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旋毛虫肌幼虫排泄分泌物中特异性诊断抗原的研究
目的寻找旋毛虫肌幼虫排泄分泌(ES)物中的特异性诊断抗原.方法应用SDS-PAGE和Westem印迹对旋毛虫肌幼虫体外培养18、30 h后的ES抗原中的蛋白组分进行研究.结果旋毛虫肌幼虫培养18、30 h后得到的ES抗原组分大致相同,两种ES抗原中主要蛋白带的分子量为112、110、108、97、53、49、45、42、35、23和16 kDa.18h ES抗原中的102、97、95和53 kDa以及30 h ES抗原中的53、49、45和43 kDa均与并殖吸虫病、华支睾吸虫病、日本血吸虫病及囊尾蚴病患者血清发生明显的交叉反应.ES抗原中的23 kDa蛋白组分只与旋毛虫感染的大鼠、小鼠及患者血清反应,而不与上述其它寄生虫感染者、正常大鼠和小鼠及正常人血清发生交叉反应.结论旋毛虫肌幼虫ES抗原中的23 kDa蛋白组分为旋毛虫肌幼虫的特异性抗原,可用于旋毛虫病的血清学诊断及血清流行病学调查.
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用聚丙烯酰胺凝胶电泳和双向电泳分析阴道毛滴虫滋养体抗原
目的研究阴道毛滴虫滋养体可溶性抗原. 方法用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、酶联免疫电转移印迹(EITB)和双向电泳等方法,对阴道毛滴虫滋养体全虫可溶性抗原进行分析. 结果 SDS-PAGE分离出26条蛋白带,其中主带9条,分子量8条为15～62 kDa、1条为97 kDa.EITB显示24条带,仅在75 kDa和22 kDa处缺如,其中主带8条.双向电泳分离出43个多肽斑点,多分布于PI 3.65～5.84,分子量为27～＞100kDa,其中有9个主要多肽斑点. 结论阴道毛滴虫滋养体可溶性抗原26条蛋白带中,有8条蛋白含量较高、免疫学反应较强.在43个多肽斑点中有9个多肽含量明显较高.
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钉螺血淋巴细胞及其功能的研究
目的 研究获取钉螺血淋巴细胞的方法,观察其形态结构,研究其免疫等相关功能.方法 参照外周淋巴器官中淋巴细胞的悬浮收集法,获取钉螺血淋巴细胞,经Giemsa染色后显微镜观察其形态.血淋巴细胞经结晶紫染色后分别计数悬浮法、传统压片法及针刺法获取的血淋巴细胞数,并进行方差分析和Dunnett-t检验.取冻融的血淋巴细胞上清进行免疫沉淀、抑菌、吞噬杀菌实验.十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析血淋巴细胞蛋白组份相对分子质量(Mr).结果 钉螺血淋巴细胞分为圆形有丝状伪足、嗜酸性圆形无丝状伪足、嗜碱性圆形无丝状伪足和梭形细胞4种形态,平均直径依次约为10.93、6.13、6.08及11.06 μm,各约占细胞总数的50%、30%、5%及15%.每只钉螺悬浮法、传统压片法及针刺法获取的血淋巴细胞均数分别为1.50、0.66及0.03万/ml.悬浮法与传统压片法、与针刺法差异有统计学意义(F=281.47,P＜0.01).进一步Dunnett-t检验,悬浮法与压片法、与针刺法的血淋巴细胞总体均数差异有统计学意义(t1=15.67,t2=24.50,两组P＜0.01).血淋巴上清与日本血吸虫虫卵可溶性抗原(SEA)反应出现絮状沉淀,抑菌试验对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌出现明显的抑菌圈,血淋巴细胞对白色念珠菌的吞噬率和杀菌率分别为86%和46%.血淋巴细胞蛋白组份相对分子质量约为Mr 112 300、107 100、97 200、73 500、60 000及12 000.结论 悬浮法可获得大量钉螺血淋巴细胞,其具有沉淀SEA、抑制金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌生长,以及吞噬杀灭白色念珠菌等免疫功能.
