睫状神经营养因子转基因治疗视神经损伤的研究进展

视神经损伤的治疗一直是医学界的难题.而睫状神经营养因子(CNTF)能促进视网膜缺血后视网膜神经节细胞的存活和轴突切断后再生,为治疗视神经损伤提供了可能.但单纯应用外源性CNTF直接治疗,在体内作用时间短,而其与转基因技术相结合克服了该缺点,为治疗视神经损伤性疾病开辟了新途径.本文就CNTF的分子生物学特性、对视神经损伤的保护作用,特别是CNTF转基因治疗在视神经损伤的研究进展作一综述.

干细胞应用在青光眼视神经再生中的研究进展

青光眼以进行性视网膜神经节细胞凋亡为主要病理特征.干细胞的自我复制和多向分化潜能使得人工获得视网膜神经节细胞进行替代治疗成为可能.新近发现的自体睫状上皮干细胞可能成为良好的供体来源,已被证实能向视网膜神经节细胞方向分化,但人工获得的神经元样细胞的功能建立以及神经元轴突的人工导向生长仍有待突破.本文就目前利用干细胞再生视神经,从而治疗青光眼视神经病变的新研究进展作一综述.

Schwann细胞与视神经再生

Schwann细胞在周围神经再生中具有重要作用.近年来,通过大量动物实验发现,Schwann细胞对中枢神经元轴突的再生以及髓鞘损伤后的修复亦有促进作用,并为中枢神经系统损伤的修复提供了良好的微环境.本文就Schwann细胞的功能和在视神经再生中的作用以及在视神经移植上的应用前景进行综述.

IN-1和CNTF对成年仓鼠视神经再生的协同作用

大鼠晶状体上皮细胞促进损伤后视神经再生的研究

目的 研究晶状体上皮细胞在晶状体损伤促进视神经轴突再生的过程中所起的作用.方法 144只大鼠随机分为5组:正常组(n=4)、单纯损伤组(n=20)、晶状体损伤组(n=40)、未损伤移植组(n=40)和预损伤移植组(n=40).正常组动物存活4周后处死.其余各组,分别于1周、2周、3周、4周和5周,处死一定数量的动物,通过罗丹明B异硫氰酸盐(rhodamine-B-isothiocyanate, RITC)玻璃体腔内注射顺行标记的方法,观察视神经轴突再生情况.结果 单纯损伤组和未损伤移植组与晶状体损伤组和预损伤移植组之间视神经再生率比较,差异有统计学意义.视神经轴突再生一旦突破视神经断端,就能随着时间的推移再生一定的长度.结论 晶状体损伤能够极大地促进损伤后视神经轴突的再生;损伤后晶状体上皮细胞的变化在晶状体损伤促进视神经再生的过程中起关键性作用.

小鼠视神经再生研究动物模型的建立

目的总结制作小鼠视神经完全截断性动物模型作为视神经再生研究的经验和体会.方法将雄性Bcl-2高表达转基因小鼠(Bcl-2transgenic mice)和受GFAP启动子控制表达疱疹病毒-胸苷激酶转基因雌性小鼠(GFAP-TK)交配产生的4只8～12周成年小鼠(20～30g),Bcl-2/GFAP-TK双转基因小鼠作为实验组,同周龄4只Bcl-2转基因小鼠作为对照组.其中Bcl-2/GFAP-TK双转基因小鼠皮下植入缓释泵,连续7d释放更昔洛韦(GCV)100mg·kg-1·d-1以选择性地去除视神经损伤后激活的星形胶质细胞.更昔洛韦缓释泵植入术后2d在两组动物中制作右侧单眼标准完全性视神经钳夹损伤模型,视神经钳夹10d后获取组织标本.采用免疫荧光染色特异性检测再生轴突纤维并进行定量分析;结合罗丹明的霍乱毒素B亚单位(CTB-R)或增强表达绿色荧光蛋白的复制缺陷型腺相关病毒(AAV-EGFP)用作顺行性标记物以显示再生轴突是否到达大脑靶器官.结果在Bcl-2/GFAP-TK双转基因小鼠中存在免疫荧光阳性的再生视神经轴突,再生轴突计数为71.99±24.04,并可见生长锥(growth cone)样结构,但是再生轴突纤维未能延伸达到大脑靶器官.在对照组Bcl-2转基因小鼠中未见明显再生迹象.结论小鼠视神经完全截断性动物模型可用于视神经病变的再生研究.

