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组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA对树突状细胞成熟的影响及其机制
目的:本研究探讨新型组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA (Suberoylanilide hydroxamic acid)对健康人外周血单个核细胞(PBMNC)来源树突状细胞(DC)成熟的影响及其机制.方法:PBMNC取自健康志愿者的外周血,经贴壁处理后培养于含100 ng/ml rhGM-CSF、500 U/ml rhIL-4的RPMI 1640完全培养液中,用脂多糖(LPS)刺激经SAHA处理和未经处理的DC为实验组,并将不经LPS和SAHA处理的细胞设为对照组,在倒置显微镜下观察各组细胞形态学改变;流式细胞术检测各组DC表面抗原的表达情况;采用混合淋巴细胞培养法(MLC)观察各组DC对同种异体T淋巴细胞的刺激作用;应用凝胶电泳迁移变动测定法(EMSA)检测各组DC NF-κB通路的活化情况.结果:SAHA能够有效抑制LPS诱导的DC成熟,主要表现在经SAHA+ LPS处理的DC具有未成熟DC的形态学特征;经SAHA+ LPS处理组和对照组的DC表面抗原CD80、CD83、HLA-DR的表达量均低于单用LPS组(P＜0.01);SAHA+ LPS处理组和对照组的DC刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力明显低于单用LPS刺激组(P＜0.01);电泳迁移变动检测(EMSA)实验结果提示,SAHA+ LPS处理的DC NF-κB活性显著下降.结论:SAHA能够有效抑制DC的成熟和对异基因T淋巴细胞的刺激作用,该作用与SAHA抑制DC NF-κB信号通路活化有关.
关键词： 组蛋白去乙酰化酶抑制剂 SAHA 树突状细胞 NF-κB -
B7-1与B7-2对调节人IL-2基因的转录因子NF-κB和AP-1的相同作用
为了解B7共刺激对细胞因子,特别是对IL-2 mRNA及转录因子NF-κB出和AP-1的影响,探讨B7介导的IL-2调节的分子机制,在异基因混合淋巴细胞反应(MLR)体系中分别或联合加入抗B7-1、抗B7-2单克隆抗体和CTLA-4 Ig以阻断B7/CD28信号传导,通过竞争性PCR定量检测其对IL-2和IL-4 mRNA的影响,并初步测定IFN-γ mRNA的改变,同时用转染MHCⅡ类分子及联合转染等量B7-1或B7-2的NIH3T3转基因细胞tDR7,tDR7/B7-1和tDR7/B7-2刺激CD28+T细胞,通过DNA-蛋白结合实验观察B7对IL-2转录因子NF-出和AP-1的影响.结果表明:抗B7-2单抗和CTLA-4 Ig可明显抑制B7介导的IL-2和IL-4 mRNA合成,而抗B7-1单抗仅有轻度抑制作用,2种或3种抗体联合应用时抑制作用相加.MLR 1-6小时,单独tDR7即可诱导NF-κB的表达,联合转染B7早期对其结合活力无明显影响,6小时后tDR7诱导作用减弱,B7却可显著延长tDR7的诱导作用至72小时.tDR7早期同样可诱导AP-1的表达,联合转染B7分子在24小时内对其有一定的抑制作用,而在反应后期可延长tDR7对AP-1的上调作用,B7-1与B7-2间作用未见明显不同.结论:B7通过减少IL-2 mRNA降解和影响基因转录而上调IL-2分泌,并可同时影响多种细胞因子分泌;在转录水平B7-1与B7-2作用未见明显不同,提示两者的功能差异可能与细胞表达和时间动力学不同有关.详细了解B7介导的T细胞免疫耐受的分子机制有助于设计更好的临床方案预防移植排斥和GVHD.
