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外膜孔道蛋白ompC、ompF的表达与大肠埃希菌耐药的相关性研究
目的 研究外膜孔道蛋白ompC、ompF引起细胞膜通透性改变与大肠埃希菌(ECO)对抗菌药物形成耐药的相关性.方法 设计复合引物对ompC全基因序列和ompF、ompA、fepA、cirA、chuA等基因序列进行扩增,回收PCR产物、钝化后测序;菌体外膜蛋白进行SDS-PAGE电泳,回收的目标膜蛋白条带经胰蛋白酶消化,采用质谱仪分析蛋白成分并进行蛋白序列的测定.结果 SDS-PAGE电泳图谱和质谱分析显示,7株大肠埃希菌均有相应的外膜孔道蛋白ompC和ompA表达,无外膜孔道蛋白ompF表达;第6、7菌株的孔道蛋白ompC和ompA表达量明显减少,但有铁运输蛋白chuA、cirA、fepA的表达;基因扩增显示7株大肠埃希菌均有ompF产物,耐药性较强的第6、7菌株还有fhuA和cirA扩增产物,但产物fhuA的相对分子质量小于ECO-klz(少54 bp).结论 持续使用抗菌药物将导致细菌外膜孔蛋白ompF低表达或不表达,外膜孔蛋白ompC氨基酸序列的改变影响相应蛋白的表达,使细胞膜通透性降低,从而增加细菌对抗菌药物的耐药性;高度耐药的大肠埃希菌伴随代偿性铁运输蛋白chuA、cirA、fepA的表达,维持细菌的新陈代谢,保持其高水平耐药性.
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白色念珠菌3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆及表达
目的 构建白色念珠菌3-磷酸甘油醛脱氧酶(GAPDH)的表达载体并使其在大肠杆菌中正确表达.方法 提取基因组总RNA,PCR方法获得GAPDH基因,构建其原核表达质粒pET-32a(+)-GAPDH,转化大肠杆菌BL21菌株,经IPTG诱导产生蛋白,用SDS-PAGE和Western Blotting检测GAPDH蛋白表达情况.结果 构建的白色念珠菌GAPDH基因表达质粒经序列测定证实,与GenBank数据完全一致.双酶切鉴定证实,克隆基因正确插入pET-32a(+)载体.在1.0 mmol·L-1的IPTG浓度诱导下表达,可观察到相对分子量51kDa的蛋白,经SDS-PAGE和Western Blotting检测证实为GAPDH蛋白.结论 实验成功克隆白色念珠菌GAPDH基因,并在大肠杆菌中正确表达,为白色念珠菌感染的候选疫苗奠定工作基础.
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三种方法纯化生物工程抗体片段的比较
比较3种不同纯化体系纯化生物工程抗-HBsFab的效率和效果,寻求高效、经济的生物工程产品批量纯化方法.采用增菌发酵抗-HBsFab阳性克隆,超声破菌法制备Fab上清.分别缓冲平衡抗Fab-Sepharose亲合胶、链球菌蛋白G(prot.G)-Sepharose胶和Ni-NTA离子螯合胶,对Fab上清进行过柱纯化.紫外光检测目的蛋白得率,SDS-PAGE鉴定产物的纯度并用HBsAg包被ELISA检测其生物活性.结果显示,等容积不同类别的胶体对目的蛋白的纯化效率依次为:Ni-NTA离子螯合胶prot.G-Sepharose胶＞抗-Fab-Sepharose亲合胶;在各胶体饱和结合能力之内,3种方法皆可获高纯度产品,在SDS-PAGE中呈现单一区带;HBsAg包被ELISA检测结果为3种方法纯化制备的Fab在抗原结合能力上未显示明显差别.提示,3种纯化方法各有优势和应用限制,Ni-NTA法在经济性、实用性和纯化效率上明显优于其他两种方法.
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重组L-天冬酰胺酶Ⅱ的中试工艺及其性质的研究
目的:通过重组L-天冬酰胺酶Ⅱ中试工艺及其性质的研究,旨在获得大量的高纯度产品.方法:采用500 L发酵罐发酵,对所获得菌体进一步提取纯化,产品用还原SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙酰胺凝胶电泳法),HPLC测定纯度,质谱和等电聚焦电泳分别测相对分子质量、等电点,并进行了紫外扫描.结果:发酵液产酶活力达到200 U.mg-1,提取回收率为80%,纯化总回收率为57%,产品比活为220 U.ml-1,电泳30 μg上样量显示一条带,HPLC测纯度大于95%.该酶Mr为138356,pI为4.85,紫外大吸收值在278 nm处.结论:本研究对实现重组L-天冬酰胺酶Ⅱ的工业化生产有重要意义.
