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MDM2和MDM4对P53调控研究进展
P53蛋白是DNA损伤的关键调节因子,对P53的严格调控是哺乳动物细胞存活所必须的,P53过多表达或不当的激活使细胞死亡,而表达减少或失活则导致肿瘤的发生.编码P53的基因在肿瘤中常发生突变或缺失,分别在1980年和1990年发现的鼠双微基因MDM2和MDM4在许多肿瘤中扩增和过表达,并可导致P53蛋白的失活[1].通过与P53相互作用对其发挥调节作用的蛋白超过160种,几乎每月都会发现一种新的P53调节蛋白.而MDM2和MDM4不仅在肿瘤中表达经常发生变化,在胚胎发育过程中也对P53发挥特异性的抑制作用[2].因此进行MDM2和MDM4对P53调控的研究,具有重要的病理生理意义.
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产生人抗体的转基因和转染色体动物研究进展
鼠单克隆抗体应用于临床的弊端是它具有免疫原性,可行的办法是将鼠单克隆抗体人源化.抗体人源化的过程已由鼠嵌合抗体发展到了转基因动物表达完全人抗体阶段,表达完全人抗体的转基因动物有鼠、牛等.文中介绍了这些转基因动物的构建特点及这两种动物表达的人单克隆抗体和人多隆抗体的应用意义.
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NT4-TAT-6×His-VHLβ结构域肾癌抑制融合肽cDNA克隆的构建
目的 构建VHL蛋白(von Hippel-Lindau protein,pVHL)β结构域肾癌抑制融合肽cDNA,并将其应用于肾癌的微基因治疗.方法 分别设计合成pVHLβ结构域104-123短肽cDNA的正向和反向引物以及编码TAT-6×His cDNA的正、反向引物,使用互为引物模板PCR方法,扩增获得具有Nae Ⅰ/Eco 72I酶识别位点的TAT-6×His cDNA片段和具有Eco 72I/Bam H I酶识别位点的VHLβ抑制肽cDNA片段,将两个片段分别克隆到pGEM-T easy中,使用双脱氧终止法测序,通过DNASIS软件分析同数据库资料一致性和编码的氨基酸序列.用Nae I和BamH I双酶切获取的TAT-6×His-VHLβcDNA片段插入到具有NT4信号肽的pBV220载体中,构建了pBV220-NT4-TAT-6×His-VHLβ质粒.结果 经DNA测序证实,获得了编码TAT-6×His cDNA片段和编码VHLβ抑制肽的cDNA片段,分析证实核酸序列和推导的氨基酸同数据库资料一致.重组质粒pBV220-NT4-TAT-6×His-VHLβ酶切图谱证实已将NT4-TAT-6×His-VHLβ融合肽cDNA克隆到pBV220原核表达载体中.结论 成功扩增了编码TAT膜渗透肽和6×His标签肽以及VHL抑癌基因β结构域肾癌抑制肽的cDNA片段,构建了具有NT4信号肽的TAT-6×His-VHLβ融合肽cDNA.
关键词： VHLβ结构域肾癌抑制肽 融合肽 微基因 肾肿瘤 -
前列腺癌根治术后生化复发与 p53 codon 72 的相关性
p53 codon 72多态性与肺癌、食管癌、肝癌、宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤相关,而鼠双微基因2( MDM2)309多态性与食管癌、肺癌、贲门癌、鼻咽癌易感性相关.Morote等[1]研究结果显示KLK2、硫酸转移酶-A1(SULT1A1)和Toll样受体4(TLR4)基因多态性可以用于前列腺根治术后生化复发的预测.本研究旨在观察这些基因多态性对前列腺癌根治术后的生化复发是否有潜在的预测作用.
