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用探针熔解曲线法检测急性髓细胞白血病 c-kit 基因突变
目的用改良的杂交探针结合溶解曲线新方法检测急性髓性白血病c-kit基因17号外显子上基因突变。方法利用Primer Premier v5.00、Tm Utility v1.3等软件设计引物探针，两个阶段探针分别针对D816、N820和N822等突变热点。取患者DNA样品5μl进行PCR扩增及熔解曲线分析，PCR扩增产物进行测序分析并与熔解曲线分析方法进行比较。结果阳性质粒灵敏度试验的结果显示， N820 G的灵敏度为10％，其余突变灵敏度均能达到5％。12例CBF-AML标本中，5例检测为阳性，突变率为41.7％，测序结果与测序检测结果相符。结论新方法具有方便快速、灵敏度高、特异性好等特点，可用于CBF-AML患者的个体化诊断和治疗。
关键词： 白血病 原癌基因蛋白质C-kit 突变 熔解曲线分析 -
实时荧光PCR熔解曲线法在β-地中海贫血基因诊断和产前诊断中的临床应用评价
目的 对荧光PCR熔解曲线法用于β-地中海贫血(β-地贫)基因诊断和产前诊断进行临床评价.方法 收集2011年1至8月柳州市妇幼保健院外周血标本451份,其中经血液学表型分析为β-地贫阳性表型标本372份,β-地贫阴性表型标本79份.同时收集2011年6至9月夫妇双方经PCR-RDB探针法确诊为β-地贫基因携带者,在我院行β-地贫产前诊断的胎儿绒毛、羊水及脐带血标本共84份,其中孕10～ 13周胎儿绒毛标本16份、孕16 ～24周羊水标本64份、孕17周以上胎儿脐血标本4份.按双盲对照试验,分别采用荧光PCR熔解曲线法(可检测24种β珠蛋白基因突变)、PCR-反向点杂交(RDB)探针法(可检测17种β珠蛋白基因突变)和DNA测序法同时对451份外周血标本和84份胎儿绒毛、羊水、脐带血产前诊断标本进行检测.计算荧光PCR熔解曲线法和PCR-RDB探针法、DNA基因测序法检测结果的野生型符合率、突变型符合率和总符合率.结果 利用荧光熔解曲线法在451份外周血标本中共检出13种突变类型、19种基因型,其中有447份标本与PCR-RDB探针法的基因型检测结果相符,符合率为99.1％ (447/451),902个等位基因位点检出符合率为99.6％(898/902),有4份标本与PCR-RDB探针法的基因型检测结果不相符,经DNA测序法验证,有3份标本与荧光熔解曲线法的检测结果完全一致,1份标本的β珠蛋白基因突变不在荧光熔解曲线法检测范围而未被检出.450份外周血标本的荧光熔解曲线法检测结果与DNA测序法相符,符合率为99.8％ (450/451).利用荧光熔解曲线法在84份产前诊断胎儿标本中共检出8种突变类型、18种基因型,168个等位基因位点的检测结果与PCR-RDB探针法和DNA基因测序法检测结果符合率为100％.结论 荧光PCR熔解曲线法可同时检测多份待测标本,并可准确检出多种基因突变类型,可用于β-地贫的基因诊断和产前诊断.
