改进的一维二维电泳法分析疟原虫子孢子蛋白质的差异表达

目的建立及优化一维和二维凝胶电泳技术显示不同时期约氏疟原虫子孢子的蛋白差异表达的实验条件,为进一步研究疟原虫具有感染性的唾液腺子孢子和不具感染性的卵囊成熟子孢子间的差异表达蛋白研究奠定基础.方法采用优化的蛋白质抽提试剂、方法分别获得疟原虫具有感染性的唾液腺子孢子和不具感染性的卵囊成熟子孢子蛋白.采用一维和二维蛋白电泳技术对不同时期约氏疟原虫子孢子蛋白进行分析比较,建立约氏疟原虫子孢子蛋白质一维、二维电泳图谱.结果采用一维和二维蛋白电泳技术能够有效显示疟原虫具有感染性的唾液腺子孢子和不具感染性的卵囊成熟子孢子蛋白,为以后进一步研究子孢子侵入相关蛋白,进行功能学的分析奠定基础.结论所采用的一维和二维蛋白电泳相结合的方法对分离斯氏按蚊中约氏疟原虫唾液腺子孢子和卵囊成熟子孢子蛋白质具有较好的重复性和分辨率.

抗旋毛虫鸡卵黄抗体的制备与鉴定

[目的]制备高效价特异性鸡卵黄免疫球蛋白(immunoglobulin of yolk,IgY).[方法]用纯化的旋毛虫幼虫抗原免疫育龄种鸡,经水稀释法初步纯化浓缩后,用ELISA鉴定其免疫学活性,测定纯化后蛋白含量,并用SDS-PAGE进行分析鉴定.[结果]获得ELISA效价为1×106的抗旋毛虫卵黄抗体,蛋白含量为9.67 mg/ml.经SDS-PAGE分析,出现2条蛋白带,纯度达到88%以上.[结论]用旋毛虫抗原加弗氏佐剂免疫种鸡制备的卵黄抗体产量大、效价高,这种抗体可进一步用于旋毛虫感染的研究.

结核分支杆菌MPT83蛋白基因在大肠杆菌表达载体中的克隆、表达与鉴定

[目的]从分支杆菌培养物中提取DNA,扩增结核分支杆菌MPT83蛋白基因,并在大肠杆菌中进行表达、克隆和鉴定. [方法]从分支杆菌培养物中提取总DNA,扩增MPT83因并克隆入T载体,将目的基因插入表达载体pET-32a(+)中,转化BL21宿主菌,IPTG诱导表达构建的表达质粒pET-MPT83经PCR和BamHⅠ+HindⅢ双酶切进行鉴定. [结果]经SDS-PAGE分析,在约42 ku处出现新的蛋白条带,5 h后表达量即达到高峰;Western blotting分析表明,融合蛋白能够被分支杆菌阳性血清所识别;纯化的表达蛋白经SDS-PAGE电泳,出现清晰的单一条带.表明MPT83基因原核表达载体构建成功. [结论]结核分支杆菌MPT83蛋白基因在大肠杆菌表达载体中的克隆、表达与鉴定,为结核病的诊断以及亚单位疫苗、核酸疫苗的制备和应用奠定基础.

斑节对虾过敏原的分离、鉴定与纯化

目的 对斑节对虾的主要过敏原进行分析、鉴定与纯化.方法 通过SDS-PAGE电泳分离斑节对虾的蛋白质组份,采用免疫印迹(Western-blotting)方法鉴定过敏原,通过离子交换层析对斑节对虾主要过敏原进行初步纯化.结果 斑节对虾粗提液SDS-PAGE显示其主要蛋白条带主要有7条,Western-blotting显示对斑节对虾过敏患者的阳性混合血清能与7个蛋白条带起反应,相对分子质量分别为71 000、43 000、34 000、23 000、21 000、20 000和19 000,离子交换层析可初步纯化出相对分子质量为34000和21 000的过敏原蛋白.结论本实验对斑节对虾过敏原进行了分离和鉴定,并初步纯化出斑节对虾的主要过敏原.