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人脑髓鞘碱性蛋白对H2O2诱导人肺癌细胞YTLMC-90凋亡的抑制作用
背景与目的:人脑髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)广泛分布于神经系统及多种非神经组织之中,而且在肺癌、乳腺癌、神经胶质瘤等多种肿瘤细胞中均检查到MBP的表达.但MBP与癌细胞侵犯神经组织的活性是否相关、与肺癌细胞的生物学行为是否相关尚未见报道.本研究主要探讨MBP对过氧化氢(H2O2)诱导人肺癌细胞YTLMC-90凋亡的影响.方法:实验分为MBP cDNA微基因pSVCEPMBPCAT转染组(试验组)、空质粒pSVCEPCAT转染组和未转染组(对照组).将含人Ⅰ型胶原a1链(COL Ⅰ A1)基因启动子和增强子元件、并在其3端接MBP cDNA的微基因,转染YTLMC-90细胞,并驱动MBP异位表达;采用MTF法检测细胞增殖,吖啶橙荧光染色显微镜和电镜观察细胞形态及其超微结构的改变;琼脂糖凝胶电泳检测染色质DNA断裂.结果:200 μmol/L H2O2作用24 h后,转染组、未转染组和空载体pSVCEPCAT转染组YTLMC-90细胞的生长抑制率分别为36.67%、84.00%和78.67%(P＜0.001);对照组YTLMC-90细胞普遍可见凋亡细胞特有的形态学及生物化学改变,如胞核固缩、染色质断裂,DNA电泳呈梯状条带;而MBP cDNA微基因转染的YTLMC-90细胞未发现上述凋亡特征.结论:MBP促进YTLMC-90细胞增殖和拮抗H2O2诱导的凋亡,明显减少H2O2对YTLMC-90的细胞毒作用.
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BDNF对H2O2诱导人肺癌细胞YTMLC-90凋亡的抑制效应
背景与目的:已证实在神经系统内外多种细胞中均可合成神经营养因子,如神经生长因子(nerve growth factor,NGF)、脑源性神经营养因子(brain derivedneurotrophic factor,BDNF)和神经营养素3/4(NT-3/4).这些神经营养因子不仅能促进神经细胞的存活、增殖和凋亡,也与癌细胞侵犯神经组织的活性有关;但BDNF与肺癌细胞的生物学行为是否相关尚未见报道.本文旨在研究BDNF对过氧化氢(H2O2)诱导人肺癌细胞YTMLC-90凋亡的作用.方法:用含人Ⅰ型胶原al链(COLIA1)基因启动子和增强子元件及在其3′端接BDNF cDNA的微基因pSVCEPBFCAT,转染人肺癌细胞YTMLC-90并驱动BDNF异位表达,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)显色法检测细胞增殖,吖啶橙荧光染色显微镜和电镜观察细胞形态及其超微结构的改变,琼脂糖凝胶电泳检测染色质DNA断裂.结果:经200 μmol/L H2O2作用24 h,转染pSVCEPBFCAT的YTMLC-90细胞生长抑制率为30.0%,而未转染YTMLC-90和转染空载体pSVCEPCAT的YTMLC-90细胞生长抑制率分别为84.60%和80.00%,实验组与两个对照组之间的差异均有显著性(P＜0.01);对照组YTMLC-90细胞可见凋亡特有的形态学及生物化学改变,如胞浆和核固缩、染色质断裂、DNA电泳呈梯状条带,而转染pSVCEPBFCAT的YTMLC-90细胞未发现上述凋亡特征.结论:BDNF促进YTMLC-90细胞增殖和拮抗H2O2诱导凋亡,抑制H2O2对人肺癌细胞YTMLC-90的细胞毒性.
关键词： 脑源性神经营养因子 微基因 过氧化氢 人肺癌细胞系YTMLC-90 凋亡 -
hBDNF基因在成纤维细胞中的异位表达
将hBDNF全长编码序列插入人I型胶原基因(Colia1)增强子-启动子调节序列之下,构建了含Colia1-BDNF微基因的重组体pSCEPBFCAT, 并转染人胚肌腱成纤维细胞.成功地利用了Colia1基因调控元件介导BDNF基因在成纤维细胞中异位表达,SDS-PAGE显示表达产物分子量为27 kDa,免疫斑点杂交、Elisa和Western杂交证实该表达产物具有BDNF抗原活性.
