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睫状神经营养因子对糖尿病早期大鼠视网膜神经组织的保护作用
目的:研究睫状神经营养因子(ciliary neurontrophic factor,CNTF)对糖尿病早期大鼠视网膜神经组织的保护作用.方法:选择40只健康成年雄性SD大鼠(250g-280g)一次性腹腔注射链脲佐菌素(Streptozotin,STZ) 60mg/kg 诱发糖尿病模型(DM),将DM大鼠随机分组为DM+CNTF组和DM+BSS组.DM+CNTF组给予玻璃体腔内注射CNTF(1.0μg /2μL),DM+BSS组注射BSS液(2μL).分别观测0、4 、8、12wk两组大鼠体质量和血糖变化,于4wk和12wk进行原位细胞调亡(TUNEL法)的检测及视网膜神经组织超微结构的观察.结果:DM+CNTF组大鼠的血糖和体质量与DM+BSS组比较无显著性差异(P>0.05).12wk时TUNEL检测DM+CNTF组大鼠神经节细胞凋亡与DM+BSS组相比减少(P<0.05).透射电镜下观察发现从4wk起两组大鼠视网膜神经组织出现细胞凋亡的改变,经CNTF治疗细胞凋亡改变有所减轻,表现为外节膜盘间隙减小,感光细胞水肿减轻及核染色质浓集减轻等.结论:CNTF对DM+CNTF组和DM+BSS组大鼠的体重及血糖无明显影响.CNTF治疗组结果显示对本实验糖尿病大鼠视网膜神经节细胞及感光细胞有一定保护作用.
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神经营养因子影响视神经夹伤后视网膜GAP-43mRNA表达变化
目的:观察大鼠视神经夹伤后视网膜上GAP-43基因的变化,观察玻璃体腔内注射睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)和腺病毒介导脑源性神经营养因子(adenovirally delivered brain-derived neurotrophic factor,Ad-BDNF)对视网膜上GAP-43mRNA的影响.方法:成年SD大鼠球后2mm处作视神经夹伤模型,经巩膜玻璃体腔内注射微量神经营养因子(neurotraphic factors,NFs),应用原位杂交法观察视网膜的GAP-43mRNA的变化.结果:正常SD大鼠视网膜上仅在节细胞层检测到少数细胞存在GAP-43mRNA杂交信号,对照组和CNTF治疗组视神经夹伤后1wk内可观察到视网膜神经节层中存在较强的GAP-43mRNA杂交信号,伤后2wk时已减弱至伤前,Ad-BDNF治疗组在视神经夹伤后4wk内在视网膜上均能观察到GAP-43mRNA的杂交信号,其中在夹伤后1～2wk时杂交信号相对较强.结论:视神经夹伤能上调视网膜上GAP-43mRNA表达,玻璃体腔内注射Ad-BDNF在伤后4wk内均能上调视网膜上GAP-43mRNA表达.
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不同时间窗吻合大鼠坐骨神经后应用CNTF对脊髓运动神经元内Ca~(2+)的作用
目的:研究睫状神经营养因子(CNTF)对坐骨神经损伤延期手术后对相应脊髓Ca~(2+)作用和脊髓神经损伤的再生修复作用.方法:大鼠双侧坐骨神经切断后延期即刻、3,7,14,21d后行神经外膜端-端吻合术,给予CNTF治疗.吻合术后饲养3 d后处死检测脊髓Ca~(2+)浓度,饲养28 d后处死行Tunel染色凋亡细胞计数、HE染色观察L4-6脊髓神经元形态、神经吻合口部位神经纤维镀银染色形态学观.结果:用药组TUNEL阳性细胞数目比未用药组、盐水组少,用药组在3个大组中凋亡数目少且均与其他3组有统计学差异(P<0.05),用药组7 d凋亡数目较盐水组、非用药组低;Ca~(2+)质量浓度较未用药组、盐水组增幅减低;用药组即刻、3 d、14 d、21d亚组28 d处死时可见部分神经纤维通过吻口,7 d通过吻合门更多,但排列不整齐,而未治疗组和对照组的神经纤维通过吻口数量较治疗组不明显.结论:坐骨神经在不同时间切断吻合后均可诱导脊髓前角运动运动神经元的凋亡;大鼠坐骨神经离断吻合后,不同时间窗吻合术后应用CNTF可以降低急性期脊髓组织Ca~(2+)离子水平,可能起到减少脊髓运动神经元凋亡的发生、保证周围神经轴索冉生数量的作用.
