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融合蛋白ScFv（3G11）-mms13在大肠杆菌中的表达及鉴定
目的：构建抗Ⅳ型胶原酶单链抗体基因ScFv与磁小体膜蛋白基因mms13融合基因的原核表达载体pET30a（＋）-ScFv-mms13，在大肠杆菌中诱导表达并对融合蛋白进行初步鉴定。方法 PCR扩增融合基因ScFv-mms13，经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后克隆入原核表达载pET30a（＋）质粒，构建重组表达质粒。将重组质粒导入大肠杆菌DH5ɑ中，利用PCR、酶切筛选鉴定重组菌株。用异丙基疏代半乳糖苷（ IPTG）诱导表达融合蛋白，通过改变IPTG浓度、诱导时间优化表达条件。表达产物经SDS-PAGE电泳和Western blot法进行鉴定。结果重组质粒经PCR、酶切、测序证实重组质粒pET30a（＋）-ScFv-mms13构建成功。 SDS-PAGE电泳结果分析表明诱导菌株在43kDa左右处有明显异源蛋白表达，且确定了在IPTG终浓度为0．2mmol/L、诱导时间为6h时为表达稳定。对表达蛋白进行定位分析确定表达蛋白主要以包涵体形式存在，部分存在于可溶细胞质中。 Western blot结果实证该表达产物可与His-tag抗体发生特异性结合，提示为目的融合蛋白。结论成功构建pET30a（＋）-ScFv-mms13表达载体并表达获得目的融合蛋白。
关键词： ScFv mms13 蛋白表达 SDS-PAGE Western blot -
洗必泰MIC作用下大肠杆菌和金黄色葡萄球菌 SDS-PAGE图谱的变化
[目的]探讨在洗必泰MIC(小抑菌浓度)状态下大肠杆菌(8099株)、金黄色葡萄球菌(ATCC 6538株)菌体蛋白质SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)图谱的改变,为消毒剂抑菌机理的研究和从蛋白质组角度寻找抑菌靶蛋白提供参考.[方法]以消毒试验常用的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌标准菌株为例,收集在洗必泰作用下的菌体,SDS溶解菌体蛋白,SDS-PAGE后,对比研究洗必泰MIC、低于MIC以及无洗必泰作用下的菌体蛋白质在SDS-PAGE图谱中所表现出来的差异,并对试验的有关影响因素进行了摸索.[结果]在洗必泰MIC下,金黄色葡萄球菌的四条蛋白带(分别位于31KD左右、31KD和43KD之间、43KD左右处和大于97.4KD处)发生明显变化;大肠杆菌的一条蛋白带(位于66.2KD与97.4KD之间)发生明显变化.[结论]菌体蛋白条带在SDS-PAGE图谱中所表现出的变深或变浅的现象,提示在洗必泰MIC下菌体蛋白正常表达量的增多或减少.
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白血病细胞核基质蛋白的研究
目的研究白血病细胞核基质蛋白与正常骨髓细胞核基质蛋白的差异.方法应用高盐抽提法抽提细胞核基质蛋白,SDS-PAGE技术分析白血病细胞与正常骨髓细胞核基质蛋白的变化.结果与正常骨髓细胞相比,急性白血病细胞核基质蛋白成分明显增加,且出现多种正常骨髓细胞所没有的蛋白带;不同类型白血病细胞核基质蛋白存在差异.结论白血病细胞与正常骨髓细胞的核基质蛋白成分有明显差异,新出现的核基质蛋白改变可能与白血病的发生发展有关.
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胃癌组织中核基质蛋白的变化
目的:研究胃癌组织核基质蛋白的改变.方法:应用SDS-PAGE技术及Genetools定量分析软件,对22例胃癌组织及正常组织的核基质蛋白进行了研究.结果:胃癌组织与正常组织比较,Mr为30 000、28 000的核基质蛋白表达量明显减少(P＜0.05);不同分化类型及不同临床分期胃癌组织间比较,此两种核基质蛋白表达量差异无统计学意义(P＞0.05).结论:胃癌组织中核基质蛋白的改变可能在肿瘤的早期已经发生,是胃癌发生的早期分子事件.
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杜氏盐藻核基质的制备
目的:制备盐藻核基质,进而分离核基质结合区(matrix attachment regions).方法:采用体积分数0.5%TritonX-100破碎细胞,体积分数15%Percoll分离盐藻细胞核,二碘水杨酸锂(1ithium diiodosalicylate,LIS)抽提核蛋白,SDS-PAGE电泳分析蛋白质成分.结果:分离出了高纯度的盐藻细胞核,电泳分析表明绝大部分核蛋白已被去除.结论:体积分数0.5%TritonX-100能有效破碎盐藻细胞,体积分数15%Percoll可分离高纯度的盐藻细胞核,25mmol/L LIS抽提可除去盐藻绝大部分核蛋白获得核基质.
