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一株拮抗多重耐药菌的芽孢杆菌的初步研究
目的 对一株具有拮抗多重耐药菌的芽孢杆菌的特性进行研究.方法 采用菌落法测试多株芽孢杆菌对18种不同来源致病菌的抑制效应,并对其中一株可拮抗多重耐药菌的芽孢杆菌(KC株)进行鉴定和电泳分析.结果 该芽孢杆菌(KC株)经生理生化以及16S rDNA鉴定为枯草芽孢杆菌;KC株对人源、鱼源、畜禽源和鸡粪源的多重耐药菌有不同程度的拮抗效应;SDS-PAGE分析提示,35 kD左右的分泌蛋白可能参与了KC株的抑菌活性.结论 具有拮抗多重耐药菌的芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌,且该菌分泌的35 kD蛋白可能参与抑菌活性.
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VacA在幽门螺杆菌BCF中的表达及其与空泡毒作用的关系
目的:研究幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)临床分离株的空泡毒作用及其与空泡毒素抗原(Vacuolated cytotoxin antigen,VacA)的关系.方法:用细胞毒试验、SDS-PAGE结合薄层扫描研究H.pylori临床分离株空泡毒作用及其与VacA的关系.结果:62株H.pylori临床分离株,43株为空泡毒作用阳性 H.pylori(Toxin+) ,其余为空泡毒作用阴性的H.pylori(Toxin-).30.23%(13/43)H.pylori(Toxin+)临床分离株的肉汤培养滤液(broth culture filter,BCF)含有分子量为87 kDa的VacA,而所有H.pylori(Toxin-)的BCF不含有这种蛋白,二者之间差异有显著性(P＜0.05);VacA含量与H.pylori(Toxin+)BCF的空泡毒作用滴度明显相关(r=0.67,P＜0.05).结论:H.pylori(Toxin+)空泡毒作用是由VacA引起的.
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鼠伤寒沙门菌外膜蛋白与耐药性关系的分析
目的 分析鼠伤寒沙门菌外膜蛋白(OMP)与耐药性的关系.方法 用消除剂丫啶橙消除耐药性,盲传测其遗传稳定性,采用超声波物理裂解法制备鼠伤寒沙门菌外膜蛋白标本,用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDA-PAGE)检测外膜蛋白,用紫外分光光度计测其吸光值,计算浓度.结果 抗性消除表型能稳定遗传,耐药鼠伤寒沙门菌与敏感鼠伤寒沙门菌都含有6条主要的外膜蛋白条带,两者相比,发现耐药菌的外膜蛋白在约57、53、30 kDa处减弱或缺失,总的蛋白浓度也低于后者.结论 鼠伤寒沙门菌耐药性与外膜蛋白的减弱或缺失有关.
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六种中药材电泳鉴别
目的:对山药、当归、百合、天花粉、紫菀、熟地进行电泳分析,以探索其鉴别方法.方法:应用十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术,对山药、当归、熟地等中药材进行蛋白质电泳.结果:不同中药材的电泳图谱存在明显差异,结论:该电泳方法可作为熟地等几种中药材的鉴别依据之一.
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3首活血化瘀方对寒凝血瘀模型大鼠红细胞膜蛋白组成研究
目的 采用SDS-PAGE法获得红细胞膜蛋白表达谱,用于寻找3首活血化瘀方对寒凝血瘀模型大鼠红细胞膜蛋白组成的影响.方法 80只Wistar大鼠,分为空白组、寒凝血瘀模型组、补阳还五汤高低剂量组、少腹逐瘀汤高低剂量组、丹参饮高低剂量组,随机分为8组,每组10只.采用冰水浸泡和盐酸肾上腺素注射法复制寒凝血瘀模型,造模15d.各给药组1次/d.末次造模后禁食不禁水12h.采用SDS-PAGE法分析红细胞膜蛋白组成变化.结果 与空白组比较,寒凝血瘀模型组红细胞膜上带1、带2、带3和带7蛋白百分含量显著降低(P＜0.05).与模型组比较,少腹逐瘀汤可显著升高红细胞膜上带1蛋白、带2蛋白、带3蛋白、带4.1蛋白和带5蛋白的百分含量(P＜0.05);丹参饮可显著升高红细胞膜上带1蛋白和带7蛋白的百分含量(P＜0.05);补阳还五汤虽没有显著作用,但是有升高的趋势.结论 少腹逐瘀汤和丹参饮可以不同程度的纠正寒凝血瘀模型大鼠红细胞膜的膜蛋白组成.
