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人肝细胞核因子4基因 Ⅱ 型启动子的双向转录调控的特性
目的 探讨人肝细胞核因子4α基因Ⅱ型启动子(hHNF4α-P2)双向调控基因表达的作用.方法 克隆hHNF4α-P2–23~–1291(1268 bp)序列;构建由该段正、反序列驱动的荧光蛋白真核表达载体;将其通过细胞转染和显微注射导入细胞或斑马鱼体内,考察其表达的时空特性.通过DNA缺失实验和序列预测分析寻找hHNF4α-P2的正、反向核心启动序列.结果 hHNF4α-P2的正向和反向DNA序列(–23~–1291)均可驱动其下游报告基因在人正常肝细胞L02及肝癌细胞Huh7中表达;在斑马鱼体内正向启动子驱动的红色荧光蛋白基因可在耳石、嗅泡和神经丘等感觉器官中高表达,在肝区可见较弱的红色荧光.反向启动子驱动的绿色荧光蛋白基因可在血细胞、神经细胞、体节及脊索等组织表达.该启动子正链存在一段核心序列,反链存在两段核心序列.结论 首次发现hHNF4α-P2的 –23~–1291序列具有双向调控基因在不同组织表达的功能.
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HCV非结构蛋白NS5A基因的斑马鱼肝脏表达模型
目的 建立HCV非结构蛋白NS5A基因在斑马鱼肝脏特异表达的模型,研究HCV NS5A的体内作用机制并初步探讨HCV NS5A对肝病理标志基因表达的影响.方法 克隆肝基因表达调控序列——斑马鱼脂肪酸结合蛋白基因增强子序列(eFABP)和HCV非结构蛋白基因NS5A序列,利用CMV启动子序列,构建HCV NS5A基因和报告基因绿色荧光蛋白基因eGFP在肝脏共表达的基因构件pFC-5AiR.经细胞转染实验验证所建构件的报告基因DsRed表达红色荧光蛋白后,将该基因构件线性化并经显微注射导入斑马鱼胚胎;通过荧光显微镜观察和整体原位杂交技术对目的基因NSSA的表达进行定位,验证其肝脏特异性表达.采用RT-PCR方法和western blot方法对HCV NS5A基因的转录和翻译水平进行检测;并检测肝脏病理相关的标志基因的转录水平变化.结果 细胞转染实验证明基因构件pFC-5AiR的报告基因DsRed能够在肝癌细胞Huh7中表达;斑马鱼胚胎注射该基因构件后在肝脏能够观察到红色荧光蛋白基因DsRed的表达;RT-PCR和western blot结果显示HCV基因NS5A能够在斑马鱼体内正确表达;原位杂交结果进一步证明了NS5A的表达集中在斑马鱼肝脏内.进一步RT-PCR检测表明HCV NS5A在斑马鱼体内的表达可导致一些肝代谢和纤维化相关基因的上调,如Adiponectin、LDLR、Argsyn、TGF-β和HMGR等,推测NS5A在肝脏脂肪病变和纤维化中具有一定作用.结论 成功建立了斑马鱼肝脏表达HCV NS5A的模型;初步数据表明HCV NS5A在斑马鱼体内的表达与部分肝代谢和纤维化标志基因的异常表达相关;该模型可以用于HCV NS5A的体内病理机制的研究.
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黏着斑激酶与肿瘤
黏着斑激酶(FAK)初是在1992年被发现的,因其定位于整合素簇集的部位即黏着斑,故命名为之[1].FAK属非受体酪氨酸激酶家族中的FAK/PTK2亚家族,该亚家族仅有两个成员:FAK(PTK2)和PYK2(PTK2B).FAK在哺乳动物以及低等真核生物如果蝇、斑马鱼等的大多数组织及细胞类型中都有表达,且其序列在进化上具有保守性性[2],而PYK2表达具有一定的组织特异性.