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基于实时荧光PCR的探针熔解曲线分析技术和反向点杂交技术应用于β-地中海贫血基因诊断与产前诊断的对比研究
目的 评价基于实时荧光PCR的探针熔解曲线分析(PMCA)技术作为β-地中海贫血(β-地贫)基因诊断和产前诊断方法的可行性.方法 收集2008至2010年在珠海市妇幼保健院经过血液学表型筛查初步诊断为轻型β-地贫的血标本119份、重型β-地贫血标本4份和正常血标本12份.此外,收集严重类型β-地贫高风险孕妇的羊水标本44份和脐带血标本8份.采用双盲法,采用PMCA技术和反向点杂交(RDB)技术对上述187份临床标本分别进行β-地贫基因突变检测,并以DNA测序技术作为金标准,对上述两种方法检测β-地贫基因突变的检测性能进行评估.结果 探针熔解曲线分析法除了漏检1例Ini( ATG＞ AGG)/N和1例不能区分为CD43(G ＞T)/N还是CD37(G ＞A)/(N-)外,其余的185份标本的β-地贫基因型均能正确检出；而RDB法有1例CD71-72(+T)/N未正确检出.以DNA测序技术作为金标准,探针熔解曲线分析法检测的敏感度、特异度、阴性预测值、阳性预测值和诊断效率分别为98.75％、100.00％、93.10％、100.00％、98.93％,RDB法分别为99.38％,100.00％、96.42％、100.00％、99.47％；两者间诊断效率的差异无统计学意义(P =0.999).且产前诊断的结果与胎儿出生或引产后血样的基因诊断或产后随访结果完全一致.结论 PMCA技术可作为RDB技术检测中国人群β-地贫基因突变的替代或验证方法.
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高分辨熔解曲线分析技术检测α-地中海贫血常见三种点突变
α-地中海贫血(简称α-地贫)是由于α珠蛋白基因缺失(缺失型)或点突变(非缺失型)导致α珠蛋白肽链合成减少或完全不合成而引起的一种溶血性贫血,呈常染色体隐性遗传.我国长江以南为高发区,其中广西、广东和海南发病率高.新的广东省大样本分子流行病学调查显示,α-地贫携带者频率约为8.53％[1].我国常见的3种缺失型突变为--SEA、-α 3.7和-α4.2,常见的3种非缺失型突变为Hb Constant Spring (Hb CS)、Hb Quong Sze (Hb QS)和Hb Westmead( Hb WS).这3种点突变都位于α2珠蛋白基因第3外显子,由于α2珠蛋白基因比α1珠蛋白基因在珠蛋白合成中具有更重要的功能,因此非缺失型α-地贫突变所引起的功能缺陷往往比缺失型更为严重[2].特别是当合并α0-地贫(即--SEA)时,非缺失型Hb H病的临床表现往往重于缺失型Hb H病[2].因此,在临床实践中,对非缺失型α-地贫的明确诊断亦十分重要.
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高分辨率熔解曲线分析:一种新的用于遗传病基因突变筛查的技术
目前,DNA碱基变异如突变或单核苷酸多态性(single nucleotide polymorplaism,SNP)的检测方法有2种:一是针对特定的位点合成序列特异性探针,如Taqman探针法、位点特异寡核苷酸分析、反向斑点杂交及基因芯片等,用于检测已知突变;二是以核酸的物理性质为基础的检测方法,如变性一高效液相层析、单链构象多态性、变性梯度凝胶电泳、温度梯度凝胶电泳及构象敏感凝胶电泳等,此类方法可用作突变筛查,但无法明确突变性质.
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荧光标记探针检测叶酸代谢相关SNP用于多种样本免提取方法的建立
目的 建立叶酸代谢关键酶基因3个SNP位点的荧光标记探针多重检测方法.方法 针对MTHFR基因C677T和A1298C以及MTRR基因A66G 3个SNP位点所在序列设计扩增引物和荧光标记探针.采用探针熔解曲线分析技术,通过熔解曲线Tm值区分特定位点的不同基因型.结果 本研究建立的荧光标记探针多重检测方法,能在单管中同时对3个SNP位点的野生、突变以及杂合基因型进行清晰准确的分型.该方法在抽提DNA样本、口腔拭子以及滤纸血痕样本中均进行了优化和验证.结论 成功的建立起了一种特异性强、灵敏度高、操作简便、检测结果准确稳定、通量较高、结果易判读、适用于多种临床样本类型的叶酸代谢相关SNP检测方法.可以对育龄妇女的叶酸个体化补充进行临床指导,对叶酸代谢异常所引起的多种新生儿疾病、心脑血管疾病的预防具有重要意义.