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睫状神经营养因子对大鼠视神经损伤后视觉电生理的影响
目的观察睫状神经生长因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)对视神经损伤后视觉电生理变化的作用.方法采用镊夹视神经法制作大鼠视神经损伤模型,夹伤后立即向球后一次性注射CNTF 50 ng,并于损伤当时和损伤后1,2,3和4 wk时检测夹伤视神经眼的闪光视觉诱发电位(flare-visional evoked potential,F-VEP).结果视神经夹伤后损伤眼F-VEP的P1波振幅(wave amplitude,WA)在1 wk时下降,后回升;峰潜时(wave latency,WL)延长.CNTF组中WA在视神经夹伤后1 wk和2 wk时与对照组相比差异显著(P<0.05),WL仅在视神经夹伤后1 wk时与对照组相比具显著差异(P<0.05).结论视神经损伤后一次性球后注射CNTF在早期加强了神经系统对损伤的反应强度,促进了视神经损伤后神经冲动传导功能的恢复.
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睫状神经营养因子和雪旺细胞神经营养活性物质对大鼠视神经损伤后轴突数的影响
目的观察睫状神经生长因子(ciliary neurotrophic factor, CNTF)和雪旺细胞神经营养活性物质(Schwann cells neurotrophic agent, SCNA)对视神经损伤后轴突的形态和纤维数目变化的作用. 方法采用镊夹法制作大鼠视神经损伤模型,损伤后立即一次性向玻璃体内注射CNTF (50 ng)或SCNA (10 μL),在损伤后1,2,3和4 wk时观察夹伤视神经的形态,及进行图像分析和轴突纤维计数. 结果损伤后视神经轴突减少,间质增多. CNTF组和SCNA组的轴突数密度在1 wk时分别为正常值(0.1065±0.0056个*μm-2)的0.59和0.61,而对照组为0.55,实验组与对照组比较差异显著(P<0.05). 但在夹伤2 wk后3个组间、各时间点间数据差异均不显著(P>0.05). 结论 CNTF及SCNA一次玻璃体给药能在1 wk内减缓视神经损伤后轴突数目的减少.
关键词： 眼损伤 视神经 睫状神经营养因子 雪旺细胞神经营养活性物质 大鼠 -
RP-HPLC法检测CN10蛋白的PEG化修饰率及含量
目的 建立一种简单有效的测定CN10蛋白PEG化修饰率的方法,用于PEG化修饰工艺中的质量控制.方法 采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法,以TSKgel Octadecyl-4PW作为色谱分离柱,以含0.12％三氟乙酸(TFA)、5％乙腈的水溶液作为A相溶液,以含0.1％TFA的乙腈作为B相溶液,在50℃柱温条件采用分段线性洗脱的方式分离蛋白,并考察CN10蛋白以及PEG化修饰后CN10蛋白的量效关系,根据外标法检测CN10和CN10-PEG的蛋白含量,根据PEG化修饰前后CN10蛋白量效关系的变化推断CN10蛋白的PEG化修饰率.结果 PEG化修饰前后的CN10蛋白经TSKgel Octadecyl-4PW色谱柱层析均能达基线分离,当用214 nm波长检测时,CN10蛋白浓度以及PEG修饰后的CN10蛋白均与其对应峰面积呈现良好的线性关系(r2=0.999 58;r2=0.999 67).结论 建立了一种简单快速的检测CN10蛋白PEG化修饰率的方法,此方法具有较高的准确性及专属性,可用于CN10的PEG化修饰工艺的监测.