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人EGFR配体结合区在Pichia酵母中的表达
目的采用基因工程方法构建基因工程菌制备人EGFR配体结合区蛋白.方法自人肿瘤细胞SK中获取人EGFR cDNA,构建pPIC9K酵母表达载体,采用Pichia酵母真核表达系统表达目的蛋白.结果 SDS-PAGE及Western-blot结果显示目的蛋白已成功表达.结论在Pichia酵母中成功表达人EGFR配体结合区蛋白.
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改良SDS-PAGE法分析尿蛋白组成
目的建立一种快速的尿蛋白组分分析方法.方法将薄层垂直平板SDS-PAGE与高敏的银染色和微波技术相结合,建立改良SDS-PAGE法,快速分析蛋白尿组成.结果此法缩短分析所需的时间,使整个分析过程在7 h内就可以完成,并且提高蛋白条带的分辨率,使检测灵敏度达ng级水平.结论改良SDS-PAGE法分析尿蛋白组成简便,快速,灵敏度高.
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旋毛虫肌幼虫特异性抗原的鉴定
目的寻找诊断旋毛虫病的特异性抗原.方法应用SDS-PAGE和Western blot对旋毛虫肌幼虫可溶性抗原中的蛋白组分进行研究.结果旋毛虫肌幼虫可溶性抗原经SDS-PAGE后显示29条蛋白带,分子量范围在112-12 kDa之间,其中65、43、42、31、30、20、17、1 6 kDa为主带.112、110、108、102、97、95、65、63、58、55、53、49、45、43、42 kDa蛋白组分与并殖吸虫感染的大鼠及患者血清、华支睾吸虫病、血吸虫病及囊尾蚴病患者血清均具有明显的交叉反应带;24-20 kDa蛋白组分只与旋毛虫感染的大鼠、小鼠及患者血清反应,而不与其它寄生虫感染的动物或患者血清、正常大鼠和小鼠及正常人血清发生交叉反应.结论旋毛虫肌幼虫可溶性抗原中24-20 kDa蛋白组分为旋毛虫肌幼虫的特异性抗原,可用于旋毛虫病的免疫学诊断及血清流行病学调查.
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半薄SDS-PAGE垂直式平板电泳法检测尿蛋白谱
蛋白尿是肾脏疾患的重要症状之一,其中蛋白的性质与构成(即尿蛋白谱)在诊断肾脏疾病及评估药物疗效等方面有着重要的参考价值.以往采用的蛋白电泳技术,如醋酸纤维薄膜、琼脂糖凝胶、免疫电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、等电聚集以及SDS-PAGE圆盘电泳等方法虽各具优点,但与临床诊断所需的大量尿标本检测,以及蛋白成分高分辨率要求相比还存在着差距.本文介绍的半薄SDS-PAGE垂直式平板电泳[2,3],并结合高敏银染[4]和激光密度扫描的方法,能够快速有效地分析尿液中蛋白质成分.
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家蚕的蜕皮激素受体和超气门蛋白在大肠杆菌中的共表达和纯化
构建蜕皮激素受体(Ecdysteroid receptor,EcR)和超气门蛋白(Ultraspiracle,USP)的表达载体,使两者在大肠杆菌内高效共表达,获得具有活性的目的蛋白,即EcR和USP的复合蛋白(EcR-USP).将N端带有6×His tag的EcR目的基因片段克隆于pET21bMDX12(+)载体内,将N端带有6×His tag的USP目的基因片段克隆于pET28a(+)载体内,并将两个重组质粒同时转化入同一宿主菌BL21(DE3)内利用IPTG低温诱导双基因共表达,选用“超声破碎法”提取共表达蛋白,色谱柱纯化,SDS-PAGE和Western Blot分析纯化结果,MicroCal iTC200法与小分子化合物20-羟基蜕皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)相互作用进行活性分析.SDS-PAGE与Western Blot分析结果显示宿主菌中表达产物存在蛋白复合体,大小与预期相符,MicroCal iTC200实验显示EcR-USP与20E有结合,即EcR-USP有活性.得到有活性的家蚕的EcR-USP的可溶性表达产物,为进一步对其进行结构与功能的研究奠定了基础.