方斑东风螺过敏原的分离、鉴定与纯化

目的 对方斑东风螺的主要过敏原进行分析、鉴定与纯化.方法 通过SDS-PAGE电泳分离方斑东风螺的蛋白质组份,采用免疫印迹(Western-blotting)方法 鉴定过敏原,通过离子交换层析对方斑东风螺主要过敏原进行初步纯化.结果 方斑东风螺粗提液SDS-PAGE显示其主要蛋白条带主要有7条,Western-blotting显示过敏患者的阳性混合血清能与其中3个蛋白条带起反应,相对分子质量分别是56 000、28 000和22 000.离子交换层析可初步纯化出28 000和22 000的过敏原蛋白.结论 本实验对方斑东风螺过敏原进行了分离和鉴定,并初步纯化出方斑东风螺的主要过敏原.

艾蒿、青蒿花粉变应原组分的研究

目的对艾蒿、青蒿花粉变应原进行分离、鉴定.方法采用不同的提取方式得到艾蒿、青蒿花粉的粗浸液,通过饱和(NH4)2SO4分级沉淀、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质组分,并用凝胶成像系统测定各组分的相对分子质量(Mr);采用Western-blotting鉴定2种花粉的主要及次要变应原.结果艾蒿、青蒿花粉分别分离到二十和十多种蛋白质组分.其中艾蒿花粉的组分中有9种蛋白能与患者血清中蒿属花粉特异性IgE结合,Mr为62000、43 000、38 000的蛋白条带的结合率高.青蒿花粉的组分中有11种蛋白能与患者血清中蒿属花粉特异性IgE结合,Mr为43000、38 000的蛋白条带结合率高.结论艾蒿花粉的主要变应原Mr分别为62 000、43000和38 000,青蒿花粉的主要变应原Mr分别为43000和38 000;2种花粉变应原组分存在很大相似性,但也有各自特异的变应原组分.

hBDNF基因原核表达重组质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

我们按照hBDNF基因全长编码序列设计合成引物，从人基因组DNA中扩增 出76 0bp的片段，反向插入到pGEM-3Zf（+）载体上，获得pGEMBF18克隆，限制性酶分析和DNA序 列测定均证实该克隆插入片段为hBDNF基因全长编码序列。从pGEMBF18克隆中获取hBDNF全长 编码片段，与原核表达载体pGEX-5T连接，构建了p5TBF34原核表达重组质粒。重组质粒转 化大肠杆菌JM109，经IPTG诱导表达，SDS-PAGE特异区带分子量为43kDa，此重组蛋白占菌 体可溶性蛋白总量的7.53%, Western杂交证实该特异区带具hBDNF抗原活性。

人红细胞内血红蛋白与硫氧还蛋白过氧化物酶2的相互作用

目的 研究人红细胞内硫氧还蛋白过氧化物酶2(Prx2)与血红蛋白(Hb)的相互作用.方法 首先利用红细胞Hb再释放试验分离红细胞和溶血液电泳释放的4个区带,即HbA、HbA2、HbA与HbA2之间(HbA-A2)及再释放Hb,将这些区带分别切下,通过反复冻融获得各区带所合蛋白;用葡聚糖G-25浓缩后再利用SDS-PAGE分离各区带所含蛋白组分,并用抗-Prx2做免疫印迹分析;后用微量热泳动试验(MST)分别检测Prx2蛋白与HbA和HbA2之间的结合常数.结果 红细胞电泳释放的区带HbA、HbA2、HbA-A2及再释放Hb中均有Prx2;而溶血液电泳释放的Hb区带中,除HbA2外其余各Hb区带中均有Prx2.MST检测显示,Prx2蛋白与HbA的结合常数(Kd值)为(14±1.08) μmol/L,而与HbA2之间的Kd值未被检测到.结论 Prx2与HbA之间存在相互作用,但与HbA2之间可能没有相互作用.