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基于差异蛋白质鉴别僵蚕及其新型伪品
目的 通过总蛋白含量、可溶性蛋白含量差异以及应用SDS-PAGE蛋白质电泳寻找差异蛋白质来鉴别僵蚕与伪品黑死蚕、空心僵蚕.方法 采用SDS-PAGE法对僵蚕真品与伪品差异蛋白条带进行鉴别.结果发现僵蚕总蛋白含量不低于60.00％,可溶性蛋白含量不低于4.29％,伪品远低于上述指标,可作为僵蚕质量评价的检查项指标,辅助鉴别僵蚕与其伪品;僵蚕特有差异蛋白质(SP)的有无和含量差异,可有效鉴别上述两种新型伪品.结论 本研究初步建立基于差异蛋白质的僵蚕真伪鉴别新方法,为下一步完善僵蚕质量标准,以及僵蚕的质量控制提供科学的依据.
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梭子蟹变应原的分离、纯化与鉴定
目的:对梭子蟹(Portunus pelogicus(Linnaeus))变应原进行分离,鉴定其主要及次要变应原,采用蛋白纯化技术获取梭子蟹天然的主要变应原并进行鉴定,为标准化变应原疫苗的研制提供理论依据.方法:取常规方法制备梭子蟹浸出液,经SDS-PAGE分离,测定各组分的相对分子量;同时用26例对蟹过敏的病人血清进行Western blot,鉴定其主要及次要变应原;利用快速制备液相色谱(FPLC)纯化技术(凝胶过滤层析和离子交换层析)获取主要变应原并作鉴定.结果:SDS-PAGE显示梭子蟹有19条可辨蛋白带,分子量在13 000～90 000之间,其中主带有9条,分子量是20 900、24 200、27 100、29 200、33 700、38 900、48 700、74 700、89 100;Western blot结果表明,26例蟹过敏患者血清全部呈阳性反应,浸出液中共有5条致敏条带,其中分子量在74 400、48 700的是主要变应原,阳性反应率均为100%;纯化后获取了74400、48700的主要变应原;经过免疫鉴定证实其具有免疫活性.结论:梭子蟹74 400和48 700的变应原为主要变应原,层析技术可以对分子量为74400和48700的主要变应原成分进行纯化.
关键词： 梭子蟹 变应原 SDS-PAGE Western blot FPLC -
大籽蒿花粉过敏原的分离、鉴定与纯化
目的：对我国蒿属花粉中常见的大籽蒿花粉进行分离、鉴定与纯化。方法：提取大籽蒿花粉粗浸液，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质组分，并用凝胶成像系统测定各组分的相对分子质量（Mr）；免疫印迹（Western blot）鉴定花粉主要过敏原；通过DEAE-Cellulose DE-52离子交换层析（ Ion exchange chromatography ，IEC）对大籽蒿花粉过敏原进行纯化和免疫印迹鉴定。结果：分离后得到20多种蛋白组分，其中分子量（ Mr）为62、57、38、29、25、14 kD 6个条带蛋白含量丰富，其中Mr为62 kD和16 kD的蛋白条带与确诊的蒿属花粉过敏患者血清特异性IgE结合率高（均＞50％），为其主要过敏原，离子交换层析纯化后可得到Mr为62、16 kD的过敏原。结论：大籽蒿花粉的主要过敏原为Mr 62 kD和16 kD的蛋白组分，离子交换层析技术可以对Mr为62 kD、16 kD的主要过敏原成分进行纯化。
关键词： 大籽蒿花粉 过敏原 SDS-PAGE Western blot 离子交换层析 -
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离恶性疟原虫pfs25膜蛋白的免疫原性研究
目的:研究聚丙烯酰胺凝胶电泳法纯化的pfs25蛋白的免疫原性变化.方法:利用聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)分离了毕赤酵母表达的恶性疟原虫pfs25膜蛋白,按照常规程序将分离的pfs25膜蛋白免疫小鼠,以验证其免疫原性.通过荧光光谱分析、酶联免疫吸附实验,分析了聚丙烯酰胺凝胶电泳过程中pfs25蛋白质免疫原性的变化情况.结果:SDS-PAGE方法成功分离了pfs25蛋白,免疫小鼠后不能产生特异性抗体;与pfs25标准品相比,纯化的pfs25蛋白的荧光光谱发生了改变,但是ELISA结果均为阳性.结论:聚丙烯酰胺凝胶电泳法纯化的pfs25蛋白保留了其免疫反应性,丧失了免疫原性.