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Ad5F35嵌合腺病毒载体介导的突变性IκBα对白血病细胞凋亡的诱导作用
多种不同类型的白血病均存在持续活化的核转录因子κB(NF-κB),而抑制NF-κB活化诱导细胞凋亡有可能成为治疗白血病新的方法.本研究探讨修饰的5型腺病毒载体即Ad5F35嵌合腺病毒载体(Ad5F35 Vec)介导的突变性IκBα(IκBαDN)对白血病细胞调亡的作用.将携带缺失5'端1-70个氨基酸编码序列的人IκBαAd5F35-IκBαDN Vec转染HL-60)细胞.采用流式细胞术、DNA结合试验、实时定量PCR和Westem blot技术分别检测细胞凋亡、NF-κB DNA结合活性、IκBα,cIAP-2和xLAP的表达.结果显示,转染48小时后,转染Ad5F35-IκBαDN Vec细胞、空白载体Ad5F35-EGFP Vec细胞以及未转染细胞的凋亡率分别为(22.53±2.999)%,(6.08±2.464)%和(4.86±1.366)%,其差异具有显著意义(Ad5F35-IκBαDN Vec vs未转染:p<0.001;Ad5F35-IκBαDN Vec vs Ad5F35-EGFP Vec;p<0.001,p<0.002).同时,NF-κB DNA结合活性降低,IκBα表达增加,但cIAP-2和xIAP mRNA的表达降低.结论:Ad5F35 Ve'能够有效介导IκBαDN cDNA在HL-60细胞的表达,IκBαDN可抑制HL-60细胞NF-κB DNA结合活性并诱导其凋亡.
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Bay 11-7082增强Fas介导的HL-60细胞凋亡作用
本研究观察NF-κB抑制剂Bay 11-7082对HL-60细胞Fas/FasL系统的作用及对Fas介导的HL-60细胞凋亡的影响.用RT-PCR和流式细胞术检测Bay 11-7082干预后HL-60细胞Fas、FasL和XIAP的mRNA和蛋白表达水平的变化;用ELISA方法检测Bay 11-7082干预前后sFasL水平的变化;流式细胞术检测Bay 11-7082干预前后CH-11(活性Fas抗体)诱导HL-60细胞凋亡的变化.结果表明:用Bay 11-7082干预后,HL-60细胞FasL和XIAP的mRNA和蛋白水平较对照组明显下降,差异具有显著性(p＜0.05),Fas的mRNA、蛋白水平的变化和sFasL水平的变化无显著的差异(p＞0.05);Bay 11-7082干预后HL-60细胞对CH-11诱导细胞凋亡敏感性显著增强.结论:Bay 11-7082可能通过下调FasL和XIAP水平增强HL-60细胞Fas介导的凋亡.
关键词： Bay 11-7082 Fas/FasL系统 HL-60 NF-κB -
硼替佐米诱导Burkitt淋巴瘤Raji细胞凋亡的研究
本研究探讨硼替佐米对Burkitt淋巴瘤Raji细胞是否具有凋亡诱导作用及其机制.以硼替佐米处理Raji细胞,观察细胞增殖抑制作用的时间效应和剂量效应,在光学显微镜下观察药物作用前后细胞的形态变化,用流式细胞术检测药物孵育前后细胞凋亡率(AP),用RT-PCR法检测药物孵育前后NF-κB和p53基因的表达水平.结果表明,在一定剂量和时间范围内硼替佐米能抑制Raji细胞生长;硼替佐米能诱导Raji细胞凋亡并显示时间和剂量效应;在硼替佐米诱导Raji细胞凋亡过程中,NF-κB及p53基因的表达水平下调.结论:硼替佐米能诱导Raji细胞凋亡,NF-κB基因和p53基因很可能参与了硼替佐米诱导Raji细胞凋亡的调控.
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白血病细胞中NF-κB调控MDR1基因、P糖蛋白及逆转耐药的研究
本研究探讨NF-κB调控的血液肿瘤细胞抗凋亡机制中是否有mdrl的参与,并通过对NF-κB的抑制希望获得血液肿瘤的耐药逆转,为难治性白血病的治疗探索一条新的道路.取不同终浓度的NF-κB抑制剂PDTC作用的,或者同一浓度作用不同时间后的K562/A02细胞,分别用免疫组织化学加计算机图像分析仪方法半定量检测每1份样本中NF-κB的活性和P-gp的表达,以及用反转录多聚酶链反应方法半定量检测每2份样本中mdrl的活性,通过统计学来分析mdr1、P-gP的表达是否与NF-κB的活化有关.结果表明:随着NF-κB抑制剂PDTC作用浓度的不断升高、作用时间的不断延长,K562/A02细胞NF-κB/p65的表达不断降低,P-gP和mdrl mRNA的表达也逐渐降低,而且三因子之间均有显著相关性.结论:通过对K562/A02细胞高表达的NF-κB的抑制可降低该细胞的mdrlmRNA和P-gP的表达,从而提高血液肿瘤细胞的放化疗敏感性.