HPV16 E7蛋白编码基因原核表达与鉴定

目的研究HPV16 E7蛋白的生物学特性及其细胞转化机制,对HPV16 E7蛋白原核表达质粒进行构建、表达和鉴定.方法以临床确诊的HPV16感染患者子宫颈细胞DNA为模板,采用PCR方法扩增HPV16 E7基因,经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后插入相同酶切pET32a(+)载体,转化JM109感受态细胞,并进行阳性克隆筛选.经IPTG对重组质粒进行蛋白诱导表达,SDS-PAGE和Western blot检测目标蛋白表达情况.结果成功构建了原核表达质粒pET32/E7, HPV16 E7-TRX融合蛋白在BL21(DE3)菌株中高效表达,在1 mmol/L IPTG、30 ℃诱导条件下融合蛋白表达量占菌体总蛋白的30%左右.结论 pET32/E7原核表达质粒的构建、HPV16 E7融合蛋白的表达为进一步深入研究HPV16E7蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用机制奠定了基础.

新城疫病毒的制备纯化与初步鉴定

目的 获得纯化的新城疲病毒,为下一步病毒的应用打下基础.方法 利用传统鸡胚培养方法制备新城疫病毒(NDV),通过PEG-6000沉淀,差速离心和蔗糖密度梯度离心等方法提取纯化了新城疫病毒(NDV),以血凝实验微量法测定其滴度和活性.用电镜及SDS-PAGE方法对纯化病毒进行鉴定.结果 纯化病毒经磷鸽酸复染后电镜现察,能看到典型病毒颗粒,SDS-PAGE电泳显示有较纯的蛋白条带.结论 病毒纯化效果较好,为我们下一步病毒的功能研究及其应用打下了坚实的基础.

斯氏狸殖吸虫成虫抗原蛋白的分析研究

目的 分析斯氏狸殖吸虫成虫蛋白抗原及不同缓冲液制备抗原的比较.方法用不同缓冲液制备斯氏狸殖吸虫成虫粗制抗原,并用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法对其蛋白组分进行分析.结果斯氏狸殖吸虫成虫蛋白抗原共有13条蛋白带,其中有6条带染色较深,也较宽,分子量各为64KDa,56KDa,46KDa,30KDa,26KDa,22KDa.不同缓冲液制备的斯氏狸殖吸虫成虫抗原,经SDS-PAGE后其蛋白图谱完全一致.结论斯氏狸殖吸虫成虫蛋白抗原分子量主要集中在70 KDa以下.不同样品缓冲液制备的抗原在应用于SDS-PAGE时不影响其蛋白分辨率.

人肝癌组织中p53与HSP70相互作用的初步研究

目的:探讨人肝癌中热休克蛋白70(HSP70)与p53的相互作用. 方法:用免疫组织化学染色法,从12例肝癌组织中筛选HSP70与p53均呈阳性表达的标本,并以免疫共沉淀法提取之. 然后用SDS-PAGE及Western blot分析双阳性标本中两种蛋白的存在形式. 结果:用免疫组织化学法检测到12例肝癌组织中有3例为双阳性,用抗HSP70 mAb免疫共沉淀的样品,可检测到p53蛋白.用抗p53 mAb免疫共沉淀的样品也可检测到HSP70蛋白. 结论:人肝癌中p53与HSP70以复合物的形式而存在,此可为肝癌的发病机制及免疫治疗的研究提供新的思路.

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化的微量蛋白制备抗血清

目的以SDS-PAGE纯化的微量蛋白制备抗人层粘连蛋白受体前体蛋白(LRP)的血清.方法以SDS-PAGE分离纯化原核表达的人LRP与6×组氨酸的融合蛋白, 切下并粉碎融合蛋白所在凝胶块.将含10 μg融合蛋白的凝胶颗粒与弗氏佐剂混匀后, 免疫BALB/c小鼠.以Western blot检测所获抗血清的滴度和特异性.结果以胃癌细胞总蛋白为靶抗原时, Western blot显示, 所获抗血清仅识别1条Mr约42 000的蛋白带, 将抗血清做1∶ 2 000稀释后, 仍能清晰地显示其靶抗原所在位置.结论以聚丙烯酰胺凝胶颗粒为载体, 用微量蛋白即可成功地制备抗血清.