眼视神经切断再生实验研究

[目的]观察家兔视神经切断后再生改变.[方法]采用硫喷妥纳腹腔内注射联合球后2%奴夫卡因液注射麻醉,剪开球结膜用视神经钳分离视神经,用显微手术剪将视神经2/3切断,30 d后手术取出视神经,进行病理染色检查.[结果]实验的30眼有28眼再生,视神经切断处间隙被再生的视神经纤维长满接通,再生的视神经纤维比正常的粗大,排列不整齐,呈条索状.[结论]视神经损伤是可再生的,其再生形式从切口两侧缘开始,而不象周围神经那样从近端开始向远端再生.

大鼠神经母细胞特异性转移因子基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

背景：研究表明，神经母细胞特异性转移因子(ASCL1)是神经发育过程中的关键调控因子，因此通过对成体细胞进行ASCL1基因修饰，有可能将成体细胞转分化为神经细胞，为视神经再生治疗提供新策略。目的：构建携带鼠ASCL1基因的重组腺病毒表达载体，获得重组腺病毒pAd-rat-ASCL1-EGFP，以期为进一步研究ASCL1基因的功能奠定基础。方法：用 XhoⅠ和 EcoRⅠ将目的基因 ASCL1及带有增强型绿色荧光蛋白表达盒的腺病毒穿梭载体 pYr-adshuttle-4进行双酶切；回收酶切质粒的目的片段进行连接，产物转化至 DH5α感受态；提取质粒酶切鉴定正确后测序。然后通过LR体外同源重组将rat-ASCL1表达框构建至pAd/PL-DEST腺病毒表达载体， PacⅠ酶切线性化后用脂质体法转染 HEK293细胞进行包装、扩增，采用 PCR 法对重组腺病毒进行鉴定， TCID50法测定病毒滴度，荧光显微镜观察病毒感染效率。结果与结论：通过酶切鉴定和DNA测序鉴定，证实重组腺病毒载体pAd-rat-ASCL1-EGFP构建正确，PCR鉴定扩增出862 bp的目的条带，TCID50法测定病毒滴度为2×1010 pfu/mL。荧光显微镜观察HEK293细胞的病毒感染效率为80%以上。提示含 ASCL1基因的重组腺病毒载体构建成功，获得的病毒具有高滴度，高效感染率，为下一步进行ASCL1基因功能研究和视神经再生治疗研究奠定了基础。

mTOR及其信号通路与视神经再生的关系

雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一种丝/苏氨酸蛋白激酶,已证实其在调节细胞生长、增殖和调控细胞周期等多个方面起到重要作用.mTOR信号通路的活化与视神经损伤后轴突再生的发生密切相关,可能是视神经损伤临床治疗的个重要的潜在靶点.本文就mTOR信号通路与视神经再生的关系进行综述.

共培养系统中巨噬细胞对大鼠视网膜神经节细胞存活和轴突再生的影响

目的 观察体外巨噬细胞对视网膜神经节细胞(RGC)存活和生长的影响.方法 采用Transwell小室建立大鼠腹膜腔巨噬细胞和RGC的共培养模型,以不用巨噬细胞共培养的RCC作为对照组,用台盼蓝染色计数及相差显微镜观察RGC存活的时间,并测量培养1 d、3 d和5 d时RGC突起的平均长度,进行组间比较.结果 培养1 d、3 d、5 d和7 d,共培养组平均活细胞数分别为(35.50±2.92)个、(28.20±3.36)个、(18.70±3.95)个和(8.80±1.55)个,对照组为(36.20±2.35)个、(27.10±2.96)个、(15.80±3.04)个和(8.40±2.01)个,两组之间差异均无统计学意义(t=0.369、0.497、0.487、2.854,P均>0.05).培养1 d、3 d和5 d,共培养组RGC突起的平均长度分别为(19.79±3.98)μm、(68.30±4.07)μm和(95.51±6.51)μm,明显长于对照组[(15.28±1.28)μm、(58.18±4.22)μm和(82.61±3.75)μm],两组差异均有统计学意义(t=-4.562、-6.554、-7.027,P均<0.05).结论 巨噬细胞可明显促进共培养的RGC轴突的生长,但对其存活时间没有显著影响.