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全身照射小鼠脾脏T细胞NF-κB活性的改变
核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)作为重要的核转录因子,可与多种基因的启动子或增强子特定区域结合而广泛参与多种基因表达的调控[1].全身照射(total body irradi-ation,TBI)是骨髓移植前预处理的方案之一.本研究以8.0Gy全身照射小鼠为骨髓移植前放疗预处理模型,观察脾脏T细胞内NF-κB的活性改变,从核因子水平阐明TBI对脾脏T细胞的影响.
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存活蛋白和NF-κB在外周T细胞性淋巴瘤中的表达和意义
本研究旨在探讨存活蛋白和NF-κB在外用T细胞性淋巴瘤中的表达及意义.应用免疫组织化学法检测26例外周T细胞性淋巴瘤组织中存活蛋白和NF-κB的表达,30例良性淋巴组织反应增生被选作对照组.结果发现,外周T细胞性淋巴瘤患者中有21例存活蛋白表达阳性,阳性率为80.8%;17例NF-κB表达阳性,阳性率为65.4%.与对照组相比,具有显著性差异(p＜0.01).实验组中,存活蛋白阳性率与NF-κB阳性率呈正相关.结论:存活蛋白和NF-κB在外周T细胞性淋巴瘤组织中广泛表达,对肿瘤细胞的促增殖和抑凋亡发挥着重要的作用.
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蛋白酶体抑制剂诱导多发性骨髓瘤RPMI8226细胞凋亡及对Notch 1和NF-κB表达的影响
多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)的发生、发展与骨髓微环境关系密切,有多种信号通路参与.Notch信号是造血微环境调节造血细胞增殖分化的重要信号通路,其中Notch 1与血液肿瘤的发生、发展较为密切.骨髓瘤是高度依赖NF-κB的恶性肿瘤,后者与肿瘤细胞的发生和转移、增殖和凋亡、耐药相关.已证实NF-κB2家族是Notch信号通路-的一个靶基因.蛋白酶体抑制剂Bortezomib已获美国FDA批准用于治疗难治及复发多发性骨髓瘤,但其诱导骨髓瘤细胞凋亡的机制尚未完全明确.本研究探讨bortezomib诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡和对Notch 1、NF-κB表达水平的影响,采用透射电子显微镜检、流式细胞术及原位缺口末端标记技术观察药物对MM细胞凋亡的影响,用RT-PCR法和免疫荧光细胞化学染色分析分别检测细胞凋亡时Notch 1及NF-κB的表达情况.结果表明:RPMl8226细胞高表达Notch 1和NF-κB;随着bortezomib作用浓度的增高,RPMI8226细胞出现典型的凋亡改变,Notch 1的表达逐渐降低,NF-κB在胞核表达减少,胞浆表达增多.这种改变在浓度升高到一定数值时与对照相比具有显著性差异(P＜0.05).结论:bortezomib治疗多发性骨髓瘤机制中有Notch 1和NF-κB两条通路的参与,二者可能存在一定的联系,提示Notch 1信号可能作为MM治疗的潜在靶点,为相关新药的研发提供一定实验基础.
