型作为降血脂药物生物学质量内控检测方法具有较好的可重复性(RSD为3.5%)及稳定性(RSD为3.6%);不同批号山青之片具有较好的质量稳定性,其血脂降低率平均值为60.8%(P<0.001),RSD为1.9%;同批次山青之片供试品溶液室温放置8 h以内质量稳定,血脂降低率平均值为60.5%(P<0.001),RSD为3.1%.结论:用斑马鱼高血脂模型评价中药山青之片的降血脂效果,方法快速、稳定可靠;应用斑马鱼模型建立中药的生物学质量标准有助于推动中药的现代化,值得尝试和推广.
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山豆根不同提取部位的毒性作用研究
目的 明确山豆根的主要毒性部位.方法 制备山豆根水煎液,过大孔吸附树脂进行分离,得到水洗部位、生物碱部位和非生物碱部位(主要包括黄酮类和皂苷类).斑马鱼急性毒性实验被用于评价山豆根不同提取部位的毒性大小.此外,通过MTT法检测不同提取部位给药24 h对HcpG2细胞活力的影响并计算半数抑制浓度(IC50);LDH释放检测试剂盒检测细胞膜损伤程度;Annexin V-FITC/PI双染,流式细胞术检测细胞凋亡.结果 斑马鱼急性毒性实验结果提示非生物碱部位为山豆根主要毒性部位.MTT法结果也显示非生物碱部位对HepG2细胞活力的抑制作用强;非生物碱部位可以引起HepG2细胞膜损伤,在2 g·L-1细胞损伤率达到67.31％;非生物碱部位(2g·L-1)给药24 h引起的HepG2细胞凋亡显著高于对照组(P＜0.05).结论 山豆根非生物碱部位可能为山豆根主要毒性部位,非生物碱部位可能通过诱导细胞膜损伤和凋亡从而影响细胞活力.
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4种孕妇禁忌中成药对斑马鱼胚胎发育毒性研究
目的 研究4种孕妇禁忌中成药妇乐颗粒、妇炎净胶囊、参茸白凤丸、乳癖散结胶囊对斑马鱼胚胎发育的毒性.方法 将中成药粉碎成细粉,然后用培养液配制成系列溶液,对斑马鱼胚胎进行培养,分别在24、48、72 h进行显微观察并记录形态变化、死亡胚胎数目和畸形胚胎数目.结果 4种对斑马鱼胚胎的发育均具有明显的毒性,其中妇乐颗粒和妇炎净胶囊则显示出潜在致畸性,可导致斑马鱼胚胎的心脏或尾部水肿,LC50分别为0.743 mg· mL-1和5.23 mg· mL-1,EC50分别为0.484 mg· mL-1和3.77 mg· mL-1.结论 4种中成药对斑马鱼胚胎发育具有一定的毒性,斑马鱼模型可用于中成药对胚胎发育毒性影响的研究.
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基于斑马鱼模型评价微量淫羊藿苷和朝藿定B的抗骨质疏松活性
目的 本实验利用泼尼松龙诱导的斑马鱼骨质疏松模型评价微量淫羊藿苷和朝藿定B抗斑马鱼骨质疏松的作用.方法 将受精后4d的斑马鱼幼鱼暴露在含25 μmol·L-1泼尼松龙的不同浓度淫羊藿苷(0.2、1、5和10μmol·L-1)和朝藿定B(0.2、1、5和10 μmol· L-1),同时设25μmol· L-1泼尼松龙模型药物组,含25 μmol·L-1泼尼松龙的15 μg· mL-1依替膦酸二钠阳性药物组,0.5％二甲基亚砜溶媒对照组和培养基阴性对照组.28.5℃下在24孔板中培养,每天换液至第9天处死.采用茜素红对培养9d的各组斑马鱼幼鱼骨骼染色,并以显微检测、数码成像方法定量分析骨骼染色区域.结果 与二甲基亚砜溶媒和培养基阴性对照组相比,25 μmol·L-1泼尼松龙模型组的斑马鱼头部骨骼染色面积和染色光密度值显著减少;与模型组比较,15 μg· mL-1依替膦酸二钠能增加斑马鱼头骨矿化量并有效防止泼尼松龙诱导斑马鱼产生的骨质疏松;与模型组比较,10和5 μmol· L-1的淫羊藿苷和1 μmol· L-1朝藿定B都能显著提高斑马鱼头部骨骼的染色面积和染色累积光密度值,提示淫羊藿苷和朝藿定B能防止泼尼松龙诱导的斑马鱼骨质疏松.结论 斑马鱼骨质疏松模型具简单、高效、化合物用量少及可操作性强的优势,成功用于评价微量淫羊藿苷和朝藿定B的抗骨质疏松活性.