KLF4在大鼠晶状体损伤促进视神经再生过程中的表达

目的 观察单纯视神经损伤及视神经损伤联合晶状体损伤后视网膜神经节细胞及其轴突中锌指样转录因子4(KLF4) mRNA表达量的变化,探讨晶状体损伤促进视神经再生的相关机制.方法 取54只健康成年Wistar大鼠随机分成对照组(6只)、单纯视神经损伤组(24只)、视神经损伤联合晶状体损伤组(24只).分别于7d、14 d、21 d处死对照组大鼠各2只,单纯视神经损伤组和联合晶状体损伤组大鼠各8只.透射电镜观察损伤后轴突的显微结构变化,荧光定量聚合酶链反应检测不同分组不同时间点视网膜神经节细胞及其轴突上KLF4 mRNA的表达.结果 损伤7d时,透射电镜下见单纯视神经损伤组和联合晶状体损伤组轴突较对照组明显肿胀,轴浆电子密度降低,髓鞘结构混乱,联合晶状体损伤组可见部分簇状排列的无髓鞘包裹的新生神经纤维,损伤14 d和21 d时单纯视神经损伤组和联合晶状体损伤组均少见髓鞘轮廓,见众多胶原纤维.损伤7d时,单纯视神经损伤组(2-△△△为0.561 ±0.045)和联合晶状体损伤组(0.091 ±0.026)KLF4 mRNA相对表达量较对照组(1.003±0.113)均有不同程度降低,联合晶状体损伤组降至低,差异均有统计学意义(均为P＜0.05)；损伤14 d时,单纯视神经损伤组(2-△△Ct为0.333±0.106)和联合晶状体损伤组(0.401±0.169) KLF4 mRNA相对表达量较对照组仍有不同程度降低,差异有统计学意义(均为P＜0.05),但单纯视神经损伤组和联合晶状体损伤组间差异无统计学意义(P＞0.05)；损伤21d时,单纯视神经损伤组(2-△△Ct为1.100±0.100)和联合晶状体损伤组(1.166 ±0.115) KLF4 mRNA相对表达量较对照组轻度增高,差异均无统计学意义(均为P＞0.05).结论 晶状体损伤促进视神经再生的机制可能与KLF4表达减少有关,这为基因转录水平靶向治疗视神经病变提供了新的思路.

晶状体损伤对视神经损伤后再生影响的研究

目的 观察单纯视神经损伤及视神经损伤联合晶状体损伤后视神经中Nogo-A mRNA及Nogo-A的表达,探讨晶状体损伤促进视神经损伤后再生的机制.方法 66只雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组(A组,6只)、单纯视神经损伤组(B组,30只)和视神经损伤联合晶状体损伤组(C组,30只).分别于造模后7d、14d、21 d处死大鼠2只(A组)、10只(B组)、10只(C组),光镜下观察视神经的病理变化,免疫组织化学染色检测Nogo-A表达情况,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、半定量分析不同组视神经Nogo-A mRNA的表达.结果 大鼠正常视神经中表达Nogo-A mRNA及Nogo-A,但表达量较低；损伤视神经后7 d Nogo-A mRNA的表达量显著升高,至伤后21 dB组及C组均维持较高的水平.B组损伤后7 d Nogo-A表达阳性的细胞数开始增多( 136.80±3.94),与A组比较差异有统计学意义(P＜0.05),并保持高表达；C组损伤后21 d Nogo-A的表达较B组低,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 视神经损伤后髓鞘相关抑制因子Nogo-A表达增高,晶状体损伤促进视神经再生的机制可能与Nogo-A有关.

层粘连蛋白和纤维粘连蛋白在成年大鼠不同视神经再生模型中的表达

目的测层粘连蛋白(LN)和纤维粘连蛋白(FN)在成年大鼠视神经再生模型中的表达,探讨坐骨神经、LN和FN在视神经再生中的作用.方法选择64只健康成年雄性SD大鼠,随机分成2组,实验组自体视神经-坐骨神经吻合模型32只,对照组自体视神经-视神经吻合模型32只.术后15、30、45、60 d处死动物取吻合神经.利用免疫组化SP法和计算机图像分析,测定LN和FN在各组中的表达.结果实验组LN和FN表达水平高于对照组,差别有统计学意义(P＜0.05).结论LN和FN涉及成年大鼠视神经再生.坐骨神经移植有助于增加两者表达,促进视神经再生.

干细胞在视神经损伤修复中的应用

许多致盲性眼病是由视网膜神经节细胞(RGCs)损伤造成的,目前临床上缺乏有效的治疗方法.近的研究显示干细胞可以替代或再生RGCs,从而有望修复受损的视功能.这些结果提供了新颖的视神经再生模式,但具体到临床应用,仍存在一系列问题需要解决.就应用干细胞再生视神经的研究进展进行综述.

荧光金顺行示踪标记视神经轴突纤维

长期以来,视神经再生修复的研究一直是视觉科学和神经科学研究的热点,视神经再生形态学研究中一个重要的观察指标就是轴突纤维的走行情况.本研究观察了荧光金(Fluoro-Gold,FG)顺行示踪在视神经中的标记作用.

视神经损伤后再生影响因素的研究

经典理论认为哺乳动物的视神经完全损伤后不能有效再生,只有一些较低等的两栖类和鱼类视神经离断后能完全再生.近20多年来,人们发现哺乳动物视神经本身具有再生潜能,在适宜的微环境条件下能发生轴突侧枝出芽和突触重建;但再生受诸多因素影响,其中既有促进因素,也有抑制因素.本文对影响视神经再生的因素及其研究进展加以综述.