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抑制NAMPT表达增强K562细胞对伊马替尼的敏感性及相关机制研究
本研究探讨烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)对K562细胞(人慢性髓系白血病细胞株)对伊马替尼敏感性的影响及其相关机制.在体外合成针对NAMPT基因的小干扰RNA(siRNA),转染K562细胞株.将转染后的K562细胞经1μmol/L伊马替尼作用48 h后,采用PI/Calcein染色方法测定细胞存活率；经不同浓度伊马替尼作用48h后,采用MTS法测定细胞增殖活性,计算半数抑制浓度(IC50).未经转染的K562细胞经1μmol/L伊马替尼作用3 -48 h后,采用Western blot方法检测NAMPT表达的变化.通过对NCBI GEO中基因表达数据的挖掘分析及Western blot方法检测,探讨NAMPT-siRNA和伊马替尼对凋亡相关基因表达的影响.采用荧光素酶报告基因技术,研究NAMPT-siRNA、伊马替尼对NF-κB转录活性的影响.结果表明,1μmol/L伊马替尼作用于K562细胞48h对NAMPT表达无明显影响.NAMPT-siRNA能够明显抑制K562细胞NAMPT的表达,再经1μmol/L伊马替尼作用后,NAMPT-siRNA干扰组细胞存活率明显降低(P＜0.05),提示抑制NAMPT表达能增强K562细胞对伊马替尼的敏感性.不同浓度伊马替尼作用后,干扰组IC50值明显降低(P＜0.05)；拟合增殖曲线在0.01 - 0.1 μmol/L伊马替尼浓度范围内斜率增大,提示在此范围内NAMPT-siRNA与伊马替尼的协同作用强.基因表达谱分析及Western blot验证结果都显示,NAMPT-siRNA和伊马替尼处理均可下调NF-κB下游因子抗凋亡基因Bcl-2表达水平,两者同时作用时效果更明显.NAMPT-siRNA及伊马替尼均能降低NF-κB转录活性,两者同时作用效果更显著.结论:伊马替尼可能并非通过调节NAMPT表达影响细胞存活；抑制NAMPT表达能增强K562细胞对伊马替尼的敏感性,可能与抑制NF-κB及其下游因子Bcl-2有关.
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蛋白酶体抑制剂MG-132诱导L1210细胞凋亡及其机制研究
为了观察蛋白酶体抑制剂MG-132对淋巴细胞白血病细胞株L1210的致凋亡作用.探讨MG-132的致凋亡机制,分别以不同浓度的蛋白酶体抑制剂MG-132处理L1210细胞,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞活力,应用Annexin-V和PI双染色细胞流式细胞术检测细胞凋亡率,比色法测定细胞中caspase 3的活性,采用Westernblot法检测细胞NF-κB P65核蛋白的表达.结果表明:在相同的作用时间下,随着MG-132浓度的增高(0、2.5、5、10、加μmol/L),细胞增殖抑制率、凋亡率、caspase 3活性逐渐升高;Western-blot法检测显示,细胞NF-κB P65核蛋白表达水平降低.结论:蛋白酶体抑制剂能够诱导L1210细胞凋亡,其机制可能是通过下调NF-κB的表达,进一步活化caspase 3的活性而诱导凋亡.
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红景天苷调节人成骨肉瘤细胞MG63成骨分化及相关信号的研究
目的：探讨红景天苷对人成骨肉瘤细胞株 MG63诱导成骨分化作用及相关分子机制。方法 MTT 法测定不同浓度红景天苷对 MG63细胞增殖活力的影响；PNPP 法检测经红景天苷处理后成骨性标志物--碱性磷酸酶活性的变化；RT-PCR 检测细胞内 bmp2 mRNA 水平的变化；Western blot 及流式细胞术检测给药前后细胞内 BMP2、IκBα蛋白表达水平的变化。结果红景天苷能显著促进 MG63细胞的增殖并上调其ALP 活性，其对ALP 活性的上调呈现一定的时间和剂量依赖性，其中在5μmol/L、48 h 条件下表现出佳效果，证明红景天苷具有促成骨分化作用。此外，红景天苷能显著上调细胞内 bmp2 mRNA 及蛋白表达水平，并能时间依赖性激活 IκBα，抑制 NF-κB 活性。结论红景天苷能促进人成骨肉瘤细胞成骨分化，具有潜在的骨代谢调节作用，其作用机制可能与抑制 NF-κB 活性并激活 BMP2信号通路有关。