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白杨素在模式生物斑马鱼中的代谢研究
目的 采用模式生物斑马鱼研究白杨素的代谢,探索斑马鱼用于研究药物Ⅱ相代谢的可行性及合理性.方法 将斑马鱼暴露于白杨素溶液中,定时取鱼体及药液,采用高效液相色谱-电喷雾质谱联用检测,根据正、负离子模式准分子离子峰获得化合物相对分子质量信息,通过与文献数据或对照品对照,推测代谢产物.结果 在斑马鱼体内或体外药液检测到白杨素原形及其2个单羟基葡萄糖醛酸结合物和1个单羟基硫酸结合物.结论 斑马鱼对白杨素的代谢与白杨素已有体内、体外的Ⅱ相代谢机制高度一致,提示斑马鱼用于药物Ⅱ相代谢具合理性,更具有化合物用量少、成本低、方法简单、高效的优势,为建立一种模式的、生物的在体药物代谢新模型提供重要参考价值.
关键词： 斑马鱼 白杨素 代谢 高效液相色谱-电喷雾质谱 -
半枝莲化学成分及抑制血管生成活性的研究
目的 研究半枝莲的化学成分及其抑制血管生成活性.方法 采用硅胶柱色谱、sephadex LH - 20凝胶柱色谱分离纯化化合物,运用理化反应和波谱分析鉴定化合物的结构 采用斑马鱼抑制血管生成模型测试化合物的活性.结果 从半枝莲体积分数75％乙醇提取物中的乙酸乙酯萃取部分中分离得到了9个化合物,分别为:汉黄芩素,4'-羟基汉黄芩素,芹菜素,黄芩素,柚皮素,木樨草素,异鼠李素,野黄芩苷,黄芩苷,其中异鼠李素有明显的抑制血管生成活性.结论 抑制血管生成是半枝莲抗肿瘤作用的途径之一.
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黄芪多糖对斑马鱼发育及与衰老相关基因表达的影响
目的 研究黄芪多糖抗衰老的作用机制.方法 β-半乳糖苷酶( SA -β-gal)及吖啶橙(AO)的荧光染色分析黄芪多糖对斑马鱼胚胎细胞衰老及凋亡的影响；RT-PCR检测与衰老相关基因的表达.结果 当黄芪多糖质量浓度为0.25 mg·mL -1时,可以延缓斑马鱼细胞凋亡；增强斑马鱼端粒酶基因(TERT)基因的表达,降低bax、p21、p53基因的表达.结论 黄芪多糖具有改善细胞复制性衰老的作用,其分子机制可能与上调TERT和下调p21、p53和bax基因的表达,从而起到一定的抗衰老作用.
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色谱捕获联合斑马鱼模型高效筛选补骨脂抗骨质疏松活性成分
目的 采用色谱捕获联合斑马鱼模型高效筛选补骨脂抗骨质疏松活性成分.方法 用高效液相色谱分析捕获补骨脂香豆素类、黄酮类及补骨脂酚等成分/组分,用25 μmol·L-1泼尼松龙诱导的斑马鱼骨质疏松模型评价捕获的成分/组分、补骨脂素和异补骨脂素的活性,同时设25 μmol·L-1泼尼松龙模型药物组,0.4％二甲基亚砜(DMSO)培养基对照组.采用茜素红对培养至8 dpf的各组斑马鱼幼鱼骨骼染色,进行显微检测、数码成像,并用图像软件定量分析骨骼染色区域.结果 补骨脂香豆素类和黄酮类均具显著的抗泼尼松龙诱导斑马鱼骨丢失作用,但补骨脂酚作用较弱,且毒性较大,高剂量可致斑马鱼全部死亡.结论 高效液相色谱可系统分析、任意捕获补骨脂成分/组分,斑马鱼骨质疏松模型可在体评价捕获的量微成分/组分,二者有机结合同时突破了中药复杂成分获取与在体高效评价的双重瓶颈,有望实现中药全成分抗骨质疏松成分/组分的高效筛选.