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重组人睫状神经营养因子衍生物的构建、表达和活性分析
采用PCR定点突变技术对睫状神经营养因子(CNTF)基因进行改造,获得了CNTF衍生物(CNTF-D)基因序列分析证明其核苷酸序列符合设计要求,并在大肠杆菌中获得高效表达,CNTF-D表达量超过40%,复性后,经Q-Sepharose HP纯化,其纯度超过95%,体内法测定发现能明显降低实验小鼠的体重.表明CNTF-D在体内具有良好的生物学活性,为下游开发奠定了基础.
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睫状神经营养因子对大鼠视网膜神经节细胞bcl-2表达的影响
目的 观察睫状神经营养因子(CNTF)对培养的大鼠视网膜神经节细胞(RGCs)bcl-2表达的影响. 方法 取出生后2～3 d Wistar大鼠视网膜组织行RGCs培养,Thy-1单克隆抗体免疫细胞化学鉴定RGCs.实验分2组,对照组单纯加入DMEM,CNTF组加入浓度为20 ng/ml的CNTF.RGCs培养3 d后CNTF组和对照组分别行Western blot检测RGCs内bcl-2蛋白的表达. 结果 Thy-1单克隆抗体免疫细胞化学检查显示,培养3 d的RGCs胞膜和轴突呈棕黄色,且90%以上为免疫阳性细胞.CNTF组RGCs内bcl-2蛋白表达高于对照组(P＜0.05). 结论 CNTF对神经节细胞的营养作用可能与bcl-2基因表达增高有关.
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视神经损伤后视网膜睫状神经营养因子及其受体表达的变化
目的研究视神经损伤后睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)及其受体(CNTFRα)蛋白在大鼠视网膜中的表达变化. 方法采用钳夹法制作大鼠视神经损伤模型,分别于伤后1,3,7,14,28 d取眼球,以正常大鼠视网膜为对照,提取视网膜蛋白,采用Western blotting法检测视网膜中CNTF和CNTFRα蛋白的表达变化. 结果在正常视网膜中存在CNTF和CNTFRα蛋白的表达.视神经损伤后1,3,7,14及28 d CNTF和CNTFRα蛋白表达均增高,伤后7 d达到高, 14 d下降.CNTF 蛋白表达量至28 d仍显著高于正常组(P<0.05),而CNTFRα蛋白表达量至28 d虽增高,但与正常对照组比较,差异无显著性意义(P>0.05). 结论视神经损伤后视网膜中CNTF和CNTFRα蛋白表达增加,可能是视网膜神经元自我保护的一种反应.
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视神经损伤后视网膜睫状神经营养因子及其受体表达的变化
目的研究视神经损伤后睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)及其受体(CNTFRα)蛋白在大鼠视网膜中的表达变化. 方法采用钳夹法制作大鼠视神经损伤模型,分别于伤后1,3,7,14,28 d取眼球,以正常大鼠视网膜为对照,提取视网膜蛋白,采用Western blotting法检测视网膜中CNTF和CNTFRα蛋白的表达变化. 结果在正常视网膜中存在CNTF和CNTFRα蛋白的表达.视神经损伤后1,3,7,14及28 d CNTF和CNTFRα蛋白表达均增高,伤后7 d达到高, 14 d下降.CNTF 蛋白表达量至28 d仍显著高于正常组(P<0.05),而CNTFRα蛋白表达量至28 d虽增高,但与正常对照组比较,差异无显著性意义(P>0.05). 结论视神经损伤后视网膜中CNTF和CNTFRα蛋白表达增加,可能是视网膜神经元自我保护的一种反应.