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核转录因子及炎性趋化因子在阿尔茨海默病患者脑组织中的改变
目的 探讨核转录因子(NF) -κBp65、炎性趋化因子单核细胞趋化蛋白1(MCP-1/CCL-2)、巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1 α/CCL-3)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)等在阿尔茨海默病(AD)发病中的改变。方法 选择尸体解剖后的10例AD患者及8例对照脑组织，用免疫组织化学EnVision方法检测海马、大脑额叶及颞叶皮质中NF-κBp65、MCP-1、MIP-1α、GFAP和Aβ1-42的表达。结果 与对照组相比，AD患者脑组织海马、额叶和颞叶皮质等部位均显示神经细胞中NF-κBp65[每高倍视野(×400)阳性细胞数分别为3.6±1.5、2.2±1.2和2.2±1.2]表达较对照组（每高倍视野阳性细胞数分别为0.31±0.20、0.25±0.20和0.25±0.20）明显增高(P＜0.05)；MCP-1及MIP-1α在海马、额叶和颞叶皮质等部位神经细胞中（每高倍视野阳性细胞数分别为8.0±1.3、8.8±1.0、9.3±1.4；及8.1±1.5、12.5±1.1、6.4±1.1）表达均较对照组（每高倍视野阳性细胞数分别为4.5±0.9、4.5±0.6、4.0±1.8；及5.0±1.9、6.3±2.2、3.8±1.5）明显增多(P＜0.05)；GFAP显示的星形胶质细胞数增多(P＜0.05)，并大量聚集在老年斑周围。相关系数分析表明，在AD脑组织中MCP-1、MIP-1α蛋白水平与NF-κBp65的改变有关。结论 AD脑组织中核转录因子及炎性趋化因子表达升高，NF-κBp65可能调节MCP-1和MIP-1α的表达，其机制可能与Aβ引起的炎性作用有关。
关键词： 阿尔茨海默病 NF-κB 趋化因子CCL2 巨噬细胞炎性蛋白质1 -
乳腺癌中KiSS-1与核因子-κBp50和基质金属蛋白酶9的表达之相互关系及其临床病理意义
目的 探讨KiSS-1、核因子(NF)-κBp50和基质金属蛋白酶9(MMP-9)在乳腺癌组织中的表达和相互关系及其临床病理意义.方法 应用免疫组织化学EliVision法检测152例标本(乳腺癌92例,乳腺增生30例,癌旁乳腺30例)和伴有癌转移的腋窝淋巴结54枚中KiSS-1、NF-κBp50及MMP-9蛋白表达情况.应用原位杂交方法检测50例乳腺癌组织、20例癌旁乳腺组织中KiSS-1mRNA的表达.应用CMIAS真彩图像分析仪对免疫组织化学和原位杂交结果进行积分吸光度(IA)值测定,并计算其平均IA值.结果 (1)与癌旁乳腺组织表达比较,KiSS-1基因在乳腺癌组织学分级Ⅰ～Ⅱ级中(13.59±6.24)明显高于Ⅲ级(9.53±4.57)、TNM分期高(Ⅰ～Ⅱ期12.35±6.15,Ⅲ～Ⅳ期7.53±4.93)、在淋巴结转移率高的乳腺癌中的表达减弱(9.61±5.25,无转移组为13.06±5.89)甚至缺失;其在淋巴结转移灶(3.47±1.59)中的表达(IA值)明显低于其相应的原发灶(10.02±3.80).乳腺癌组织中KiSS-1 mRNA表达(10.84±4.90)与KiSS-1蛋白表达(11.67±6.22)有较好的一致性.(2)NF-κBp50、MMP-9在乳腺癌组织中表达上调,其上调程度随着乳腺癌分化程度的降低、TNM分期的增加、淋巴结转移及瘤块增大而逐渐增高.结论 KiSS-1蛋白在乳腺癌分化程度低、淋巴结转移组中的表达下降,并分别与NF-κBp50、MMP-9蛋白表达呈负相关;NF-κBp50与MMP-9蛋白在乳腺癌中表达呈正相关,KiSS-1蛋白可能参与了乳腺癌的转移扩散.