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两种果子狸血清IgG纯化方法的比较
目的 探讨一种具有简便快捷、高纯度、活性好的果子狸血清IgG纯化方法.方法 比较Hitrap Protein A 亲和层析和PAGE电泳两种纯化法对果子狸血清IgG的纯化,用PAGE 还原电泳和Western-Blot法对IgG作纯度鉴定.结果 对Hitrap Protein A纯化的果子狸血清IgG, 其活性虽好,但纯度不高;而非还原PAGE电泳所纯化的果子狸血清 IgG不但纯度高(＞95%)、并具有较强的免疫活性.结论 非还原PAGE电泳法纯化果子狸血清IgG,是一种具有高纯度、免疫活性强的纯化方法.
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生脉注射液不同制备工艺中间体含残留蛋白质的检测研究
目的 检测生脉注射液不同制备工艺中间体含残留蛋白质含量.方法 以残留蛋白质为检测目标,采用透析法获取生脉注射液不同制备工艺中间体中大分子杂质,Bradford法测定各大分子杂质中残留蛋白质含量,结合SDS-PAGE电泳分析各残留蛋白质分子质量.结果 在0～8 μg线性范围内,牛血清白蛋白标准品回归方程为:Y=0.0474X-0.003(r=0.9974);不同工艺对提取液中残留蛋白的影响较大,红参不同工艺提取液含残留蛋白浓度较高,分别为399、353μg/mL;麦冬、五味子提取液残留蛋白含量相对较低;经对SDS-PAGE电泳结果分析,各不同工艺提取液中间体含蛋白质分子质量主要集中于6～11万.结论 生脉注射液中间体提取工艺工程中可能有蛋白质残留,应加强残留蛋白质检测及生脉注射液的工艺改进;Bradford法结合SDS-PAGE电泳分析生脉注射液中的残留蛋白质,快速、准确、敏感性及检测结果均较好,可为工业生产提供科学数据参考.
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生猪肉与加热猪肉SDS-PAGE电泳检测方法的研究
SDS-PAGE是蛋白质分析、比较和特性鉴定的有效方法.生猪肉与加热终温度不同的猪肉经蛋白质提取后进行SDS-PAGE电泳分析,从其分离谱带与加热终温的关系可对其进行检测.
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胶原海绵的结构分析
用SDS-PAGE法对胶原海绵进行了较全面的结构分析。结果表明酶解法制备的胶原海绵除含有α、β、γ组份以外,还含有分子量高于γ及分子量低于α的组份;其中γ组份是α组份的三聚体,β组份是α组份的二聚体,符合胶原蛋白的结构特征;胶原海绵的γ组份及分子量高于γ的组份含量约是明胶标准品的两倍,分子量低于α的组份含量较少,与胶原蛋白的组成特征相符。
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蒙古黄芪中2种具有免疫活性的可溶性粗蛋白提取工艺优选
目的 优选蒙古黄芪Astragalus membranaceus mongholicus中2种免疫活性蛋白AmPR10-16kDa和HQGP-2的佳提取工艺.方法 以蒙古黄芪中所含可溶性蛋白AmPR10-16kDa和HQGP-2二级结构的圆二色性对提取温度和提取溶剂种类进行考察;对该2种蛋白提取条件进行单因素考察,并采用L9(34)正交试验设计法,采用Image凝胶图形分析软件以AmPR10-16kDa和HQGP-2在SDS-PAGE凝胶图中的蛋白条带灰度值(峰面积)为指标,考察提取温度、料液比、提取时间、提取溶剂(pH值)、药材粒度、提取次数对AmPR10-16kDa和HQGP-2蛋白条带灰度值的影响,从而确定AmPR10-16kDa和HQGP-2的佳提取工艺,辅以其免疫抑制率(CCK-8法)和可溶性蛋白定量测定(BCA法)作为佐证.结果 建立了蒙古黄芪中AmPR10-16kDa和HQGP-2的佳提取工艺:向药材粉末(过4号筛)5.0g中加入16倍量Tris-HC1,在温度40℃条件下恒温提取60 min,以100 r/min搅拌.蒙古黄芪蛋白质提取率为65 mg/g,且质量浓度为90 μg/mL粗蛋白的免疫抑制率为90.90％.结论优化的提取工艺能正确反映AmPR10-16kDa和HQGP-2收率的高相对量,为AmPR10-16kDa和HQGP-2的进一步研究提供了稳定、合理、可行的提取工艺.