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运用统计学优化A型肉毒毒素的SDS-PAGE染脱色方法
目的 运用统计学优化A型肉毒毒素的SDS-PAGE染色和脱色方法,以便生产检定中实现数字化、标准化操作.方法 以Photoshop软件对电泳凝胶扫描图采样的背景灰度值、强带灰度值和弱带灰度值作为评价指标,以不同的脱色液为实验因素,按配对设计安排实验,对实验结果进行脱色方法的统计学分析,根据配对设计分析结果,按裂区设计安排第二步实验,对实验结果进行染色和脱色方法的以统计学为主的综合分析评价.结果 综合分析显示,电泳凝胶直接由考马斯亮蓝R250-磷酸-乙醇染色液加热至60℃染色2h,0.5 mol/L KCl结合冰醋酸-甲醇脱色可获得良好效果.结论 得到一种具有一定创新性的A型肉毒毒素的SDS-PAGE染脱色方法,该方法具有背景脱色浅淡均匀,条带清晰,染色和脱色液不挥发因而重复性好的优点,能够满足A型肉毒毒素生产检定的需要.
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重组铜绿假单胞菌外毒素A含量SDS-PAGE检测方法的建立及验证
目的 建立测定重组铜绿假单胞菌外毒素A(recombinant exotoxin of Pseudomonas aeruginosa,rEPA)含量的SDS-PAGE法,并进行验证.方法 采用SDS-PAGE,经考马斯亮蓝R-250染色后,利用Image Lab软件分析获得目标蛋白条带光密度值,计算目标蛋白在待测样品中的含量.对建立的方法进行专属性、准确性和重复性验证,确定检测范围,并用建立的方法检测rEPA宿主湿菌体中rEPA发酵产量及rEPA宿主菌休克液柱层析纯化样品中rEPA含量.结果 rEPA含量在100～600 μg/ml范围内与其对应条带的光密度值具有良好的相关性,决定系数在0.97以上.大肠埃希菌固有组分及纯化过程中常用的添加物对rEPA含量检测均未产生明显影响,专属性较好;用建立的方法检测500、300、150μg/ml rEPA样品10次的回收率分别为(102.32±4.18)％、(102.77±4.94)％和(95.04±16.41)％,CV值分别为4.08％、4.81％和17.27％.各批rEPA发酵产量为250 ～ 500 mg/L,三步柱层析纯化后,rEPA总回收率约为50％.结论 建立了测定rEPA含量的SDS-PAGE法,该方法专属性、准确性和重复性良好,为rEPA生产工艺的优化奠定了基础.