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胃癌组织中Cyr61和核因子-κB的表达与转移及预后的关系
目的 检测胃癌组织中富含半胱氨酸肝素结合蛋白61(Cyr61)和核因子-κB(NF-κB)的表达及其与临床病理特征及预后的关系.方法 应用逆转录聚合酶链反应技术验证和检测53例胃癌组织与11例非肿瘤胃黏膜中Cyr61基因的表达,并用免疫组织化学方法 (SP法)检测99例胃癌组织与25例非肿瘤胃黏膜中cyr61与NF-κB蛋白的表达情况.结果 胃癌原发灶和转移灶中Cyr61mRNA的阳性表达率分别为84.6%(22/26)、88.9%(24/27),明显高于非肿瘤胃黏膜组5/11(P值均＜0.05).非肿瘤胃黏膜、原发癌与转移癌组的基因表达量(2-△Ct)分别为(2.76±5.50)×10-5、(14.61±20.64)×10-5、(18.46±26.38)×10-5.胃癌原发灶、转移灶Cyr61 mRNA均高于非肿瘤胃黏膜(P值均＜0.05),转移灶与原发灶比较,差异无统计学意义(P＞0.05).99例胃癌中Cyr61及NF-κB蛋白的高表达率分别为56.6%(56/99)和55.6%(55/99),其表达水平与肿瘤浸润深度、脉管侵犯、淋巴结转移、远处转移及TNM分期呈正相关(P值均＜0.05),NF-κB还与肿瘤大小呈正相关(P＜0.05);Cyr61蛋白的表达水平与NF-κB呈正相关(P＜0.05);Cyr61与NF-κB蛋白高表达的病例平均生存时间和5年生存率明显低于低表达的病例(P值均＜0.05).结论 Cyr61和NF-κB阳性表达与胃癌的侵袭、转移密切相关,检测Cyr61和NF-κB的表达可作为判断胃癌生物学行为的重要参考指标.
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Syk基因对乳腺癌血管内皮生长因子-C表达的调控作用
目的 研究Syk基因对乳腺癌血管内皮生长因子(VEGF)-C表达的调控机制.方法 采用免疫组织化学(EnVision法)检测乳腺癌组织中Syk、NFκB与VEGF-C的蛋白表达情况,分析三者的相关性及与淋巴转移的关系.转染pcDNA3.1(-)-Syk至乳腺癌MDA-MB-231细胞,检测对VEGF-C和NFκB表达的影响.结果 在淋巴转移组中,Syk蛋白阳性率低于非淋巴转移组,VEGF-C与NFκB阳性率在淋巴转移组高于非淋巴转移组.Syk蛋白表达与NFκB(r=-0.448,P=0.002)、VEGF-C(r=-0.620,P=0.000)蛋白表达呈负相关,VEGF-C与NFκB呈正相关(r =0.310,P=0.036).转染pcDNA3.1(-)-Syk重组质粒的乳腺癌细胞中VEGF-C的mRNA及蛋白表达水平均低于空白对照组,细胞核NFκB蛋白表达低于空白对照组(均P＜0.05).结论 Syk基因与乳腺癌转移相关,可能是通过抑制NFκB的活性而下调VEGF-C的表达,从而抑制乳腺癌的淋巴转移.
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核因子-κB/IκB信号通路介导实验性肾炎肾组织中单核细胞趋化蛋白-1表达
目的探讨核因子-κB(NF-κB)/IκB信号通路在肾毒血清性肾炎肾组织单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)表达中的作用.方法肾毒血清肾炎应用兔抗鼠肾小球基底膜肾毒血清制备.应用凝胶电泳迁移率(EMSA)和Western印迹检测肾毒血清肾炎大鼠肾组织中NF-κB活化、p65亚基核转位以及IκBα和IκBβ的降解;采用免疫组织化学及核酸酶保护法检测肾组织中MCP-1表达,并分析其与NF-κB活化的关系.结果模型组肾小球及肾小管中MCP-1表达分别为(24.37±7.06)个/肾小球横切面和(54.78±11.49)%,较正常对照组显著升高(P<0.01);肾组织中NF-κB活化显著增强,p65由胞质转移至胞核,胞质内IκBα和IκBβ降解明显增加;NF-κB活化与MCP-1表达呈显著正相关.结论 NF-κB/IκB信号通路介导肾小球肾炎肾组织中MCP-1表达.