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联合应用神经生长因子和睫状神经营养因子治疗大鼠坐骨神经损伤
目的探讨联合应用神经生长因子(NGF)和睫状神经营养因子(CNTF)对大鼠坐骨神经损伤后再生及功能恢复的影响.方法切除120只大鼠左侧6mm长坐骨神经,随机分为4组,每组30只,分别行NGF+CNTF、CNTF、NGF、等渗盐水(NS)靶肌肉注射.伤后行坐骨神经功能指数(SFI)、形态学和S-100α、神经中丝200(NF200)免疫组化检查.结果联合应用NGF和CNTF组SFI有髓神经纤维直径、数目和S-100α、NF200阳性轴突计数均明显优于单独用药组.结论联合应用NGF和CNTF可明显促进大鼠坐骨神经损伤后的再生与功能恢复.
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周围神经损伤对脊髓运动神经元睫状神经营养因子表达的影响
目的 探讨周围神经损伤后脊髓运动神经元表达睫状神经营养因子(CNTF)水平的变化规律及其与神经元病理变化的相关性. 方法 选用出生后3 d和成年大鼠各30只,均分为对照组、伤后3,7,14,21,28 d 6组.切断不同鼠龄Wistar大鼠坐骨神经复制周围神经损伤模型,行免疫组织化学染色CNTF阳性脊髓运动神经元,利用图像分析系统计算脊髓CNTF阳性运动神经元的吸光度值,从而间接反映脊髓运动神经元CNTF水平. 结果 坐骨神经损伤后腰段脊髓运动神经元CNTF水平很快下降,至伤后第2周降至低水平,随后逐渐恢复,至4周接近对照组水平;光镜病理改变情况与此过程相似. 结论 周围神经损伤后,脊髓运动神经元表达CNTF水平将发生变化,而且其变化规律与损伤后运动神经元的病理变化过程相似;运动神经元内源性CNTF水平与其病变程度呈负相关.
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睫状神经营养因子促进大鼠周围神经再生的实验研究
目的探讨局部应用睫状神经营养因子(ciliary neuotrophic factor,CNTF)对大鼠周围神经损伤后再生的影响.方法34只大鼠分为4组,1～3组各10只,切除两侧坐骨神经各10mm并用硅胶管套接,左侧套管内注入CNTF50μg,右侧注入等渗盐水对照.术后1,3,4个月分别进行电生理和组织学检查.另4只鼠于术后3个月行辣根过氧化物酶(HRP)逆行示踪检查.结果CNTF治疗组术后1,3,4个月时的电生理和组织学检查结果均明显优于对照组.相应节段脊髓前角标记HRP的神经元明显多于对照组.结论CNTF可促进周围神经特别是运动神经损伤的再生.
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睫状神经营养因子在视神经损伤修复中的作用
近20年来，人们发现哺乳动物中枢神经本身具有再生潜能，在适宜的微环境条件下能发生轴突侧支出芽和突触重建。但是，只有周围神经系统提供的微环境才允许中枢神经再生，而中枢神经系统本身提供的微环境则不能。若将周围神经移植到受损的中枢神经局部，改变中枢神经微环境，即能显著促进中枢神经再生。视神经是中枢神经系统的一部分，哺乳动物视神经损伤后通常很难再生，然而实验研究证明，玻璃体内移植一段周围神经能显著增加视网膜节细胞（RGC）的再生［1-3］。Cui等［3］认为，玻璃体内移植周围神经对视神经再生的促进作用，实际上可能是由于睫状神经营养因子（ciliary neurotrophic factor, CNTF）或CNTF与其他因子的复合作用。笔者就CNTF在视神经损伤修复方面的研究进展综述如下。 一、 CNTF的来源、分布 CNTF初是从小鸡眼的抽提物中分离出的一种能促进鸡胚睫状神经节神经元存活的蛋白质，并因此而得名。CNTF仅分布在神经系统的非神经细胞。在周围神经系统中CNTF的浓度大约是5 nmol/kg，是NGF的100倍。在周围神经系统中CNTF的合成直接或间接接受来自轴突的信号调控。在出生前和新生鼠检测不到CNTF mRNA的存在。但在出生后第2周坐骨神经中的CNTF mRNA和蛋白质急剧增加。CNTF也存在于中枢神经系统，但其浓度低于周围神经系统，在视神经和嗅神经中CNTF mRNA的浓度较高。CNTF的合成量在脑损伤后迅速上升，可能是中枢神经系统的一个损伤修复因子。
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视神经损伤后睫状神经营养因子受体的表达变化
视神经创伤、青光眼等疾患主要影响视网膜神经节细胞( RGCs),RGCs的死亡是视功能发生不可逆性改变的直接原因,因此,关于RGCs存活和再生的研究一直倍受眼科界关注.近十年来的研究发现,睫状神经营养因子(CNTF)能明显促进RGCs的存活和再生[1,2].睫状神经营养因子受体(CNTFR)是CNTF的特异性结合蛋白,它的表达变化与CNTF的作用密切相关.为进一步了解CNTFR mRNA在视神经损伤及修复过程中的表达情况,笔者应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法对其进行了半定量研究.