关键词： 重组铜绿假单胞菌外毒素A SDS-PAGE 收率 -
无细胞百日咳疫苗质量控制方法的建立
目的 建立我国无细胞百日咳疫苗组分含量和纯度的检测方法.方法 应用ELISA方法对生产过程中组分含量(PT和FHA)进行分析,SDS-PAGE和PAGE方法对疫苗原液中PT和FHA的纯度进行测定.结果 通过对生产过程中组分含量的测定,绘制出组分动态图,可以实时监控生产过程中有效组分的变化.检测疫苗原液中PT和FHA纯度的SDS-PAGE法的分辨率较高.但PAGE法条带少,易于分析.结论 所建立的质量控制方法可用于我国无细胞百日咳疫苗的质量控制.
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树舌多糖GF注射液对小鼠HepA瘤细胞可溶性蛋白质组影响的实验研究
目的:研究树舌多糖GF注射液对小鼠HepA瘤细胞可溶性蛋白质组的影响.方法:应用SDS-PAGE分离瘤组织的可溶性蛋白,同时应用PDQest软件分析电泳结果.结果:在可溶性蛋白的SDS-PAGE中,与空白组相比,肿瘤组有3个蛋白质组分条带表达下调,11个蛋白质组分条带表达上调.树舌多糖GF注射液可以使肿瘤细胞3条表达下调的蛋白质组分条带和8条表达上调的蛋白质组分条带恢复至正常水平.结论:树舌多糖GF注射液对小鼠HepA瘤细胞可溶性蛋白质组有质和量的影响.
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SDS-PAGE法分析树舌多糖GF对小鼠HepA癌细胞可溶性蛋白质组表达的影响
目的:探明树舌多糖(GAPS)GF对小鼠HepA癌细胞可溶性蛋白质组表达的影响.方法:昆明种小鼠随机分为三组:正常组、肿瘤组和树舌多糖组.肿瘤组和树舌多糖组接种后,各组肌肉注射给药,正常组和肿瘤组给予生理盐水,树舌多糖组给予树舌多糖GF.应用SDS-PAGE技术检测各组小鼠HepA癌细胞可溶性蛋白的表达.结果:正常组共获得清晰可辨的蛋白带16条,肿瘤组24条条带,树舌多糖组18条.与正常组相比,肿瘤组三条蛋白带表达下调,11条蛋白带表达上调;树舌多糖GF可以使肿瘤细胞三条表达下调的蛋白带和8条表达上调的蛋白带恢复正常;并使在正常组和肿瘤组都存在的15号蛋白带缺失.结论:树舌多糖GF可以影响小鼠HepA瘤细胞多种可溶性蛋白的表达,这种影响很可能与树舌多糖GF的抗肿瘤机制有关.
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野生仙人掌多糖对肺鳞癌细胞SK-MES-1生长的抑制作用
目的:探讨仙人掌多糖对体外肺鳞癌细胞(SK-MES-1)生长抑制作用.方法:体外培养SK-MES-1细胞,四甲基偶氮唑盐(MTT)法观察野生仙人掌多糖对其生长的抑制,计算低抑制浓度及抑制率；观察不同浓度多糖对细胞形态的影响:SDS-PAGE凝胶电泳简析不同组别蛋白质表达的差异.结果:野生仙人掌多糖24 h和48 h对肿瘤细胞的低抑制浓度和抑制率分别为0.0625 mg/ml.34.06％和0.0625 mg/ml 35.37％；不同组间蛋白质表达有差异.结论:野生仙人掌多糖对SK-MES-1肺鳞癌细胞有抑制作用.
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3种胶类中药在加工过程中的动态变化
目的 探讨3种胶类驴皮、龟甲、鹿角在加工成中药的过程中蛋白质的动态变化规律.方法 利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分别对3种胶类原有蛋白质组成进行分析,按照《中国药典》规定的方法加工成阿胶、龟甲胶和鹿角胶,并分析在不同煎煮时间收集的煎出液以及终产品中的蛋白质组成,后通过比较电泳图谱分析蛋白质在加工过程中的动态变化规律.结果 驴皮、龟甲、鹿角中含有丰富的蛋白质类化学成分,在10 ～250 kDa区间均有分布;随着煎煮时间的延长以及辅料的加入,蛋白质在泳道中逐渐呈现弥散现象.此外,阿胶和鹿角胶中蛋白质的相对分子质量介于15～250 kDa,甚至更高,而龟甲胶则基本上小于50 kDa,分布区域有明显不同.结论 该技术可用于考察胶类中药加工过程的规范程度,对胶类中药的质量控制有一定的参考价值.