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基于单标记探针实时荧光定量PCR和熔解曲线分析方法定量检测HBeAg阳性患者前C区变异株
目的 建立一种HBV复杂前C区变异株精确定量的检测系统.方法 分两步实时PCR完成检测.首先应用野生株阻断探针(WT-blocker probe)进行选择性抑制野生株病毒的扩增,而含量偏低的变异株病毒得以扩增约10 000倍,使其在后续反应中易于检出;第二步应用单标记探针(SimpleProbe)结合熔解曲线分析系统精确定量检测前C区G1896A、G1899A、G1896A/G1899A变异株.通过PBPPO(primer-blocker-probe partial-overlap)设计减少基因多态性对检测的影响,来提高检测精确度.检验结果经直接测序及聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析方法予以证实.结果 4种标准质粒(G1896/G1899、G1896A、G1899A、G1896A/G1899A)能够很好地被检出并予以区分,突变检测灵敏度达到0.01%;10例HBeAg阳性(直接测序法鉴定前C区变异阴性)患者血清标本中,每例至少1种前C区变异株被检出.结论 单标记探针实时荧光定量PCR和熔解曲线分析能够早期灵敏检测前C区变异株,前C区变异株进化过程及机制还需进一步大样本、纵向队列研究予以阐明.
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高分辨率熔解曲线分析应用于结直肠肿瘤分子检测现状
高分辨率熔解曲线分析(HRM)是犹他州大学Wittwer实验室与美国Idaho公司联合研制的一种PCR后闭管操作技术:通过高密度荧光数据采集,直接用熔解曲线检测PCR扩增片段中微小序列差别,它是在常规PCR基础上增加一种饱和染料,无需标记探针.具有低成本、高通量、操作简单、不受变异位置影响[1]等优势.自2003年HRM被引入作为检测基因突变与分型的方法以来,随着HRM的不断完善,HRM的应用如"雨后春笋",层出不穷[2].
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等位基因特异PCR结合熔解曲线分析快速检测线粒体DNA A1555G突变
目的 建立一种线粒体DNA A1555G突变的快速检测方法.方法 以45例线粒体耳聋患者为研究对象,采用等位基因特异PCR结合熔解曲线分析对线粒体DNA A1555G突变位点进行检测,根据得到的熔解曲线分析线粒体DNA A1555G突变.并与PCR产物直接测序法结果进行比较.结果 线粒体DNA A1555G同质性突变时只出现一个峰且峰尖所对应的Tm为(82±0.5)℃;线粒体DNA A1555G未发生突变时只出现一个峰且峰尖所对应的Tm为(79±0.5)℃;线粒体DNA A1555G异质性突变时出现2个峰且各自峰尖所对应的Tm为(82±0.5)℃和(79±0.5)℃.45例样本的检测结果与PCR产物直接测序法的结果符合率达100%.结论 等位基因特异PCR结合熔解曲线分析具有操作简便、结果准确、快速等特点,可作为线粒体DNA A1555G突变检测的常规方法.
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SYBR green Ⅰ结合熔解曲线分析快速检测GSTM1基因多态性
目的建立一种快速检测人类谷胱甘肽S转移酶(GST)基因多态性的方法并初步应用.方法反应体系中加入新型荧光染料SYBR green Ⅰ,应用多重PCR同时扩增GSTM1基因及内参照CYP1A1基因.PCR反应结束后,以0.1℃/s的速度从65℃到95℃检测并记录反应管荧光的变化,根据得到的熔解曲线分析GSTM1基因型.结果GSTM1基因携带型(GSTM1+)熔解曲线出现两个峰带,GSTM1基因空白型(GSTM1-)只出现一个峰带,两峰峰尖所对应的温度值与预期值相同,琼脂糖凝胶电泳显示PCR产物分子量与预期分子量一致.DNA抽提后整个检测在LightCycler扩增仪上1 h内完成.结论SYBR green Ⅰ结合熔解曲线分析是一种简单、快速、准确的分析GSTM1基因多态性的方法.