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8-Br-cAMP和槲皮素对Eca-109细胞核基质蛋白的影响
目的:探讨8-Br-cAMP和槲皮素对Eca-109细胞核基质蛋白的影响.方法:将贴壁培养的Eca-109细胞随机分成3组,Br组:加8-Br-cAMP至终浓度为2×105 mol/L;Q组:加槲皮素至终浓度为43 μmol/L;C组:不加任何药物,只加入新培养液培养.同时培养48 h,应用SDS-PAGE技术分析3组细胞核基质蛋白成分.结果:实验组(Br组与Q组)与对照组(C组)比较,相对分子质量64 000、66 000、58 000为增加的条带,14 000、17 000、18 000为增强的条带,92 000是减弱的条带.2个实验组相比,以Br组变动显著.结论:8-Br-cAMP和槲皮素可以诱导Eca-109细胞核基质蛋白成分改变,可能对肿瘤细胞基因表达调控、分化及凋亡起重要作用.
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银屑病患者指甲、鳞屑SDS-电泳图谱和转谷氨酰胺酶活性的探讨
目的 探讨银屑病患者指甲、鳞屑SDS-电泳图谱和转谷氨酰胺酶活性( Transglutaminase 1,Tgase 1).方法 取5例银屑病患者的指甲、鳞屑与5例健康者指甲、鳞屑,分别提取蛋白质进行SDS-PAGE(聚苯乙烯胺凝胶电泳).应用HRP-单丹酰尸胺结合物对鳞屑铺片标本检测Tgase 1 酶活性.结果 健康者指甲和鳞屑的SDS-电泳图谱皆呈现4条主带:63 kDa,54 kDa,48 kDa 及38 kDa,银屑病患者指甲及鳞屑的SDS-电泳图谱也呈现以上4条主带,但多数主带扫描数值水平较高,P＜0.05.健康者的鳞屑铺片标本Tgase 1 酶活性呈现棕黄色细颗粒,定位于角质深层角质形成细胞(keratinocyte,KC)的周缘,相比之下银屑病患者的Tgase 1 酶活性缺乏.结论 指甲及鳞屑的SDS-PAGE电泳主带相似,前者图谱更清晰,可能与其蛋白较稳定有关;银屑病患者比健康者的SDS-电泳图谱主带表达水平高,提示其KC可能呈增生状态,表达产物较多;患者 Tgase 1 酶活性的缺如提示其表皮屏障功能有缺陷,可能与其参与代偿性增生有关.
关键词： 银屑病 SDS-PAGE Tgase 1酶活性 指甲 鳞屑 -
蛋白印迹技术的优化
蛋白印迹是细胞和分子生物学研究中重要的一种实验技术。利用蛋白印迹技术可以检测细胞或组织裂解液中的特异性蛋白，特别是微量蛋白的检测，并进行定性及定量的分析。自1979年科学家发明了将蛋白质通过凝胶电泳移植到生物膜后，蛋白印迹技术得到了极大的发展，目前科学界有各种形式的印迹方法。我们就如何优化蛋白印迹提高成功率做一介绍。
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蛇类及鹿蹄筋可溶性蛋白SDS-PAGE图谱研究
金钱白花蛇(Bungarus Parvus)为脊索动物门爬行纲眼镜蛇科动物银环蛇(Bungarus multicinctus Blyth)的幼蛇干燥体.乌梢蛇(Zaocys)为脊索动物门爬行纲游蛇科动物乌梢蛇(Zaocys dhumnades)的干燥体.鹿蹄筋是脊索动物门哺乳纲鹿科动物梅花鹿(Cervus nippon Temminck)或马鹿(Cervus elaphus Linnaeus)的药用部位之一.
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山药与白术两种中药材的电泳鉴别
目的:探索山药、白术的鉴别方法.方法:应用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝脱电泳(SDS-PAGE)技术,对山药、白术进行蛋白质电泳.结果:两种中药材的电泳图谱存在明显的差异.结论:该法可作为山药与白术的鉴别依据之一.
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射干等六种药材的电泳鉴别
目的:对射干、天花粉、杜仲、巴豆、青葙子、车前子进行电泳分析,以探索其鉴别方法.方法:应用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术,对八种不同产地的射干和天花粉、杜仲进行蛋白质电泳.结果:不同中药材的电泳图谱存在明显差异,即使同一药材,产地不同则谱带亦有区别.结论:该电泳方法可作为射干等几种中药材的鉴别依据之一.
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川半夏资源可溶蛋白图谱遗传多样性分析
目的 为阐明川半夏资源间亲缘关系,准确鉴定半夏药材提供更多证据.方法 采用SDS - PAGE技术分析对以川半夏资源为主的23份半夏材料以及2份掌叶半夏材料的叶片和块茎可溶性蛋白进行分析；采用NTSYS软件计算材料间相似系数,并用UPGMA法构建了系统树.结果 叶片共分离出19条迁移率不同的谱带,3条带纹为所有材料共有,每份材料可分离出11 ～18条比较清晰的带,平均14.5条.块茎共分离出12条迁移率不同的带纹,3条带纹为所有材料共有,每份材料可分离出4 ～12条比较清晰的带,平均9.4条.与块茎可溶蛋白图谱相比较,叶片可溶蛋白图谱能更好的鉴定半夏与掌叶半夏；无论是块茎还是叶片,其可溶蛋白在GS值为0.817水平上所有材料都可以聚为五大类,染色体数目相同或相近的材料有聚在一起的趋势.结论 川半夏资源具有较丰富的可溶蛋白遗传多样性；叶片可溶蛋白图谱可用于鉴别半夏与掌叶半夏,但块茎可溶蛋白图谱难以区分二者.