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BDNF对H2O2诱导人成纤维细胞凋亡的实验研究
目的研究脑源性神经营养因子(BDNF)对H2O2诱导人成纤维细胞(hFB)凋亡的作用.方法将含人Ⅰ型胶原a1链(COLIA1)基因启动子和增强子元件并在其3'端接BDNFcDNA的微基因pSVCEPBFCAT,经脂质体介导转染hFB并驱动BDNF异位表达,采用四唑盐(MTT)显色法检测细胞增殖,吖啶橙荧光染色显微镜观察细胞形态的改变,琼脂糖凝胶电泳检测染色质DNA断裂.结果经200μmol/L H2O2作用24 h后,pSVCEPBFCAT转染组和对照组包括未转染hFB、空载体pSVCEPCAT转染hFB的细胞生长抑制率分别为35%和≥84%,p＜0.001;对照组hFB普遍可见凋亡细胞特有的形态学及生物化学改变,如胞浆和核固缩、染色质断裂、DNA电泳呈阶梯状条带,而pSVCEPBFCAT转染hFB未发现上述凋亡特征.结论BDNF促进hFB增殖和拮抗H2O2诱导凋亡,明显抑制H2O2对hFB的细胞毒性.
关键词： 脑源性神经营养因子 微基因 过氧化氢 人成纤维细胞(hFB) 凋亡 -
pSVPoMcat微基因修饰雪旺氏细胞移植治疗实验性脊髓损伤的酶及免疫组化评价
目的,为pSVPoMcat微基因修饰雪旺氏细胞(SC)移植对实验性脊髓损伤(SCI)的治疗作用提供可靠的形态学依据.方法:采用切割法制备脊髓半横断损伤模型(T8平面),实验动物随机植入pSVPoMcat微基因修饰的SC组(A组)、SC组(B组)和明胶海绵组(C组);每组10只,采用定量酶组织化学方法比较A、B、C三组脊髓前角细胞内乙酰胆碱酶(AchE),酸性磷酸酶(ACP)活性;应用定量免疫组织化学方法比较脊髓白质内轴突数量.结果:(1)损伤后不同时间A、B、C组前角细胞AchE活性为A＜B＜C,而ACP活性为A＞B＞C;(2)损伤后脊髓白质一定面积内轴突数量为A＞B＞C.结论:pSVPoMcat微基因修饰雪旺氏细胞移植对实验性脊髓损伤(SCI)的治疗作用有较为可靠的形态学依据.
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pSVPoMcat微基因修饰雪旺细胞移植对脊髓损伤 c-fos、bcl-2基因表达的影响
创伤性脑损伤的分子生物学研究机制已深入到基因水平，但在分子水平上对脊髓损伤（SCI）的探讨尚少。笔者旨在检测pSVPoMcat微基因修饰雪旺细胞(SC)移植对SCI后早期局部脊髓组织神经细胞中c-fos基因及bcl-2基因表达的影响，并初步探讨其意义。 一、材料与方法 健康SD大鼠80只，体重250～300g，雌雄不拘（由华西医科大学动物中心提供）。随机分为4组，pSVPoMcat微基因（在华西医科大学基础医学院重组DNA研究室构建）修饰的SC组为A组，SC组为B组，损伤组为C组，正常对照组为D组。用质量浓度为5 g/L的戊巴比妥钠麻醉动物后，采用笔者等［1，2］的方法，制备T8平面成鼠半横断损伤模型后将pSVPoMcat微基因修饰的SC、SC及明胶海绵分别移植入A、B、C组。移植术后8 h（SCI继发损害的高峰在伤后6～8 h)［3］，迅速取伤段脊髓，D组取相对应（T8）脊髓。将上述标本随机分为甲、乙两组，每组分别含A、B、C、D各10只。用酸性异硫氨氰酸胍-酚-氯方法提取上述脊髓组织中的RNA。然后用地高辛标记探针进行斑点杂交，标记及检测试剂盒为Bohringer Manheim公司产品，c-fos探针和bcl-2探针分别购于北京华美公司及美国Sigma公司。