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溶栓素的分离纯化及特性测定
目的研究一种高效分离纯化溶栓素的方法并测定其pI和相对分子质量(Mr).方法采用阴、阳离子交换色谱等技术分离纯化溶栓素并通过对缓冲体系的pH值、离子强度的调节及对初始供试品pH值的调节来优化纯化过程,以等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶电泳(IEF-PAGE)和SDS-PHGE方法分别测定纯品的pI和Mr.结果溶栓素达到简捷、高效分离纯化的目的,电泳鉴定为一条蛋白质带,并测定溶栓素的pI为4.50、Mr为35 100.结论溶栓素的纯化工艺达到高纯度纯化程度,为进一步研究溶栓素奠定了基础.
关键词： 溶栓素 等电点 等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-PAGE 色谱 -
大鼠损伤神经组织中Tropic 1808基因相关蛋白的亲和层析法纯化
目的:纯化大鼠损伤坐骨神经组织中Tropic 1808基因特异表达的蛋白.方法:将Tropic 1808基因重组蛋白的单克隆抗体与CNBr-activated Sepharose 4B交联,用亲和层析的方法,提取在大鼠损伤坐骨神经组织中Tropic 1808基因特异表达的蛋白,并将纯化的蛋白进行SDS-PAGE分析.结果:(1)经层析系统紫外检测,亲和层析后洗脱,在280nm波长处获得两个不同的紫外吸收峰.(2)亲和层析的洗脱液,经冷冻浓缩,SDS-PAGE分析,出现43.0kDa、32.0kDa、31.0kDa和14.4kDa蛋白条带,其中在32.0kDa的蛋白条带与预期的Tropic 1808基因在组织中的编码蛋白基本相符,而43.0kDa、31.0kDa 、14.4kDa蛋白,预测为Tropic 1808基因在大鼠损伤坐骨神经组织中表达的相关蛋白.结论:用亲和层析的方法,获得了大鼠损伤坐骨神经组织中Tropic 1808基因特异表达的相关蛋白,为进一步研究其结构和功能提供了实验依据.
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重组人血管内皮生长因子165在Pichia酵母中的表达
目的:采用基因工程方法构建基因工程菌制备人VEGF165蛋白.方法:自人肿瘤组织中获取人VEGF165 cDNA,构建pPIC9K酵母表达载体,采用Pichia酵母真核表达系统表达目的蛋白.结果:SDS-PAGE及Western-blot结果显示目的蛋白已成功表达.结论:在Pichia酵母中成功表达人VEGF165.
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人精子膜抗原的提取及分析
目的:用两种酶裂解法提取精子膜抗原并对其进行蛋白浓度测定和成分分析.方法:分别用尿素裂解液和表面活性剂Triton X-100﹑脱氧胆酸钠(DOC) 的TDOC裂解液裂解液提取精子膜抗原,借助BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度,并通过SDS-PAGE法比较分析蛋白成分.结果:两种方法提取的精子膜抗原经SDS-PAGE,考马斯亮蓝染色后均有条带显示,TDOC裂解液提取的样本中显示仅有一条蛋白带,分子质量集中在100 ku左右,尿素裂解液提取的样本中有多条蛋白条带,分子质量集中在130～35 ku.结论:尿素裂解液提取法提取精子膜抗原的效果优于TDOC裂解液提取法,为抗精子相关抗体的研究提供了条件.
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田鼠巴贝虫可溶性抗原组分分析及其初步应用
目的 分析田鼠巴贝虫可溶性抗原,寻找可用于免疫诊断的有效抗原组分.方法 用田鼠巴贝虫感染BALB/c小鼠,待虫血症达高峰期时,收集田鼠巴贝虫虫体;采用超声法制备可溶性粗抗原(soluble babesia antigens,SBA)并包板,ELISA检测血清特异性IgG,评价SBA的免疫反应性、交叉反应性和特异性;以SDS-PAGE电泳分析SBA组分,并进行Western Blot,分析其与感染鼠血清的反应性.结果 SBA-ELISA法可检测早期感染(7 d)小鼠血清,且与恶性疟、间日疟弓形虫病阳性血清无交叉反应,显示出其较好的诊断敏感性和较高的特异性.通过SDS-PAGE分析,获得5条分子质量为72、66、60、53、43 kDa的主蛋白带和介于14.4～116 kDa的7条次带.经Western Blot分析,SBA有15个抗原组分能被阳性小鼠血清识别,以72、53、43、39、30 kDa蛋白组分反应较强.结论 以SBA建立的间接ELISA可用于巴贝虫感染的有效筛查工具;田鼠巴贝虫可溶性抗原组分中72、53、43、39、30KDa为比较理想的抗原组分.