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Periostin在恶性肿瘤发生发展过程中的作用
Periostin又被称为成骨细胞特异性因子-2，初从小鼠的成骨细胞系MC3T3-E1中分离［1］。 Periostin作为细胞黏附蛋白能够促进成骨，此后其同源基因在人类及斑马鱼上也被克隆［2-3］。Periostin在骨外膜、软骨膜、牙周膜、肌肉筋膜、软骨关节面以及关节韧带中高表达。因此，Periostin被认为在形成和维持上述机械应力持续存在的组织中发挥了重要作用［4］。此外，也有研究证实了Periostin的表达与心脏的发育和心脏疾病密切相关［5-6］。近，有许多研究报道了Periostin在多种人类恶性肿瘤的细胞系以及肿瘤实体中高表达。本文将Periostin在恶性肿瘤中的作用综述如下。
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药物处理对失眠症斑马鱼睡眠的影响以及相关作用机制
目的 观察药物处理对失眠症斑马鱼睡眠的改善作用,并探讨银杏叶滴丸(GBP)对γ-氨基丁酸A型受体α1亚单位(GABRA1)和褪黑素受体1类亚型(MTNR1)mRNA表达的影响.方法 采用咖啡因诱导活体斑马鱼建立失眠模型,分别水溶给予GBP(低剂量组56μg/mL、中剂量组167μg/mL、高剂量组500μg/mL)、金纳多(Ginaton,低剂量组56μg/mL、中剂量组167μg/mL、高剂量组500μg/mL)和氯化锂(阳性对照组,500μM),同时设置正常对照组和失眠组,应用行为分析仪定量斑马鱼处于失眠状态的时间,评价GBP对斑马鱼睡眠的改善作用.另取失眠模型斑马鱼,水溶给予GBP 56、167、500μg/mL,同时设置正常对照组和失眠组,采用RT-PCR检测GABRA1和MTNR1 mRNA的相对表达量.结果 在观察的1 h(3600 s)内,失眠组斑马鱼失眠时间多于正常对照组,(1598±277)svs.(1240±129)s,差异有统计学意义(P<0.01).阳性对照组斑马鱼失眠时间为(1368±170)s,少于失眠组,差异有统计学意义(P<0.05).低剂量、中剂量、高剂量的GBP对睡眠的改善作用分别为72%、95%和97%.低剂量、中剂量、高剂量的Ginaton对睡眠的改善作用分别为78%、80%和95%.与正常对照组比较,GBP低剂量组GABRA1 mRNA相对表达量降低,差异有统计学意义(P<0.01);失眠组、GBP中剂量组和高剂量组无明显变化,差异无统计学意义(P均>0.05);与失眠组比较,GBP低剂量组GABRA1 mRNA相对表达量降低,差异有统计学意义(P<0.01).MTNR1 mRNA相对表达量:与正常对照组比较,失眠组、GBP低剂量组和高剂量组降低,差异有统计学意义(P均<0.01),GBP中剂量组无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05);与失眠组比较,GBP低剂量组、中剂量组和高剂量组均升高,差异有统计学意义(P均<0.01).结论 低、中、高浓度银杏叶滴丸和金纳多对失眠症斑马鱼睡眠均有显著改善作用;银杏叶滴丸改善睡眠的可能机制为抑制GABRA1的表达和改善MTNR1的表达.
关键词： 斑马鱼 失眠 抑郁 γ-氨基丁酸A型受体 褪黑素受体 -
新型小分子有望治疗致心律失常性心肌病
近日，来自哈佛医学院的Angeliki Asimaki等在对一种罕见的遗传性心脏病--致心律失常性心肌病（ACM）的斑马鱼模型研究中发现，一种新型的小分子可减轻该疾病的某些特性，在此之前研究人员已筛选了成千上万个相关的化合物。该结果2014年6月在线发表在JAMA杂志上。
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以斑马鱼为模式动物研究铁调素在骨质疏松中的作用
骨质疏松是一种骨代谢异常，成骨、破骨功能失衡所致的全身性疾病，骨质疏松常见于绝经后女性，而绝经后10年的女性往往会出现铁蓄积，所以将铁蓄积与骨质疏松症联系起来的研究越来越多。铁调素（ hepcidin ）作为调节机体铁稳态的一类抗菌多肽被人们重视，铁调素的相关研究有了越来越多的研究报道：围绕铁蓄积与骨代谢，铁调素与铁蓄积，基因突变与铁调素等。斑马鱼作为骨质疏松模式动物的优势，铁调素基因在斑马鱼中的研究进展颇多。目前铁调素在传统模式动物的研究已经开展，但对于斑马鱼中的铁调素研究较少，本综述旨在拓展了斑马鱼作为模式动物研究铁调素的认识。
