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人脑源性神经生长因子(hBDNF)基因在CHO细胞的稳定表达及功能研究
目的 将人脑源性神经生长因子(hBDNF)基因转染CHO细胞后,建立稳定表达体系,并检测培养上清中所表达的hBDNF的生物学活性.方法 采用脂质体介导的真核细胞转染,运用RT-PCR,Western blot及MTT法进行检测分析.结果 转染hBDNF基因的CHO细胞可表达hBDNF mRNA,上清中可检出hBDNF蛋白的存在,且此上清具有促进PC12细胞生长和分化的功能.结论 成功地建立了hBDNF在CHO细胞中的稳定表达体系,转染hBDNF基因的CHO细胞所分泌的hBDNF蛋白具有较高的生物学活性,为进一步研究BDNF的生物学功能和开展生物治疗奠定了实验基础.
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hBDNF基因在成纤维细胞中的异位表达
将hBDNF全长编码序列插入人I型胶原基因(Colia1)增强子-启动子调节序列之下,构建了含Colia1-BDNF微基因的重组体pSCEPBFCAT, 并转染人胚肌腱成纤维细胞.成功地利用了Colia1基因调控元件介导BDNF基因在成纤维细胞中异位表达,SDS-PAGE显示表达产物分子量为27 kDa,免疫斑点杂交、Elisa和Western杂交证实该表达产物具有BDNF抗原活性.
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hBDNF基因原核表达重组质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达
我们按照hBDNF基因全长编码序列设计合成引物，从人基因组DNA中扩增 出76 0bp的片段，反向插入到pGEM-3Zf（+）载体上，获得pGEMBF18克隆，限制性酶分析和DNA序 列测定均证实该克隆插入片段为hBDNF基因全长编码序列。从pGEMBF18克隆中获取hBDNF全长 编码片段，与原核表达载体pGEX-5T连接，构建了p5TBF34原核表达重组质粒。重组质粒转 化大肠杆菌JM109，经IPTG诱导表达，SDS-PAGE特异区带分子量为43kDa，此重组蛋白占菌 体可溶性蛋白总量的7.53%, Western杂交证实该特异区带具hBDNF抗原活性。