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蜂毒素的SDS-PAGE质控方法研究
目的建立以SDS-PAGE进行蜂毒素质量控制的方法.方法将通过凝胶色谱法从蜜蜂毒中分离纯化所得到的蜂毒素,以SDS-PAGE法测定其相对分子质量,并通过凝胶成像扫描测定蜂毒素纯度.结果蜂毒素样品电泳后在凝胶块上显示为均一条带,相对分子质量约为2 800,含量为(90.59±0.85)%,与HPLC测定结果平行.结论SDS-PAGE法作为蜂毒素的质控方法,结果准确、可靠、简便.
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液氮快速冷冻对地龙中水溶性蛋白组成和活性的影响
目的 探讨低温炮制工艺对地龙水溶性蛋白质组成以及溶栓与抗肿瘤活性的影响.方法 地龙的炮制采用传统与低温两种工艺,低温炮制采用液氮快速冷冻与冷冻干燥技术;采用SDS-PAGE与ImageTool软件,对两种炮制工艺的地龙蛋白质组成的差异进行定性与定量分析;应用纤维蛋白平板法与体外溶栓试验,定性与定量分析两种炮制工艺的纤溶活性的差异;应用显微观察与MTT法,对两种炮制工艺体外抑制人肝癌细胞增殖活性进行定性与定量比较分析.结果 低温炮制工艺地龙的水溶性蛋白组成比传统炮制工艺丰富,SDS-PAGE的蛋白条带数与浓度明显高于传统工艺;两种炮制工艺的地龙蛋白液均具有显著的抗人肝癌细胞与纤溶活性,但低温炮制工艺的两种活性显著高于传统工艺.结论 不同炮制工艺对地龙水溶性蛋白组成及其抗肿瘤与溶栓活性有显著影响;在保全地龙的蛋白质类药效成分的生物活性方面,低温炮制工艺优于传统炮制工艺.
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金钱白花蛇可溶性蛋白凝胶电泳图谱的研究
对金钱白花蛇进行几种凝胶电泳研究,根据聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)谱带的位置和数目进行品种鉴别;用改进的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定其主要蛋白质成分分子量;用等电聚焦电泳(IFE)测定其主要蛋白质成分的等电点(PI).清晰的电泳谱带及相应数据为商品蛇真伪鉴别提供了科学依据.
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柠檬提取物对多重耐药金黄色葡萄球菌的抑菌作用
目的:观察柠檬提取物对多重耐药金黄色葡萄球菌的抑菌效果,初步探讨柠檬提取物的抑菌机制.方法:采用纸片法、对倍稀释法对不同浓度柠檬提取物进行耐药菌株的抑菌试验;采用SDS-PAGE电泳法,观察柠檬提取物作用下菌体蛋白质电泳图谱的变化;通过测定乳酸脱氢酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶的活性,观察柠檬提取物作用下酶活性的改变.结果:柠檬提取物对临床分离的耐药金黄色葡萄球菌的纸片抑菌实验抑菌环＞30 mm,小抑菌浓度为1:6 400;在不同凝胶浓度的SDS-PAGE中,柠檬提取物作用的耐药金黄色葡萄球菌有明显的菌体蛋白电泳图谱的改变;柠檬提取物对酶活性无改变.结论:柠檬提取物对耐药金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用,影响了菌体蛋白质的合成.初步揭示了柠檬提取物的作用机制.
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幽门螺杆菌NCTC11639基因hpaA的克隆表达及鉴定
目的 获取幽门螺杆菌(Hp) hpaA 基因的序列,预测其编码蛋白paA 作为候选疫苗的可行性,在大肠杆菌表达系统中表达hpaA.方法 提取 Hp 标准株 NCTC11639 的基因组 DNA,使用PCR扩增hpaA基因,克隆入pCEM-T载体中测序.并进行同源性分析.将 hpaA 克隆入表达载体pGEX-4T-1中.诱导表达,SDS-PAGE 电泳鉴定.结果 同源性分析表明hpaA具有很高的保守性,成功构建出可以高效、分泌型表达hpaA的原核表达系统.结论 hpaA具有高保守性.在Hp各菌株中普遍存在,是有良好应用前景的Hp候选疫苗.