关键词： NF-κB 肾小球肾炎 单核细胞化学吸引蛋白质1 信号传导 -
血管紧张素Ⅱ对人内皮细胞转录因子NF-κB的激活机制及其对血小板源生长因子B链基因转录的影响
目的研究血管紧张素Ⅱ对ECV304细胞中转录因子NF-κB的作用和对血小板源生长因子B链(PDGF-B)基因表达的影响.方法采用电泳迁移率移动分析法(EMSA),免疫组织化学方法,共聚焦显微镜及金颗粒标记免疫电镜技术;荧光素酶报告基因与变异型激酶质粒共转染的方法及Northern印迹法研究血管紧张素Ⅱ激活ECV304细胞NF-κB的信号传递路径和检测了血管紧张素Ⅱ刺激前后ECV304细胞PDGF-B mRNA的表达水平.结果血管紧张素Ⅱ刺激后,在ECV304细胞内有NF-κB的激活及核易位过程,应用免疫荧光共聚焦显微镜,免疫电镜及Northern 印迹等方法均可观察到PDGF-B或其基因表达增高.变异型激酶质粒IKKα-KM,IKKβ-KM及NIK-Km可抑制经血管紧张素Ⅱ刺激的转染细胞内与NF-κB启动相连的荧光素酶的表达.结论血管紧张素Ⅱ可激活胞质内NF-κB并出现核易位,激酶NIK、IKKα和IKKβ参与了此信号传递路径.血管紧张素Ⅱ刺激后PDGF-B链mRNA水平增高.
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高胆固醇血症大鼠主动脉内皮细胞NF-κB的激活和血小板源生长因子B链的表达
目的验证体外培养的内皮细胞经轻微修饰低密度脂蛋白(mm-LDL)刺激后激活细胞核因子κB(NF-κB)的现象可否同样在高胆固醇血症大鼠主动脉内皮细胞内出现并促进血小板源生长因子B链(PDGF-B)的表达,以及年龄对NF-κB-PDGF-B信号传导通路的影响.方法胃饲高胆固醇乳剂建立高胆固醇血症大鼠模型,免疫组织化学染色法[链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)法]明确主动脉内皮细胞NF-κB激活后发生核转位的情况;应用原位杂交技术观察内皮细胞PDGF-B mRNA的表达,同时应用免疫组织化学染色法(SP法)观察内皮细胞合成PDGF-B链的情况.结果与对照组相比,胃饲高胆固醇乳剂6周后,2个月龄大鼠出现高胆固醇血症,主动脉内皮细胞NF-κB核转位的比例明显增加,PDGF-B mRNA的表达也增多.10个月龄对照组Wistar大鼠的主动脉内皮细胞几乎不表达PDGF-B mRNA,摄入高胆固醇乳剂16周后,内皮细胞表达PDGF-B mRNA明显增多.较之摄入胆固醇同时期的2个月龄大鼠,NF-κB的核转位及内皮细胞PDGF-B链的合成均增多(0.461±0.075比0.350 ±0.094;0.230±0.040比0.185±0.037),其差异有显著性意义(P<0.05;P<0.001).结论高胆固醇血症能激活大鼠主动脉内皮细胞的NF-κB,使核转位增多并促进内皮细胞表达PDGF-B.这一现象在10个月龄大鼠中表现得更为明显.
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同型半胱氨酸对单核细胞NF-κB活化及巨噬细胞炎性蛋白-1α表达的影响
目的探讨同型半胱氨酸对体外培养的人单核细胞株THP-1 核因子-κB(NF-κB)、抑制因子(IκB-α)活性的影响及其与巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)表达上调的关系.方法 THP-1单核细胞分别用同型半胱氨酸和NF-κB 抑制剂PDTC预处理后,应用Northern blot和流式细胞术分别检测MIP-1α mRNA和蛋白的表达,并应用Western 蛋白印迹进一步检测核蛋白NF-κB蛋白含量和胞质IκB-α含量.结果与未加任何处理因素的对照组比较,MIP-1α mRNA和蛋白在0.1 mmol/L 同型半胱氨酸处理后明显增加,分别为对照组的3.69倍和1.16倍(P＜0.01),同时NF-κB P65亚基核转位亦增加.而加入100 μmol/L NF-κB抑制剂PDTC预处理30 min后,再用同样浓度的同型半胱氨酸刺激,则MIP-1α mRNA和蛋白表达受到明显的抑制,NF-κB P65核转位增加.单独加入PDTC对MIP-1α mRNA、蛋白表达及NF-κB P65核转位无明显影响.此外,同型半胱氨酸(0.1 mmol/L)处理THP- 1可引起IκB-α蛋白水平显著降低,120 min后有所回升.结论同型半胱氨酸在病理浓度可促进NF-κB活化,发生核转位,进而促进THP-1细胞表达MIP-1α mRNA和蛋白,这种作用与IκB-α蛋白磷酸化降解有关.