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健脾益气摄血方及其拆方对辛伐他汀诱导斑马鱼脑出血的防治作用研究
目的 探索健脾益气摄血方及其拆方对辛伐他汀诱导斑马鱼脑出血模型的防治效果.方法 将660尾受精后1 d(1 dpf)黑色素等位基因突变型Albino品系斑马鱼随机分为正常对照组、模型对照组和实验药物A、B、C、D组及其分别下设100、250、500、750、1000 mg/L不同浓度组,每组斑马鱼30尾.实验过程在严格盲态下进行,同时加入不同浓度的实验药物A、B、C、D和0.5 mol/L辛伐他汀处理斑马鱼24 h,每组选取20尾斑马鱼镜下观察出血情况,拍照、观察斑马鱼脑出血尾数和出血发生率(S)计算出血减少率.结果 ①健脾方100、250、500、750 mg/L浓度组出血发生率分别为75％、70％、60％和70％.②健脾益气方100、250、500 mg/L浓度组出血发生率分别为60％、40％和85％.③健脾益气生血方100、250 mg/L浓度组出血发生率分别为50％和45％;出血减少率分别为29％和36％.④健脾益气摄血方100、250、500 mg/L浓度组出血发生率分别为35％、25％、45％;出血减少率分别为50％、64％和36％.结论 健脾方和健脾益气方对辛伐他汀诱导斑马鱼脑出血无防治效果;健脾益气生血方与健脾益气摄血方显示有良好防治效果,但高浓度具有毒性.
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基于 CRISPR／Cas9研究 RFX6对斑马鱼胰腺发育的影响
目的：构建RFX6基因敲除斑马鱼动物模型及初步探究RFX6对斑马鱼胰腺发育的影响。方法应用CRISPR／Cas9技术，设计针对靶点的gRNA，诱导靶点突变，经测序鉴定得到突变体。结果成功构建了RFX6基因敲除斑马鱼动物模型，初步研究发现RFX6纯合突变体生长发育迟滞、体型瘦小、呈现糖尿病消瘦体型并且不能产生后代。结论 RFX6在斑马鱼胰腺的发育中占据重要地位，是控制斑马鱼胰腺发育的关键因子。
关键词： 基因敲除 CRISPR/Cas9 斑马鱼 胰腺发育 RFX6 -
β位淀粉样前体蛋白裂解酶2基因敲除斑马鱼动物模型的构建及其初步应用
目的：构建β位淀粉样前体蛋白裂解酶2（β-site APP-cleaving enzyme 2，BACE2）基因敲除斑马鱼动物模型并及其初步探索其应用。方法运用CRISPRC／as 9技术，在斑马鱼中设计针对靶点的gRNA，使之诱导靶点突变，经测序鉴定得到突变体。结果BACE2纯合突变体在早期部分无法存活， RT-PCR结果显示B AC E2基因在斑马鱼的早期发育中持续表达。结论 BACE2基因敲除的斑马鱼动物模型将为进一步研究BACE2基因在斑马鱼胰腺发育中的作用和针对糖尿病的药物靶点筛选提供有效工具。
关键词： 基因敲除 CRISPRC/as 9 斑马鱼 β位淀粉样前体蛋白裂解酶2 -
斑马鱼模型评价5种中药肝脏毒性
目的 研究壮骨关节丸、益肾乌发口服液、牛黄解毒片、雷公藤多苷和柴胡皂苷D对斑马鱼的肝脏毒性,并验证斑马鱼模型用于中药肝毒性快速评价的实用性,为临床用药提供依据.方法 受精后3 d(3dpf)斑马鱼分别用不同浓度的中药处理2d后,在显微镜下拍照分析,观察斑马鱼肝变性、肝脏形态学变化和卵黄囊吸收情况.结果 与对照组相比,壮骨关节丸处理后的斑马鱼肝脏肿大,肝脏变性明显,卵黄囊吸收延迟;益肾乌发口服液致肝脏萎缩,肝脏变性明显,卵黄囊吸收显著延迟;牛黄解毒片致肝脏萎缩,卵黄囊吸收显著延迟;雷公藤多苷和柴胡皂苷D致肝脏肿大,斑马鱼卵黄囊吸收均显著延迟.结论 壮骨关节丸、益肾乌发口服液、牛黄解毒片、雷公藤多苷和柴胡皂苷D对斑马鱼幼鱼具有不同程度的肝脏毒性.斑马鱼模型评价中药肝脏毒性具有较好的预测性.