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鸡内金及其混淆品的电泳图谱鉴定
目的:探讨不同生长阶段,不同性别的鸡内金及混淆品鸭内金、鸽子内金,建立鸡内金鉴别的简单方法.方法:用电极缓冲液超声提取样品中的蛋白质,经样品水解液加热水解后,用不连续SDS-PAGE法对不同生长阶段,不同性别的鸡内金及混淆品鸭内金,鸽子内金进行鉴别.结果:鸡内金与其混淆品鸭内金,鸽子内金有明显区别,不同生长阶段鸡内金SDS-PAGE图谱也有一定的区别.结论:该方法准确,可靠,重复性好,可对不同生长阶段,不同性别的鸡内金及混淆品的鉴别提供重要参数.
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不同年限野生和人工种植黄芪的电泳图谱鉴别
目的:通过比较不同年限人工与野生黄芪的蛋白质电泳图谱,为黄芪种植提供新的评价标准.方法:采用SDS-PAGE技术,对山西省浑源县人工种植和野生2年、8年和10年黄芪进行鉴别分析.结果:不同年限人工及野生黄芪的蛋白质电泳图谱具有一定的差异.人工种植优于野生,佳的采摘年限是8～10年.结论:SDS-PAGE电泳图谱可以对不同年限及不同种植方式的黄芪进行鉴别分析,此方法快速简便,重复性好,结果可靠.
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八角金盘不同部位蛋白的SDS-PAGE研究
目的:通过对不同部位八角金盘蛋白的SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)研究分析,根据不同部位的谱带特点和数目以及Rf值,为八角金盘的品种和质量鉴别提供新的研究方法.方法:用SDS-PAGE技术,对八角金盘的不同部位进行分析比较.结果:测定了各部位的Rf值,找出了八角金盘的特定谱带.结论:八角金盘的SDS-PAGE谱带、Rf值均有明显的区别.
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SDS-PAGE法测定红细胞膜蛋白的4种CB染色法的探讨与改进
应用SDS-PAGE法测定正常人红细胞膜蛋白成分时,对文献介绍的4种不同考马斯亮蓝染色法(CB染色法)进行染色效果探讨,并对染色条件加以改进.结果表明:改进后的CB染色方法是省时有效的方法.
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三种燕窝的真伪鉴别
为寻求其简捷、有效的质量控制方法,采用显微、紫外吸收光谱及凝胶电泳等鉴别手段,对三种商品药材燕窝进行了鉴别,效果满意.
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突触蛋白质组学分析中双向电泳技术的优化
背景:双向电泳是突触蛋白质组学分析中流行通用的蛋白质分离方法之一.但文献中突触蛋白双向电泳对线性固相pH梯度(immobilized pH gradients,IPG)胶条和十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electroph-oresis,SDS-PAGE)浓度的选择很多,尚未见统一标准.目的:对突触蛋白双向电泳的IPG胶条和SDS-PAGE凝胶浓度进行优化,以获得高质量的突触蛋白双向电泳图谱.方法:以大鼠海马突触蛋白为试材,比较pH 5.0-8.0与pH 3.0-10.0线性IPG胶条,线性与非线性pH 3.0-10.0IPG胶条,以及单一浓度10％与12％ SDS-PAGE对双向电泳的影响.此外,还使用计算机检索了1989至2013年中国知网及PubMed数据库中关于突触蛋白双向电泳的文献,对文献中选择的IPG胶条、SDS-PAGE凝胶浓度进行了统计和评价,并总结了突触蛋白在不同pH值IPG胶条和不同浓度SDS-PAGE凝胶的双向电泳图谱上的分布特征.结果与结论:结果表明,使用pH 3.0-10.0的非线性胶条及单一浓度10％ SDS-PAGE凝胶进行突触蛋白双向电泳较为适宜,电泳图谱质量好,实验操作便利;同时还推荐合并使用pH 4.0-7.0和pH 6.0-11.0的IPG胶条,以及线性梯度浓度9％-16％ SDS-PAGE凝胶,也适用于突触蛋白双向电泳分析.