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坐骨神经损伤后雏菊叶龙胆的修复作用实验研究
目的：观察雏菊叶龙胆是否对坐骨神经损伤后有促进功能恢复的作用,其中是否有睫状神经营养因子的参与。方法雄性Wistar大鼠225只,右侧坐骨神经离断后显微镜下缝合。造模后随机分为对照组、雏菊叶龙胆25 mg组、50 mg组、75 mg组和甲钴胺组5组。对照组生理盐水注射,其他组相应剂量的雏菊叶龙胆及甲钴胺注射,1、3、5周测定神经传导速度及腓肠肌肌细胞截面积,免疫组化分析睫状神经营养因子( CNTF)阳性细胞比率。结果雏菊叶龙胆50 mg、75 mg组与对照组、甲钴胺组神经传导速度相比有明显差异,雏菊叶龙胆25 mg组与75 mg、50 mg组相比有明显差异(P=0.025)。3周时对照组、甲钴胺组、雏菊叶龙胆25 mg、50 mg、75 mg组腓肠肌肌细胞截面积分别为：(455.06±29.38)μm2、(679.03±81.48)μm2、(465.31±71.55)μm2、(670.24±91.26)μm2、(669.28±78.54)μm2,对照组、雏菊叶龙胆25 mg组与其他组比较有显著差异(P<0.05)。3周时各组睫状神经营养因子免疫组化可见雏菊叶龙胆25 mg组和对照组与雏菊叶龙胆50 mg、75 mg组比较结果有统计学差异。结论雏菊叶龙胆可促进坐骨神经损伤后功能恢复,可促进神经功能恢复中有睫状神经营养因子参与。
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不同年龄大鼠坐骨神经损伤后睫状神经营养因子对脊髓组织中Caspase3表达的影响
目的观察睫状神经营养因子(CNTF)对天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶(Caspase3)在坐骨神经损伤后不同年龄大鼠脊髓组织中表达的影响.方法幼年、成年、老年Wistar大鼠各270只,随机分为正常组(18只)、CNTF组(126只)和生理盐水组(126只).CNTF组和生理盐水组切出长2mm右侧坐骨神经,用硅胶管连接近、远侧神经残端制作神经再生小室,CNTF组再生小室内注入25μg/ml重组CNTF15μl,生理盐水组再生小室内注入生理盐水15μl,CNTF组和生理盐水组分为术后1、3天和1、2、4、8、12周组.利用免疫组织化学、Western blotting 检测脊髓Caspase3的分布与表达强度变化,进行Caspase3活性测定.结果损伤后各年龄组伤侧脊髓Caspase3蛋白表达增强(P《0.05或0.01),以前角运动神经元变化为明显,幼年、成年、老年CNTF组Caspase3表达较生理盐水组减弱(P《0.05或0.01); 各组对侧未伤侧与正常组比较,差异无显著性意义(P》0.05).幼年、老年及成年生理盐水组于损伤侧脊髓Caspase3活性升高,各时相点幼年大鼠Caspase3活性高于老年及成年(P《0.05或0.01),幼年、成年、老年CNTF组Caspase3活性低于生理盐水组(P《0.05或0.01).生理盐水组及CNTF组对侧未伤侧Caspase3活性,除幼年伤后12周较正常组低外(P《0.05),其余各组与正常组比较相差无显著性意义(P》0.05).结论坐骨神经损伤后不同年龄大鼠脊髓组织中Caspase3蛋白表达及活性增高,外源性CNTF可减少脊髓神经元中Caspase3蛋白表达及活性,其作用在幼年、成年及老年依次减弱.