Tris-SDS-PAGE测定多肽的相对分子质量

蔗糖-SDS-PAGE测定多肽的相对分子质量

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是测定蛋白质相对分子质量(Mr)常用的方法，尤其在低Mr蛋白质(10 000～100 000)测定中得到广泛应用；而对小分子多肽Mr的测定目前主要采用甘油SDS-PAGE法〔1,2〕和脲SDS-PAGE法〔3〕。这些方法操作繁琐、结果也不够理想。我们在多次实验的基础上，建立了用蔗糖-SDS-PAGE两层胶系统测定多肽(Mr为2 500～17 000)的新方法。

微波技术在尿蛋白谱检测中的应用

蛋白尿是肾脏疾病的一个重要症状,其性质和组成(尿蛋白谱)是肾脏疾病诊断和治疗方案选择的重要参考指标之一[1].

以蛋白SDS-PAGE图谱为依据的致病性暗色丝孢科真菌系谱学研究

目的研究对人类致病的主要暗色丝孢科真菌裴氏着色霉、紧密着色霉、疣状瓶霉、皮炎瓶霉、卡氏枝孢霉、甄氏外瓶霉间的系谱格局.方法采用薄层扫描方法对上述6种30株重要致病性暗丝孢科真菌可溶性全细胞蛋白单向SDS-PAGE图谱结合基型趋异方法进行分析.结果得出其系谱格局为 {[P. verrucosa (F. pedrosoi F. compacta) ]W. dermatitidis[E. jeanselmei C. carrionii]}.结论显示(F. pedrosoi 和F. compacta,E. jeanselmei和C. carrionii,以及Fonsecaea 和Phialophora之间有密切关系.

黑色普氏菌与血红蛋白结合的特点及其血红蛋白结合蛋白的鉴定

目的:观察黑色普氏菌与血红蛋白结合的特点并鉴定血红蛋白结合蛋白.方法:采用斑点印迹法观察黑色普氏菌的血红蛋白结合特点,利用SDS-PAGE及Western blot法鉴定血红蛋白结合蛋白.结果: 热及胰蛋白酶预处理细菌使血红蛋白结合能力分别降低68%和35%,珠蛋白的抑制率为81%,乳铁蛋白部分抑制血红蛋白结合,转铁蛋白、细胞色素C和过氧化物酶对血红蛋白的结合皆无抑制作用.Western blot结果显示,相对分子量Mr为4.1×104,5.6×104和5.9×104的膜蛋白能与血红蛋白反应.结论:4.1×104,5.6×104和5.9×104的细胞膜蛋白可能参与了黑色普氏菌与血红蛋白的结合.

聚丙烯酰胺凝胶电泳中LPS样品制备方法的改进

为了对革兰阴性细菌的LPS进行快速分析,观察LPS的产量、分子量分布,进行菌种筛选和抗原传代稳定性研究,实验中对热酚法、酶水解法、冷酚法三种制备LPS的方法进行了比较.结果证明,改进的水饱和冷酚LPS提取方法,需要时间短、经济、方便,只须几个细菌菌落就可以提取LPS进行SDS-PAGE电泳分析,说明该方法有很好的实用性.

甲型 H1N1流感疫苗神经氨酸酶含量测定参考品的建立

目的：建立甲型 H1N1流感疫苗神经氨酸酶含量测定参考品。方法对甲型 H1N1流感疫苗原液进行还原电泳后，采用免疫印迹，糖蛋白染色，方法初步确定甲流 H1N1疫苗原液中神经氨酸酶 SDS-PAGE 条带位置，切取条带后通过 edman N 端测序法进行确认。采用 Lowry 法进行总蛋白定量，SDS-PAGE 密度扫描的方法确定神经氨酸酶比例，计算出疫苗原液中神经氨酸酶含量。结果确定甲流疫苗原液中神经氨酸酶在 SDS-PAGE 中相对分子质量约71000，对多批次疫苗原液进行测定后，选取神经氨酸酶含量较高的批次进行测定，总蛋白质量浓度为1046．00μg／mL，神经氨酸酶质量分数11．78％。二者相乘得出该批次疫苗原液神经氨酸酶含量为123．22μg／mL。结论研究成功建立了甲型 H1N1流感疫苗神经氨酸酶含量测定参考品，其他毒株生产的流感疫苗也可以参考该方法建立 NA 含量测定参考品。