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园参、野山参、西洋参中水溶性蛋白成分的比较研究
目的 对园参、野山参及西洋参中水溶性蛋白成分进行比较研究,为人参药材的鉴别和质量评价提供依据.方法 采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)及凝胶电泳图像分析软件,比较三者在蛋白分布及含量上的差异.结果 园参、野山参、西洋参的SDS-PAGE图谱及凝胶分析图谱存在很大差异.结论 可以通过SDS-PAGE法对园参、野山参、西洋参进行鉴别、质量评价及药效关系探究.
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基于SDS-PAGE技术的不同水蛭炮制品中水溶性蛋白的差异性研究
目的 考察不同水蛭炮制品中水溶性蛋白的差异性.方法 制备水蛭样品;采用考马斯亮蓝法测定水溶性蛋白质含量;SDS-PAGE法比较各样品中的蛋白的种类和丰度差异性;以生物检定技术为基础,检查水蛭及其炮制品的抗凝血酶活性.结果 所用水蛭及其炮制品的抗凝血酶活性有明显差异;SDS-PAGE结果表明水蛭及其炮制品的蛋白种类、含量皆有明显差异.结论 不同炮制方法中,动物药水蛭水溶性蛋白的含量差异明显,传统的高温炮制方法使水蛭中蛋白质发生了降解,其高温炮制的科学内涵有待深入的研究.
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黄连可溶蛋白SDS-PAGE电泳鉴别
目的对雅连、峨眉野连、云连及6个不同产地的味连进行电泳鉴别.方法采用SDS-PAGE电泳方法.结果味连与雅连具有显著差异,味连与峨眉野连之间几乎无差异,不同产地的味连差异小,云连仅一条极弱的条带.结论 SDS-PAGE电泳可以作为黄连质量控制的鉴别依据.
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细胞角蛋白在口腔扁平苔藓中表达的电泳研究
目的:研究口腔扁平苔藓(OLP)中细胞角蛋白(CK)的表达.方法:采用SDS-PAGE、Western blot法检测15例OLP颊部病变和正常黏膜中细胞角蛋白的表达情况.结果:OLP组与对照组均出现CK1的表达,OLP组中CK2、CK4、CK5表达降低.结论:①.OLP时上皮分化产生CK1使上皮角化增厚,增强颊黏膜的抵抗性.②.OLP中CK2、CK4、CK5的异常表达分别与OLP的异常角化、基底细胞液化坏死有关.
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湖北地产麦冬、湖北麦冬和短葶山麦冬的SDS-PAGE研究
目的:研究湖北地产麦冬、湖北麦冬与短葶山麦冬蛋白的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),为三种麦冬的分类和品质鉴别研究提供新的方法和依据.方法:用SDS-PAGE技术对湖北地产麦冬、湖北麦冬与短葶山麦冬的块根进行分析比较,用BIO-1D凝胶成像分析仪对电泳结果进行了摄影分析,测定了各品种水溶性蛋白的相对分子量,聚类分析图则显示了几种麦冬亲缘关系的远近.结果:湖北地产麦冬、湖北麦冬与短葶山麦冬的SDS-PAGE谱带、水溶性蛋白相对分子量和聚类关系均有明显的区别.结论:SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)研究可用于三种麦冬的分类和品质鉴别研究.
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四种胶类药材及蜂王浆的高效电泳鉴别
目的 对阿胶及次品、龟胶、鹿角胶及两种蜂王浆进行电泳鉴别:方法 利用SDS-PAGE技术和IFE技术对各样品进行电泳鉴别:结果 各样品蛋白质的SDS-PAGE图谱存在明显差异,并由此确定各样品特征的蛋白质分子量,而IFE图谱既可用于鉴别药材真伪,也可用于确定样品所含主要蛋白质的等电点(PI).结论 本法能为胶类蜂王浆等动物类药材的鉴别、生产储藏,提供定量参考依据.
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人工牛黄蛋白质的凝胶电泳实验研究
目的用凝胶电泳建立对人工牛黄蛋白质的研究方法.方法利用IFE、SDS-PAGE、PAGE技术,进行牛黄中蛋白质的电泳实验.结果得到清晰的电泳图谱.结论该方法准确、可靠、重复性好,可对牛黄及其制剂的鉴别提供重要参数.
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"Western Blotting"技术在rhIFNα2a成品冻干制剂中的应用
阐述了基因工程人干扰素α2a(rhIFNα2a)在进行成品电泳时[1],如何控制样品加样量,以便得到清晰的电泳图像及"Western Blotting"图像.