关键词： SYBR Green Ⅰ 熔解曲线分析 基因 多态性 -
分子信标熔解曲线法分析SLC11A1基因插入/缺失多态性
目的 针对溶质转运蛋白家族11成员1蛋白(SLC11A1)基因插入/缺失多态性位点rs17235416,建立基于荧光定量PCR(qPCR)的分子信标熔解曲线法对其进行基因分型.方法 针对该位点设计特异性的引物和分子信标探针,联合应用非对称qPCR、分子信标探针和熔解曲线分析等技术建立分子信标熔解曲线法进行基因分型.对210份全血样本提取DNA后,用上述方法和改进的PCR-RFLP法对该位点进行检测和分型,并以测序法验证.结果 210份样本的基因型TGTG+/+、TGTG-/-和TGTG+/-分布频率分别为69.5％、4.8％和25.7％.分子信标熔解曲线法和PCR-RFLP法的分型结果与测序结果完全一致.结论 国内外首次成功建立分子信标熔解曲线法检测SLC11A1基因rs17235416位点;该方法在大人群样本检测中具有简便、快速、准确等优点.
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应用McMSP分析Rassfla启动子区域甲基化
目的 应用McMSP分析抑癌基冈Rassfla启动子区域甲基化,同时比较MSP与McMSP之间的异同.方法 (1)对常规甲基特异性PCR(MSP)扩增后的产物进行熔解曲线分析(MCA);(2)将SYBR Green I直接加入PCR反应前体系进行扩增;(3)探索McMSP分析的灵敏度,将标本按1:10、1:100、1:500、1:1 000、1:5 000、1:10 000稀释后,分别行MSP和MeMSP.结果 (1)不应用商业试剂盒同时将SYBR Green I浓度降低,仍能获得较好结果;(2)Q-PCR MCA能将完全甲基化和完全未甲基化DNA标本区分;(3)在将DNA标本1:10 000稀释后(DNA量＜2pg)仍可以检测到所需要的目的产物,而常规MSP在1:100稀释(DNA量＞100pg)时就已不能检测到产物;(4)McMSP区分正常癌旁组织和癌组织的能力较常规MSP大大增强.结论 利用Q-PCR MCA分析Rassfla启动子区域甲基化迅速准确,操作简便,结果以曲线形式给出,具有较常规MSP更高的灵敏度和区分能力.
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单管巢式PCR结合熔解曲线分析检测乙肝病毒YMDD变异
目的:在建立针对乙肝病毒(HBV)聚合酶基因的单管巢式PCR方法的基础上,结合熔解曲线分析,提高HBV YMDD变异检测的灵敏度.方法:针对HBV聚合酶基因段设计两对熔解温度(Tm)差异较大的内、外引物,在一个封闭反应体系中进行二次扩增并结合熔解曲线分析法检测HBV YMDD变异.结果分别与单纯PCR结合熔解曲线分析和测序法进行比较,并对107例未经拉米夫定治疗的慢性乙型肝炎(CHB)患者血清HBV YMDD的自发变异进行分析.结果:建立在单管巢式PCR方法上的熔解曲线分析检测HBV YMDD变异灵敏度要高于单纯PCR结合熔解曲线分析的方法(P＜0.001),与直接测序法的符合率为81.3%.在114例CHB标本中YMDD及其变异检出率为95.6%.用本方法在107例未经拉米夫定治疗的CHB病人中YMDD自发变异检出率为31.8%.结论:单管巢式PCR结合熔解曲线分析法提高了YMDD变异检测的灵敏度,而且是一种简便、特异性较好的方法.
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熔解曲线分析检测临床常见5种革兰阴性菌的方法建立
目的:构建熔解曲线分析法检测5种临床常见革兰阴性病原菌.方法:选取临床常见的大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯杆菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽单胞菌作为目标检测菌种.对目标菌种设计种特异性引物.构建熔解曲线法,并进行特异性验证.检测不同拷贝浓度稀释液进行敏感性分析.检测临床分离目标菌各20株,进行稳定性评价.结果:(1)经预实验后,对Tm值差异较大的铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯杆菌、鲍曼不动杆菌三对引物同时进行熔解曲线分析,对大肠埃希菌、嗜麦芽单胞菌两对引物同时进行熔解曲线分析.(2)特异性验证显示,目标菌种均有特异性的熔解曲线,各自的Tm值依次为88.37、86.32、80.86和87.56、86.32℃.(3)可检测到的拷贝浓度稀释液约为3.0 × 103 copies/mL.(4)稳定性评价的结果显示,Tm值变化范围窄小,差异有统计学意义.结论:所构建的熔解曲线法具有较好的特异性、敏感性和稳定性.