关键词： 田鼠巴贝虫 可溶性抗原 SDS-PAGE Western bolt ELISA -
旋毛虫与伪旋毛虫肌幼虫抗原的SDS-PAGE和双向电泳分析
目的 鉴定旋毛虫(Trichinella spiralis,T1)与伪旋毛虫(T. pseudospiralis,T4)肌幼虫的差异蛋白.方法 应用SDS-PAGE和双向电泳(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)对T1、T4肌幼虫的可溶性抗原与培养24 h的ES抗原的蛋白组分进行分析.结果 SDS-PAGE显示,T1肌幼虫可溶性抗原有22条蛋白带(221.62 kDa~14.88 kDa),其中6条为T1特异性蛋白带(59.72、44.37、23.66、22.36、18.26、16.34 kDa);T4可溶性抗原蛋白有18条带(185.28 kDa~14.27 kDa),其中4条为T4特异性蛋白带(132.60、119.30、35.26、31.02 kDa).T1的ES抗原有10条蛋白带(113.21 kDa~14.37 kDa),T4的ES抗原有9条蛋白带(104.71 kDa~14.51 kDa),T1、T4肌幼虫ES抗原的蛋白带均不相同.2-DE显示,T1可溶性抗原有193±12个蛋白点,分子量主要为11 kDa ~22 kDa、25 kDa ~64 kDa及100 kDa ~144 kDa,所对应的等电点(pI)分别为4.7~8.2、4.5~6.5及5~7;T4可溶性抗原有175±9个蛋白点,分子量主要为12 kDa ~21 kDa及25 kDa ~90 kDa,所对应的pI分别为4~9.5与4.5~9.6.T1的ES抗原具有82±6个蛋白点,分子量主要为13 kDa ~16 kDa、18 kDa ~22 kDa及40 kDa ~55 kDa,所对应的pI分别为4~7、3.8~6.2及5~9;T4的ES抗原具有69±5个蛋白点,分子量主要为10 kDa ~15 kDa、17 kDa ~25 kDa及29 kDa ~55 kDa,所对应的pI分别为4.7~6.5、4.6~6及5~7.结论 旋毛虫肌幼虫可溶性抗原及ES抗原的蛋白组分与伪旋毛虫的明显不同.
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美洲大蠊特异性抗原的蛋白印迹分析
目的 探讨美洲大蠊不同时期抗原成份分析以及特异性抗原组分鉴定.方法 本文通过采用Coca's提取液提取得到美洲大蠊粗浸液抗原,通过饱和(NH4)2SO4沉淀以及十二烷基磺酸钠聚丙酰胺凝胶电泳(SDS-PASE),对其抗原成份进行分析,并选用对蟑螂过敏性疾病患者阳性血清进行免疫印迹试验(Western-blotting).结果 美洲大蠊成虫、若虫、幼虫、虫卵生活史不同时期及不同部位抗原各有不同数量的蛋白条带,但生活史各阶段均出现6条蛋白主带,分别为:92、78、66、56、52和40kD,免疫印迹显示其92、78、49和26kD为美洲大蠊成虫特异性变应原,其中78kD是主要变应原.结论 美洲大蠊78kD蛋白为主要变应原,92、49和26kD为次要变应原,本研究为蟑螂变应原诊断试剂和疫苗的研制奠定了基础.