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以斑马鱼模型评价6种药物的神经毒性
目的 以斑马鱼为模式生物,评价6种已知对人类具有神经毒药物吗替麦考酚酯、异烟肼、环孢素A、卡马西平、苯妥英钠和乙醇对斑马鱼的神经毒性.方法 挑选受精后5 d (5 dpf)的野生型AB系斑马鱼在含吗替麦考酚酯(4.5、15、45和51μmol/L)、异烟肼(1 460、4 866、14 599和15 328 μmol/L)、卡马西平(17.5、58.3、175和187μmol/L)、苯妥英钠(16.7、55.7、167和185μmol/L)、乙醇(0.18％、0.63％、1.81％和2.0％)、环孢素A(5、16.7和50 μmol/L)的养鱼用水中暴露,实验过程中不做换液处理,24 h后,利用斑马鱼行为分析仪检测斑马鱼的总运动距离,评价6种药物对斑马鱼运动活力的影响;受精后1 d(1 dpf)的运动神经元转基因斑马鱼胚胎在含吗替麦考酚酯(0.15、0.5、1.5和5.5 μmol/L)、异烟肼(10 971、36 596、109 708和111 825μmol/L)、卡马西平(45.9、153、459和484μmol/L)、苯妥英钠(200、667和2000 μmol/L)、乙醇(0.19％、0.62％、1.86％和1.98％)、环孢素A(5、16.7和50μmol/L)的养鱼用水中暴露,实验过程中不做换液处理,48 h后,在荧光显微镜下拍照,分析统计斑马鱼次级运动神经元轴突的长度,评价6种药物对斑马鱼运动神经元轴突生长的影响.结果 吗替麦考酚酯、乙醇、卡马西平暴露后,随着浓度增加,斑马鱼运动距离先增加后减少,产生典型剂量依赖性倒“U”型运动;异烟肼和苯妥英钠暴露后,随着浓度增加,对斑马鱼运动活力抑制作用逐渐增强;环孢素A暴露后,随着浓度增加,斑马鱼产生兴奋性,斑马鱼总运动距离逐渐增加;6种药物作用后,斑马鱼运动神经元轴突长度均变短,表明6种药物在实验剂量下均能抑制运动神经元轴突的生长.结论 斑马鱼模型可用于初步评价药物神经毒性.
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实验用斑马鱼的质量控制研究——不同健康状况实验鱼的毒性实验比较
结论 在96 h的实验周期中,健康斑马鱼的K2Cr2O7 24 h-LC50为323.38 mg/L,Metlaomyl 96 h-LC50为4.91 mg/L;病鱼K2Cr2O724 h-LC50为302.55 mg/L,Methomyl 96 h-LC50 为3.04 mg/L.说明两种斑马鱼虽然都符合K2Cr2O7 24 h-LC50在200～400mg/L之间的实验用鱼质控要求,但两种健康状态的鱼对于同一化学污染压力下的96 h-LC50却有较显著差异.
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四个近交系斑马鱼微卫星多态性研究
目的 研究微卫星DNA多态性在四个近交系实验用斑马鱼遗传监测中的应用.方法 选取斑马鱼不同染色体上的3个微卫星位点,应用PCR技术对常用的4种近交系(AB,TU,WIK,LF)斑马鱼进行了微卫星DNA多态性分析.结果 3个微卫星DNA具有稳定扩增效果在不同品系之间表现显著多态性.结论 运用所筛选的3个位点进行微卫星多态性分析,能够快速、经济地对AB,TU,WIK,LF四种品系斑马鱼进行遗传监测.
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实验用斑马鱼主要疾病及其实验动物标准化研究过程面临的主要问题
斑马鱼是目前国际上用于实验研究广的鱼类,但是鱼类实验动物尚未实现实验动物的标准化,甚至还没有国家或地方统一的技术标准.本研究收集、分析整理了实验用斑马鱼的主要疾病以及培育饲养实验用斑马鱼所面临的生物净化问题的资料及数据,为我国鱼类实验动物标准的制订和标准化鱼种群的建立及其质量控制与评价提供技术依据.
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斑马鱼分枝杆菌病的研究概况
斑马鱼作为一种常用的实验模式生物,在生物学和医学的许多研究领域得到了广泛应用.然而,国内外对于其病害的研究极少.分枝杆菌病是实验斑马鱼的常见病,危害大,约占其总病例数的20%.斑马鱼对分枝杆菌具有天然的敏感性,因此该菌对实验斑马鱼构成了巨大的威胁,影响了许多重要的科学实验.本文从病原的种类,生物学特性,疾病的症状,诊断方法和病原检测技术以及控制等方面对斑马鱼的分支杆菌病进行了介绍,希望能引起人们足够的重视,并能积极的展开相关研究.