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斑马鱼疾病模型
斑马鱼基因组与人类基因组具有高度同源性，作为一种新型的实验动物，已在相关生物研究中广泛应用，用斑马鱼复制的疾病模型在人类疾病研究中起重要作用。本文就斑马鱼在骨骼、心脏、神经系统和肿瘤等方面研究中的作用进行综述。
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铁蓄积对斑马鱼幼鱼骨发育的影响
目的 通过对斑马鱼受精卵进行高铁环境干预,观察铁积蓄对斑马鱼幼鱼骨代谢的影响,探讨铁蓄积对于骨代谢的影响.方法 不同浓度的枸橼酸铁铵(ferric ammonium citrate,FAC) (25、50、100、200 mg/L)干预野生斑马鱼交配,收集鱼卵置于4个含相应FAC浓度的水环境中,每24小时予以更换含同样浓度FAC的水1次,同时设不含FAC为对照组,观察斑马鱼在不同铁环境下生存的情况.于第4天采用实时荧光定量聚合酶链反应(fluorescent quantification-polymerase chain reaction,FQ-PCR)法检测相关成骨代谢的基因表达,比较和对照组基因组的成骨下游基因的差异,并测量幼鱼的铁含量及铁染色,观察铁含量变化;于第9天进行茜素红染色,比较与对照组的硬骨形态差异.结果 不同浓度FAC处理后,斑马鱼骨矿化面积成剂量依赖性降低,其中200 mg/L FAC组与对照组对比T值为40.567(P＜0.01);FQ-PCT结果显示:相关早期表达成骨代谢的基因表达量与对照组斑马鱼成骨基因表达相比显著下调,差异有统计学意义(P＜0.05);铁染色结果显示:FAC组斑马鱼色素沉着变深,与对照组相比,100和200 mg/L两组的幼鱼铁含量升高[(21.5±3.4) μg/Lvs.(12.5±3.6)tμg/L,(22.8±2.9) μg/Lvs.(12.5±3.6) μg/L],差异有统计学意义(P＜0.05);茜素红染色结果显示:与对照组相比,FAC组硬骨染色变浅且肋骨及尾鳍未发育.结论 高铁环境下造成斑马鱼体内铁蓄积,使斑马鱼成骨基因降低,造成骨发育迟缓,矿化障碍.
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膜铁转运蛋白1突变斑马鱼骨形态及骨钙素的变化
目的 观察膜铁转运蛋白1(ferroportin1,FPN1)突变斑马鱼(铁过载动物模型)骨发育及骨量变化,初步了解铁过载状况对骨代谢的影响.方法分别对受精后36和48 h的突变体(weh)和野生型(WT)斑马鱼进行邻联茴香胺血液染色,观察weh及WT血红蛋白量的变化,比较铁过载状况;对受精后第14天的weh和WT进行阿尔辛蓝/茜素红染色,比较骨形态差异;分别提取受精后第5天和第7天的weh和WT总RNA,采用实时定量PCR方法检测骨钙素(BGP)的基因表达,比较骨代谢差异.结果 邻联茴香胺血液染色后,与WT相比,weh在受精后36 h未能着色,48 h后轻微着色;对受精后第14天斑马鱼进行阿尔辛蓝/茜素红染色并与WT比较结果显示,weh茜素红着色较浅且肋骨及尾鳍未发育;与WT相比,受精后第5天和第7天weh骨钙素表达量较低(P＜0.05).结论 FPN1突变斑马鱼体内铁代谢异常,同时骨量减低,骨发育迟缓.
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高铁环境对斑马鱼骨形成的影响
目的 观察高铁环境对斑马鱼骨形成的影响,探讨铁过载对骨代谢影响的机制.方法 以受精后第2天斑马鱼幼鱼为模型,用不同浓度枸橼酸铁铵(FAC)(0、25、50、100、200 μg/mL)干预斑马鱼,受精第6天进行茜素红染色并统计骨矿化面积.在200 μg/mL FAC干预6 d基础上,停止添加FAC,加入100 μmol/L 去铁胺(DFO),第10天行茜素红染色,统计斑马鱼椎体个数,并用实时定量PCR方法检测骨钙素(BGP)基因表达变化.结果 不同浓度FAC处理后,斑马鱼骨矿化面积成剂量依赖性降低,100及200 μg/mL FAC组与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05);100 μmol/L DFO加入200 μg/mL FAC干预组后,斑马鱼椎体个数较未加入DFO组增加,但仍低于对照组(P＜0.05);加入100 μmol/L DFO组骨钙素 (BGP) 表达量较未加入DFO组上调,差异有统计学意义(P＜0.05),但仍低于正常对照组(P＜0.05).结论 高铁环境抑制斑马鱼骨形成.