关键词： 美洲大蠊 抗原 SDS-PAGE Western-blotting -
抗弓形虫特异性鸡卵黄抗体的制备与鉴定
目的制备高效价特异性鸡卵黄免疫球蛋白(yolk immunogl obu lin,IgY)抗体,为弓形虫病防治的研究探索新的方法和途径;方法用提纯的弓形虫RH株抗原免疫育龄种鸡,获取大量含高效价IgY的卵黄,经水稀释法初步纯化浓缩后,用ELISA检定其免疫学活性,应用SDS-PAGE分析、鉴定IgY的分子基础;结果获得ELISA效价为1×107的抗弓形虫IgY抗体,经SDS-PAGE分析,出现1条蛋白带 ,其分子量大小根据电泳迁移率计算,初步鉴定为46kDa用弓形虫抗原免疫Lyhern种鸡制备的IgY抗体效价高、特异性强;水稀释法初步提纯获得的IgY抗体分子量为46kDa,为在弓形虫病的特异性免疫学诊断、预防和治疗中的应用奠定基础.
关键词： 弓形虫 鸡卵黄免疫球蛋白(IgY) SDS-PAGE -
江西南昌郊区松树花粉过敏原的分离与鉴定
目的：对江西南昌郊区松树花粉的变应原组分进行分离及免疫学鉴定。方法提取松树花粉粗提液，然后通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对松树花粉的蛋白质组分进行分离并测定其分子量，采用免疫印迹(West-ern-blotting)法鉴定其变应原成分。结果松树花粉粗提液有10余条蛋白带，其中分子量为12kD、26kD和100kD的蛋白可与松树花粉过敏性病人血清IgE 结合，其中26kD为主要变应原。结论对松树花粉变应原进行了初步的分离、鉴定，为进一步对松树花粉变态反应性疾病的临床诊断和治疗提供初步的实验基础。
关键词： 松树花粉 变应原 SDS-PAGE Western-blotting -
蛋白质凝胶电泳银染色法的改进
目的探索一种快速、灵敏的蛋白质凝胶电泳银染色方法.方法对蛋白质凝胶电泳银染色过程中的多种因素进行了实验探索,在此基础上探索出一种改良的蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳银染色法.结果改进方法灵敏度为Coomassie Brilliant Blue R-250法的100倍以上,对牛血清白蛋白的检测限在0.5ng以下,整个染色过程不超过60min,染色重复性好.结论改进后的方法比以前使用的方法简便、快速、灵敏、成本相对低廉.
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野生全蝎粉可溶性蛋白质SDS-PAGE电泳分析研究
目的:探索野生全蝎粉水溶性蛋白质SDS-PAGE电泳的佳分离条件,测定各蛋白质的大体分子量.方法:采用55％乙醇提取,75％以上乙醇沉淀的方法获得全蝎粉水溶性蛋白质,考马斯亮蓝法测定其蛋白质含量,SDS-PAGE法和Quantity one软件测定全蝎粉水溶性蛋白质的相对分子量.结果:全蝎粉水溶性蛋白质的含量为4.649 mg/mL;得到较好全蝎粉可溶性蛋白质的7条电泳谱带,相对分子质量分别为70.447,64.730,54.139,40.832,29.939,26.494,19.172 kDa.结论:这7条全蝎粉水溶性蛋白质的特征谱带可用于全蝎粉水溶性蛋白质的种类鉴别.
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四种产地全蝎粉可溶性蛋白质SDS-PAGE法分离研究
目的:探索四种产地野生全蝎粉中可溶性蛋白质SDS-PAGE法所获得电泳图谱条带的一致性,并确定其大致分子量.方法:采用55％乙醇提取、75％以上乙醇沉淀的方法获得全蝎粉可溶性蛋白质,考马斯亮蓝法测定其蛋白质含量,SDS-PAGE法和Quantity one软件测定全蝎粉可溶性蛋白质的相对分子量.结果:山东平邑、山东龙口、山东长清、山东沂源四种产地全蝎粉的水溶性蛋白饱和溶液中的蛋白含量分别为4.006,2.894,3.795,4.649mg/mL；四种产地全蝎粉可溶性蛋白质通过SDS-PAGE法均获得了7条较清晰的电泳谱带,对应的相对分子量分别为42.563,33.938,27.060,22.354,19.402,3.422,1.929 KDa.结论:这7条全蝎可溶性蛋白质的特征谱带可用于中药全蝎粉的真伪鉴别.