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荧光定量PCR/熔解曲线分析法快速鉴定葡萄球菌菌种
目的:建立一种基于葡萄球菌16～23 s rRNA间隔区序列特征的荧光定量PCR/熔解曲线分析鉴定方法.以快速鉴定葡萄球菌菌种.方法:在葡萄球菌16 s rRNA 3'端和23 srRNA 5'端分别设计上、下游引物,用荧光定量PCR方法扩增各个实验菌株的16～23 s rRNA间隔区序列,然后分析各扩增产物的熔解曲线,以确定各个菌种熔解曲线特征,并以此为依据对15株葡萄球菌临床分离株进行鉴定.结果:设计的引物对成功地扩增了葡萄球菌所有实验菌株,对扩增产物的熔解曲线分析可初步鉴定金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌.以VITEK2鉴定结果为标准,荧光定量PCR/熔解曲线分析法鉴定菌种的准确率为67%(10/15),整个实验可在1 h内完成.结论:荧光定量PCR/熔解曲线分析法有望成为临床实验室快速鉴定葡萄球菌菌种的新方法.
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熔解曲线分析检测大肠埃希菌、嗜麦芽单胞菌方法的构建
目的 构建熔解曲线分析法检测大肠埃希菌、嗜麦芽单胞菌.方法 针对大肠埃希菌的16S rRNA、嗜麦芽单胞菌的促族酶B亚单位(gyrB)基因设计种特异性引物.构建熔解曲线分析法,并进行特异性验证.检测不同拷贝浓度稀释液进行敏感性分析.检测临床分离目标菌各20株,进行稳定性评价.结果 特异性验证显示,目标检测菌种均有特异性的熔解曲线,融点温度(Tm)值分别为84.73、82.84 ℃.可检测到的拷贝浓度稀释液分别为3.56×103、1.21×104 copy/mL.稳定性评价的结果显示,Tm值(±s)变化范围窄小,差异有统计学意义.结论 所构建方法具有较好的特异性、敏感性和稳定性.并具有快速、简便、成本低廉的特点,可用于临床样本的检测.
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熔解曲线分析检测临床常见3种革兰阴性菌的方法建立
目的 构建熔解曲线分析法同时检测临床常见3种革兰阴性病原菌.方法 选取临床常见的铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯杆菌、鲍曼不动杆菌作为本课题研究的检测菌种.对目标菌种设计种特异性引物.构建熔解曲线法,并进行特异性验证.检测不同拷贝浓度稀释液进行敏感性分析.检测临床分离目标菌各20株,进行稳定性评价.结果 (1)特异性验证结果显示,目标菌种均有特异性熔解曲线,Tm值依次为88.37℃; 86.32℃; 80.86℃; (2)敏感性分析结果显示,3种目标菌可检测到的拷贝浓度稀释液依次为:1.34×103拷贝/ml,3.67×103拷贝/ml,3.01×103拷贝/ml； (3)稳定性评价的结果显示,3种目标菌其平均Tm值依次为88.54±0.662; 86.38±0.727；80.12±0.607.结论 所构建的熔解曲线法具有较好的特异性、敏感性和稳定性；并具有快速、简便、成本低廉的特点,可用于临床样本的检测.