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桃红四物汤对泼尼松诱导斑马鱼骨质疏松的治疗作用
目的 利用泼尼松诱导的斑马鱼骨质疏松模型评价中药复方桃红四物汤的抗骨质疏松的作用.方法 选择发育正常的3 dpf斑马鱼胚胎,用10 μg/mL泼尼松处理建立斑马鱼骨质疏松症模型,加入不同浓度(50、150和450 μg/mL)的中药复方桃红四物汤.同时设置正常对照组、模型对照组和阳性对照药依替膦酸二钠组.4d后,用0.2％钙黄绿素进行染色,在体视荧光显微镜下观察,拍照并计算斑马鱼脊椎骨的荧光强度.结果 与正常对照组相比,泼尼松处理的模型对照组的斑马鱼脊椎骨荧光强度显著减少;与模型对照组比较,依替膦酸二钠能增加斑马鱼脊椎骨矿化量并有效防止泼尼松龙诱导斑马鱼产生的骨质疏松;与模型对照组比较,450 μg/mL浓度的桃红四物汤能显著提高斑马鱼脊椎骨骨骼的荧光强度,而50 μg/mL和150 μg/mL浓度的桃红四物汤溶液组效果均不明显.结论 桃红四物汤对斑马鱼的大耐药浓度MTC为450 μg/mL,并对泼尼松诱导的斑马鱼骨质疏松模型有明显的改善治疗作用.
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斑马鱼动物模型在骨骼疾病研究中的应用现状分析
本综述对新型模式动物斑马鱼模型在骨骼疾病研究中的应用现状做出分析和评价.从中英文数据库中筛选文献,就胚胎斑马鱼和成年斑马鱼两种模型的应用情况、个体特征与研究优势、不足方面展开综述.文献筛选共纳入107篇文献,大体分类包括骨质疏松方向、骨代谢方向、骨发育方向、骨再生与修复方向、药物筛选方向等;涉及胚胎斑马鱼文献88篇,成年斑马鱼文献26篇.其中胚胎斑马鱼模型多用于骨组织的发育、活体染色、建立特异性转基因品系与突变体基因筛选及高通量药物筛选等方面;成年斑马鱼被应用于骨质疏松、骨再生与修复较多.斑马鱼独特的结构与生理,为骨骼疾病的研究提供了一种全新的、高效而灵活的动物模型,并且能为研究中医中药提供一种重要的模型.
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PCB77暴露致胚胎发育异常斑马鱼分离病原菌分布与耐药性分析
目的 本研究分析多氯联苯(PCB77)暴露致胚胎发育异常斑马鱼分离病原菌分布及耐药性,为相关研究提供参考.方法 对本课题组养殖的40条斑马鱼进行研究,20条进行PCB77暴露,20条作为对照组;对PCB77暴露致胚胎发育异常斑马鱼感染病原菌进行分析,用灭菌的棉拭子采集感染部位及周围组织脓状样本获得培养物,全自动微生物鉴定分析仪对病原菌进行鉴定分型,药敏纸片分析分离病原菌的抗菌药物敏感性,并分析感染斑马鱼体内斑马鱼otu基因(Z-OTU)及Culin4蛋白(CUL4)和血清淀粉样蛋白A(SAA)蛋白的表达;以未暴露PCB77斑马鱼和PCB77暴露致胚胎发育异常但未感染病原菌斑马鱼为对照.结果 256株病原菌中革兰阳性菌120株占46.9％,革兰阴性菌136株占53.1％;分离的革兰阳性菌对多数抗菌药物均有耐药性,但对青霉素、氨苄青霉素和诺氟沙星较敏感,革兰阴性菌对多数抗菌药物均有耐药性,但对青霉素、氨苄青霉素和多黏菌素较敏感;感染后体内胚胎发育相关蛋白Z-OTU和CUL4及SAA蛋白表达降低,且与对照组及未感染组相比有统计学差异(P＜0.05).结论 PCB77暴露致胚胎发育异常斑马鱼易受病原菌感染,且能引起胚胎发育相关蛋白Z-OTU和CUL4及SAA蛋白表达异常.