活化星形胶质细胞去抑制调控小鼠视神经再生的实验研究

目的:揭示活化星形胶质细胞去抑制对小鼠视神经再生的作用.方法:将Bcl-2高表达转基因小鼠(Bcl-2tg)和GFAP/Vimentin双基因敲除小鼠(GFAP-/-/Vim-/-)交配获得三基因突变小鼠(Bcl-2tg/GFAP-/-/Vim-/-,3M).分别选取出生后5d(P5)小鼠3只及出生后18d(P18)小鼠3只制作标准的完全性视神经嵌断模型.应用GAP43免疫荧光染色特异性检测再生轴突.结果:Bcl-2 tg/GFAP-/-/Vim-/-小鼠在P5时获得视神经再生,再生轴突可以延伸达视交叉水平,而P20时仅获得局部出芽再生.结论:在Bcl-2转基因使视网膜节细胞重获内源性再生能力基础上,通过活化星形胶质细胞去抑制可以促进视神经轴突再生,提示活化星形胶质细胞是抑制视神经再生的重要因素,从而为青光眼等视神经病变的再生治疗提出了新的方向.

激肽释放酶结合蛋白对大鼠视神经不完全损伤后视网膜神经细胞的保护作用及轴突再生的研究

目的 探讨激肽释放酶结合蛋白(KBP)是否对体内视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)存在保护和促进其轴突再生的作用.方法 在距SD大鼠视神经球侧端0.5～1.0mm的地方夹持视神经,造成大鼠视神经不完全性损伤;在大鼠视神经损伤的模型中,行玻璃体腔分别注入KBP作为实验组和PBS为对照组;分别于损伤后7d,14d和21d取材,HE染色观察视网膜结构、测量视网膜厚度及RGCs的存活数量;提取术眼视神经行蛋白免疫印迹.根据统计学分析结果,明确KBP是否有视网膜神经节细胞保护和促进其轴突再生作用.结果 ①大鼠不完全视神经损伤模型建立成功.②通过HE染色,我们观察了视网膜各层结构变化,通过双肓法计数RGCs,和视网膜厚度测量,经统计学分析,组间差异具有统计学意义.③对神经再生的标记蛋白GAP-43进行Western-blot,统计学分析,组间GAP-43表达差异具有统计学意义.结论 ①KBP对视神经损伤后的RGCs具有保护作用.②KBP在视神经损伤后可能促进了视神经的轴突再生.

Nogo-A与视神经再生

传统的观点认为中枢神经受损后不能再生,然而近年来许多研究证明在一定条件下,中枢神经可以再生.研究发现 Nogo 蛋白是阻碍中枢神经系统受损后神经元存活和再生的因素之一,它包括Nogo-A、-B、-C 三种蛋白,它们主要通过其共有的 Nogo-66 同受体 NgR 结合而抑制轴突生长,其中Nogo-A具有强的抑制神经生长的作用.视神经作为中枢神经系统一部分,其损伤与再生的研究为近年来国内外学者较为关注的热点.本文就Nogo-A与视神经再生的研究进展作一简述.

视神经再生微环境的调控

视神经在位置上属周围神经系统,但其发育、结构和功能等均具中枢神经系统特性.由于其独特的位置关系,便于暴露,易于建立视神经损伤动物模型.视神经损伤动物模型已成为人们研究中枢神经系统损伤或疾病的突破口,故探讨视神经损伤后再生,对中枢神经系统疾病的治疗或促进中枢神经系统损伤后功能恢复等有重要意义.视神经损伤后,90%～95%视网膜节细胞(RGC)发生凋亡性死亡,受损神经也出现了一系列形态结构变化,如损伤局部组织变性坏死,释放炎性因子;血管充血,血浆和细胞成分渗出,组织水肿;成纤维细胞和巨噬细胞向伤处迁移;局部神经胶质细胞增生、肥大,星形胶质细胞大量表达胶质纤维酸性蛋白(GFAP),后形成胶质疤痕;少突胶质细胞中抑制轴突生长的因子,尤其是髓鞘源性的抑制因子表达增加;神经营养因子的运输被阻断或减少.这些变化形成了视神经轴突再生的抑制性微环境.目前研究表明视神经损伤后RGC轴突能够再生[1],且RGC存活率已经可以提高到满足视神经再生的要求,但再生的抑制性微环境往往使再生轴突初始发芽萎缩而导致视神经再生失败.因此,视神经再生微环境的调控越来越成为视神经再生研究的焦点.