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多色探针荧光PCR熔解曲线法在G6PD基因突变检测中的临床应用评价
目的 对多色探针荧光PCR熔解曲线法用于葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症G6PD基因突变检测进行临床评价.方法 收集402份疑似患者或其家系成员的外周血样本(男256例、女146例),先用酶学方法(G6PD/6PGD定量比值法)进行G6PD缺乏症初筛,经基因DNA提取后,按双盲对照试验,分别应用多色探针荧光PCR熔解曲线法(可检测16种G6PD基因突变)和DNA测序法对各样本进行G6PD基因突变检测,比较两种方法基因突变的符合率.结果 酶学检测发现G6PD/6PGD比值＜1.0的样本有170例,G6PD/6PGD比值≥1.0的样本232例.应用DNA测序法检出182例野生型样本,151例半合子突变型样本,5例女性纯合突变型样本,54例女性杂合突变型样本和10例女性复合杂合突变型样本;使用多色探针荧光PCR熔解曲线法检出185例野生型样本,148例半合子突变型样本,5例女性纯合突变型样本,55例女性杂合突变型样本和9例女性复合杂合突变型样本.多色探针荧光PCR熔解曲线法检测G6PD基因突变的特异性为100％(182/182),灵敏度为98.6％(217/220),阳性预测值为99.5％(216/217),阴性预测值为98.4％(182/185),约登指数为0.986,总符合率为99.0％(398/402).多色探针荧光PCR熔解曲线法共检出21种基因型,DNA测序法检出24种基因型.有4例样本与DNA测序法的基因型检测结果不相符,主要原因为这些样本的G6PD基因突变不在多色探针荧光PCR熔解曲线法所设计的检测范围内.结论 荧光PCR熔解曲线用于G6PD基因突变的检测,具有简便、快速、灵敏度高、特异性强等优点,可用于G6PD缺乏症的临床辅助诊断.
关键词： 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症 实时荧光PCR 熔解曲线分析 基因突变 -
熔解曲线分析法用于HPA-15基因分型的研究
目的 探讨熔解曲线分析法用于HPA-15基因分型,了解大连地区汉族人群HPA-15基因多态性.方法 设计合成HPA-15等位基因特异性引物和1条公共引物,其中在2条等位基因特异性引物的5末端分别加入具有不同长度并富含GC碱基的序列.使用这3条引物,进行实时PCR反应.在PCR反应后,进行熔解曲线分析,依据PCR产物熔解温度的差异,进行基因分型.应用熔解曲线分析法和常规PCR-SSP法对100名大连地区汉族人群的血液标本进行HPA-15基因分型.此外对熔解曲线分析法的重复性进行评价.结果 100个血液标本的熔解曲线分析法和常规PCR-SSP法的基因分型结果是完全一致的.10个血标本的2次熔解曲线分析结果是一致的.大连地区汉族人群HPA- 15a、-15b基因频率分别为0.58和0.42.大连地区汉族人群与国内部分地区汉族人群相比,HPA-15等位基因频率的差异无统计学意义(P＞0.05).与新疆维吾尔族人群相比,HPA-15等位基因频率差异有统计学意义(P＜0.05).结论 HPA的熔解曲线基因分型方法具有快速、简单、准确、通量高、重复性好等优点,要优于常规的PCR-SSP法.在国内HPA-15等位基因分布存在着种族差异.
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熔解曲线分析法用于RHD1227G＞A基因分型的实验研究
目的 建立用于RHD 1227G＞A基因分型的熔解曲线分析法.方法 设计合成RHD 1227G＞A等位基因特异性引物和公共引物,并在2条等位基因特异性引物5'端加上不同长度的GC序列.在实时PCR反应后,进行熔解曲线分析,依据PCR产物熔解温度的差异,对RHD 1227G＞A基因分型.将建立的熔解曲线分析法与常规的PCR-SSP法比较.对于2种方法检测结果不符的标本,进行RHD基因第9外显子测序,确定该标本为RHD 1227G＞A基因型.结果 应用熔解曲线分析法对84例标本进行基因分型,其中RHD 1227A+/G-32例,1227A-/G+ 22例,1227A+/G+6例,1227A-/G-24例.发现2例标本熔解曲线法检测的基因型为1227A+/G-,而PCR-SSP法检测结果为1227A +/G+.经基因测序证实这2例标本结果是1227A+/G-.结论 用于RHD 1227G＞A基因分型的熔解曲线法具有操作简单、快速、准确等优点,优于常规的PCR-SSP法.