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二维电泳分析胎儿酒精综合征斑马鱼模型蛋白表达谱
目的 利用二维电泳分析乙醇诱导斑马鱼胚胎发育畸形的可能分子机制.方法 采用400 mmol/L乙醇在斑马鱼胚胎圆顶期处理3 h,观察乙醇导致的斑马鱼胚胎发育畸形;通过二维凝胶电泳分析受精卵期、圆顶期、胚盾期和5-体节期的胚胎总蛋白,采用差减分析法减少母源性蛋白的干扰,比较5一体节期正常对照组和乙醇处理组斑马鱼胚胎蛋白表达谱的改变;通过原位杂交验证二维电泳的分析结果.结果 400 mmol/L乙醇处理导致62%的胚胎产生体轴发育障碍和60%的胚胎产生独眼畸形.二维电泳分析结果显示,400 mmol/L乙醇处理会导致受精后12 h(12 hours post fertilization,12 hpf)斑马鱼胚胎胶原蛋白2a1和TAR DNA结合蛋白表达分别下调81%和73%.随后原位杂交显示,胶原蛋白2a1在乙醇处理组胚胎体轴的表达明显下调;24 hpf乙醇处理胚胎胶原蛋白2a1在胚胎体轴的表达水平逐渐恢复正常,但神经管结构受到严重影响.结论 乙醇处理后斑马鱼胚胎发育畸形可能是由于乙醇干扰了胚胎发育过程中胶原蛋白2a1和TAR DNA结合蛋白的表达;其中乙醇对胶原蛋白2a1在轴中胚层早期表达的干扰,可能是导致发育后期体轴和神经管畸形的重要原因.
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视黄醛脱氢酶2抑制剂对斑马鱼胚胎心脏发育的影响
目的 利用新型模式生物斑马鱼,采用外源性视黄醛脱氢酶2抑制剂--对二乙氨基苯甲醛(4-diethylaminobenzaldehyde,DEAB),建立维甲酸(retinoic acid,RA)缺乏的斑马鱼模型,探讨其对斑马鱼胚胎心脏发育的影响. 方法 在斑马鱼胚胎受精后5、8、10.3 h,分别用1×10~(-6),5×10~(-6)、10×10~(-6),25×10~(-6) mol/L的DEAB处理,在解剖显微镜下实时观察胚胎发育的全过程,在受精后5 h给予1×10~(-9) mol/L外源性RA干预,观察其对DEAB致畸的拮抗作用.通过胚胎心脏表型观察、心率和心室收缩分数比较以及心脏特异分子标记--心房利钠肽A基因整体原位杂交实验分析RA缺乏对胚胎心脏发育的影响. 结果 外源性DEAB处理后,胚胎生存率随着处理浓度增加而降低,随着处理时间点后移而升高.当DEAB浓度≥5×10~(-6) mol/L时,斑马鱼畸胎率为100%,异常表型一致,并能被1×10~(-9),mol/L外源性RA有效援救.RA缺乏时斑马鱼心脏表现出管状心脏、无向右环化或环化不完全、房室分化异常及房室管区血液反流.与野生型胚胎相比,DEAB处理后斑马鱼胚胎心率和心室收缩分数降低,心房利钠肽A基因表达改变,在心室部位表达清晰强烈,在心房部位表达明显减弱. 结论 DEAB影响胚胎发育有剂量依赖性和时效性,其致畸作用能被外源性RA有效拮抗.RA缺乏影响心脏早期发育的多个重要环节,导致心脏收缩功能受损.心脏心房利钠肽A基因表达受RA信号调控.
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乙醇对斑马鱼胚胎发育中心脏环化的影响
2006年12月至2007年2月,我们采用不同乙醇浓度,处理不同发育时期的斑马鱼胚胎,以探讨乙醇对斑马鱼胚胎心脏发育的影响,从而为研究先天性心脏病的发病机制提供重要线索.