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猪胎盘蛋白的分离鉴定
目的 分离鉴定猪胎盘蛋白.方法 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)切胶处理猪胎盘提取物后,通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对其进行分离鉴定.结果 SDS-PAGE电泳中7条条带清晰(对应蛋白含有量较高),分子量分别为77.27、68.21、57.85、53.57、46.44、37.16、15.00 kD,分别归属于葡萄糖调节蛋白78、热休克蛋白8、蛋白质二硫键异构酶A3前体蛋白、脯氨酰4-羟化酶β多肽、β细胞骨架肌动蛋白片段、醛糖还原酶、β血红蛋白亚基.结论 所首次鉴定出的7个蛋白是猪胎盘增强细胞活力、提高免疫力、抗氧化活性的物质基础,可为相关研究奠定基础.
关键词： 猪胎盘 蛋白 分离鉴定 SDS-PAGE MALDI-TOF-MS -
厚朴种子蛋白质成分分子量测定
目的:测定厚朴种子蛋白质成分的分子量,并由电泳图谱鉴别其品种.方法:应用SDS-PAGE技术进行研究.结果:不同品种的厚朴其SDSPAGE图谱存在明显差异,并由此确定各样品特征蛋白质的分子量.结论:清晰的电泳图谱如分子量数据为厚朴的鉴别提供依据.
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双向电泳分析水蛭酒炙前后差异蛋白表达
目的 采用双向电泳分析水蛭(Hirudo)酒炙前后差异蛋白表达.方法 分别采用饱和硫酸铵沉淀法、三氯乙酸/丙酮沉淀法、直接裂解液法提取生水蛭和酒炙水蛭蛋白,十二烷基硫酸钠-丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对这3种方法进行筛选,建立双向电泳体系.分析水蛭酒炙前后蛋白表达谱,寻找相关差异蛋白.结果 直接裂解液法所得条带数量多,分布连贯清晰.水蛭酒炙前后蛋白含有量有显著性差异(P＜0.01),共发现19个差异蛋白点,其中下调蛋白8个,上调蛋白11个.结论 双向电泳所得差异蛋白可作为蛋白标志物以规范水蛭炮制工艺,并确保其稳定性.
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曼氏迭宫绦虫裂头蚴可溶性蛋白质的分析
目的 分析曼氏迭宫绦虫裂头蚴可溶性蛋白组分. 方法 提取曼氏迭宫绦虫裂头蚴总蛋白后,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和双向凝胶电泳(2-DE)进行分离,转膜后用感染裂头蚴小鼠的血清和健康小鼠血清作为一抗,行蛋白质印迹(Western blotting)分析,比较杂交蛋白点的差异. 结果 曼氏迭宫绦虫裂头蚴可溶性蛋白经SDS-PAGE分离出33条蛋白带,相对分子质量(Mr)范围在13 800～145 400,其中Mr 26 500、Mr 37 600、Mr 88 200和Mr 130 200为高丰度蛋白区带.经Western blotting分析,Mr 31 600和Mr 37 600条带为曼氏迭宫绦虫裂头蚴特异性蛋白条带,能被感染小鼠血清识别.裂头蚴总蛋白双向电泳凝胶的蛋白质斑点总数为367个,大部分分布在Mr 18 840～46 800,246个蛋白质斑点的等电点为4.0～7.0,占总数的67%;Western blotting分析显示,30个抗原抗体结合点为特异性抗原斑点. 结论 曼氏迭宫绦虫裂头蚴可溶性蛋白有2条特异性蛋白带和30个特异性蛋白斑点,以偏酸性为主.