关键词： 天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶 睫状神经营养因子 大鼠 年龄 坐骨神经损伤 -
睫状神经营养因子对N-甲基-D-天冬氨酸引起海马神经元内钙离子浓度升高的影响
①目的研究睫状神经营养因子(CNTF)对谷氨酸(Glu)受体激动剂N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)引起的海马神经元内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)升高的影响,并探讨G蛋白是否参与此作用.②方法原代培养海马神经元,用活细胞内荧光探针Fura-2/AM实时检测应用CNTF和G蛋白抑制剂百日咳毒素(PTX)后由NMDA引起的海马神经元[Ca2+]i的变化.③结果用CNTF孵育经NMDA刺激的海马神经元后,细胞内[Ca2+]i升高的程度较单独NMDA刺激细胞引起的[Ca2+]i升高程度低(t=2.97～4.86,P<0.05),加入 PTX可减弱CNTF的抑制作用.④结论 G蛋白可能参与CNTF调节NMDA引起的海马神经元内[Ca2+]i升高的快速作用途径.
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CNTF对AMPA和NMDA引起海马神经元Ca2+浓度升高的作用
①目的探讨睫状神经营养因子(CNTF)对两种谷氨酸(Glu)离子型受体激动剂(α-氨基羧甲基异哑恶唑丙酸,AMPA;N-甲基-D-天冬氨酸,NMDA)激发的海马神经元内游离Ca2+([Ca2+]i)升高的作用.②方法原代培养海马神经元,在有或无CNTF条件下用活细胞内荧光探针Fura-2-AM实时检测AMPA和NMDA引起海马神经元内[Ca2+]i变化的情况.③结果 AMPA和NMDA均可引起细胞内[Ca2+]i升高,并呈量效依赖性;CNTF可快速抑制NMDA引起的海马神经元内[Ca2+]i升高(t=2.97～4.86,P＜0.05),而对AMPA的作用无影响(t=0.22～0.74,P＞0.05).④结论 CNTF可能通过与NMDA型受体相互作用而快速启动Ca2+信号的途径,保护因Glu引起的海马神经元损伤.AMPA型受体可能与CNTF的快速作用无关.
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睫状神经营养因子对应激大鼠体质量的影响及其机制探讨
①目的探讨睫状神经营养因子（CNTF）对躯体性和心理性应激大鼠体质量的影响及其与下丘脑促肾上腺皮质素释放激素（CRH）含量的关系。②方法建立应激大鼠动物模型，应用鼠脑立体定向方法，在应激前给予大鼠双侧海马微量注射CNTF，称量大鼠应激前后的体质量变化，并用放射免疫分析法测定大鼠下丘脑CRH含量的变化。③结果在应激前及应激期间给予双侧海马微量注射CNTF，可以有效改善应激引起的大鼠体质量的下降（t=2.16～3.86,P<0.05,0.01）,改善应激引起的下丘脑CRH含量的升高（t=3.05～4.03,P<0.01）。④结论 CNTF可以改善应激对大鼠生长的损害，其机制可能与CNTF降低应激大鼠下丘脑CRH的含量有关。
关键词： 睫状神经营养因子 体质量 应激 促肾上腺皮质素释放激素