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注意缺陷多动障碍关联基因蛛毒素受体基因3对斑马鱼发育早期行为学的影响
目的 初步建立注意缺陷多动障碍(attention-deficit/hyperactivity disorder,ADHD)易患基因蛛毒素受体基因3 (latrophilin-3,LPHN3)的斑马鱼幼鱼疾病模型,分析lphn3.1基因活性降低对斑马鱼行为的影响.方法 使用标准条件下饲养的TU品系斑马鱼,单胞期显微注射lphn3.1基因的吗啡啉反义寡核苷酸(antisense morpholino oligonucleotides,MO),建立lphn3.1吗啡啉基因敲低组(MO组,白天n=116,夜间n=81)及其错配对照,即lphn3.1对照组(CO组,白天n=109,夜间n=79).通过实时定量荧光聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR)检测MO的基因表达水平;使用斑马鱼行为轨迹跟踪系统记录受精后6d的幼鱼白天和夜间的行为,包括15 min游泳的距离、游泳时间、游泳速度及游泳过程中身体活动幅度.结果 MO组lphn3.1基因表达较CO组明显降低.白天行为学结果显示MO组较CO组游泳距离更远[(2511±1230) mm与(1791±1156)mm,t=4.52,P＜0.01],游泳速度更快[3.67 (1.38) mm/s与3.22(1.13) mm/s,Z=2.35,P=0.019],游泳时间更长[752(320)s与556(447)s,Z=4.38,P＜0.01],大、中、小幅摆动频率更高(Z=3.81～5.37,均P＜0.01);夜间MO组较CO组游泳距离更远[709(1097) mm与336(1057) mm,Z=2.56,P=0.010]、游泳时间更长[415(525)s与166(459)s,Z=2.69,P＜0.01],大、中、小幅摆动频率更高(Z=2.37～3.01,P＜0.05或P＜0.01).结论 lphn3.1基因活性降低能引起斑马鱼幼鱼的多动冲动行为.
关键词： 注意力缺陷障碍伴多动 斑马鱼 表型 蛛毒素受体基因3 -
斑马鱼内耳感觉上皮分离术
目的 探索斑马鱼内耳感觉上皮的分离方法,为采用斑马鱼作为内耳发育及疾病研究的动物模型提供技术手段.方法 取4个月龄斑马鱼进行内耳组织冰冻切片,HE染色确定内耳感觉囊斑部位,并行免疫荧光染色观察毛细胞纤毛.在解剖显微镜下将斑马鱼内耳椭圆囊、球囊及听壶完整分离,取出内耳感觉囊斑平铺于载玻片中,进行免疫荧光染色,观察内耳感觉囊斑铺片的形态结构.结果 冰冻切片证实斑马鱼内耳感觉上皮位于囊斑内,并与耳石相对应.以耳石为标志分离出完整的内耳感觉囊斑组织,铺片免疫荧光染色后可观察到内耳感觉上皮形态结构完整,毛细胞纤毛显示清晰.结论 通过内耳感觉囊斑铺片技术可以完整分离出斑马鱼的内耳感觉上皮组织.
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顺铂损伤后幼年斑马鱼侧线毛细胞STAT3的表达及意义
目的：建立斑马鱼侧线神经丘的顺铂损伤模型，检测STAT3基因的表达情况，探讨其在毛细胞顺铂损伤过程中所发挥的作用，为抗顺铂耳毒性的研究提供理论依据。方法将受精后5天的斑马鱼幼鱼利用250μM顺铂溶液浸泡3小时建模，通过Yo-pro-1荧光染色、TUNEL染色了解毛细胞损伤情况，利用RT-qPCR、原位杂交等技术检测STAT3基因的表达改变。结果使用250μM顺铂溶液浸泡斑马鱼幼鱼3小时，可使其侧线神经丘毛细胞数降低（P＜0.001），可诱导侧线神经丘出现细胞凋亡（P＜0.001），且在此过程中，STAT3基因的表达出现上升（P＜0.001）。结论STAT3在顺铂对斑马鱼侧线神经丘毛细胞的损伤过程中可能与毛细胞凋亡相关并扮演一定角色。STAT3表达的升高与细胞凋亡的升高同时发生，表明STAT3在一定条件下可能存在促凋亡的作用。
