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生脉注射液含残留蛋白质的检测
目的:检测生脉注射液不同制备工艺中间体残留蛋白质含量.方法:以残留蛋白质为检测目标,采用透析法获取生脉注射液不同制备工艺中间体中大分子杂质,Bradford法测定各大分子杂质中残留蛋白质含量,结合SDS-PAGE电泳分析各残留蛋白质分子量.结果:在0-8 μg线性范围内,牛血清白蛋白标准品回归方程为:Y=0.0474X-0.003(r=0.9974);不同工艺对提取液中残留蛋白的影响较大,红参提取液含残留蛋白浓度较高;麦冬、五味子提取液残留蛋白含量相对较低;经对SDS-PAGE电泳结果分析,各不同工艺提取液中间体含蛋白质分子量主要集中于6-11万.结论:生脉注射液中间体提取工艺工程中可能有蛋白质残留,应加强残留蛋白质检测及生脉注射液的工艺改进;Bradford法结合SDS-PAGE电泳分析生脉注射液中的残留蛋白质,快速、准确、敏感性及检测结果均较好,可为工业生产提供科学数据参考.
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培养肝细胞在蛋白质组学研究中的应用
目的研究一种简便的肝细胞培养方法以培养出足够量的单一类型细胞,从而获得尽可能多的蛋白量进行细胞蛋白质组学分析.方法采用肝组织块贴壁法培养并传一代(目的是去组织块及其他间质细胞).收集细胞蛋白并进行SDS-PAGE及双向凝胶电泳.结果本实验方法可获得高密度、高纯度、高活力的肝实质细胞,细胞裂解后得到的蛋白质电泳图谱效果好.结论实验方法操作简单、经济、高效,能够满足一般实验室进行细胞蛋白质组学分析.
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王棕花粉变应原的分析与鉴定
目的 对我国南方常见的棕榈科植物王棕花粉(Roystonea regia pollen)变应原蛋白进行分离、分析与鉴定,为标准化变应原疫苗的研制提供基础.方法 取常规方法制备的王棕花粉浸出液,采用SDS-PAGE分离王棕花粉蛋白质组分,测定其相对分子量,同时用10例对王棕花粉过敏的患者血清作Western-blot鉴定其变应原及主要变应原成分.结果 SDS-PAGE显示王棕花粉有10条可辨蛋白带,其中主要条带有8条,分别为100000、66000、38000、36000、29000、30000、24000、16000和14000 Mr,Western-blot结果表明,10例王棕花粉过敏患者血清全部呈阳性反应,有66000、24000、16000和14000 Mr共4条致敏条带.其中分子量在16000和14000 Mr的蛋白为主要变应原.结论 王棕花粉变应原的分析与鉴定为临床王棕花粉变态反应疾病的诊断和治疗奠定了基础.
关键词： 王棕花粉 变应原 SDS-PAGE Western-Blot -
紫红笛鲷过敏原的提取、分离及其免疫学特性鉴定
目的 对紫红笛鲷过敏原进行提取、分离及免疫学特性鉴定.方法 新鲜紫红笛鲷经预处理后用PBS缓冲液制备总蛋白粗浸液,SDS-PAGE分析紫红笛鲷总蛋白的组成,免疫印迹(Western-blotting)分析紫红笛鲷过敏原、通过离子交换层析对总蛋白粗浸液进行分离并鉴定不同组份的免疫学特性.结果 紫红笛鲷可溶性蛋白粗提液SDS-PAGE显示有20条蛋白条带,对鱼过敏病人的阳性混合血清能与其中7个条带反应,分子量分别是42 000,36 000,30 000,27 000,25 000,17 000和12 000 Mr.离子交换层析后分子量为42 000、36 000、12 000 Mr的阳性过敏原蛋白具有免疫学活性.结论 本实验对紫红笛鲷过敏原进行了提取、分离和免疫学特性鉴定,离子交换层析技术可以用于紫红笛鲷过敏原蛋白的分离纯化,为紫红笛鲷过敏原的进一步研究和鱼类食品过敏的防治奠定了理论基础.
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新风胶囊中水溶性蛋白的SDS-PAGE分析方法研究
目的:建立新风胶囊中水溶性蛋白SDS-PAGE的分析方法.方法:采用SDS-PAGE电泳方法,根据分子量大小不同,分离新风胶囊中水溶性蛋白;电泳条件:1.0 mm ×25齿试样格,浓缩胶浓度为4.5％,分离胶浓度为12.5％,分离电压100V,上样量5μL,染色2h,脱色4h.结果:新风胶囊中水溶性蛋白成分含量不均,其中主带有2条,分子量为16.38、17.07 kDa左右.结论:SDS-PAGE电泳方法可以用于新风胶囊中水溶性蛋白成分测定,为建立该制剂电泳特征图谱提供依据.
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SDS-PAGE鉴别金钱白花蛇及其混伪品
应用SDS-PAGE技术对金钱白花蛇(Bungarus multicinctus multiciinctus)及其混伪品水赤链游蛇(Natrix annularis)的蛋白质成分进行分析,结果表明,它们的SDS-PAGE图谱存在明显差异,并由此确定了二者蛋白质成分的分子量,为金钱白花蛇的鉴别提供了依据.
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低温炮制工艺对水蛭水溶性蛋白组成及纤溶活性的影响
目的:研究低温炮制工艺对水蛭水溶性蛋白组成及其纤溶活性的影响.方法:水蛭的低温炮制采用液氮快速冷冻和冷冻干燥技术;传统炮制参照2005药典;不同炮制工艺水蛭的水溶性蛋白组成的差异检测采用SDS-PAGE,定量分析采用Scion Image软件;不同炮制工艺水蛭的水溶性蛋白组分的纤溶活性鉴定采用纤维蛋白平板法,溶栓活性分析采用体外溶栓试验.结果:低温炮制工艺的水蛭水溶性蛋白组成比传统炮制工艺丰富,不仅SDS-PAGE蛋白条带的数量与浓度显著高于传统工艺,而且纤溶活性也显著高于传统炮制工艺.结论:不同炮制工艺对水蛭水溶性蛋白组成与溶栓活性有显著影响;在防止水蛭中蛋白质类活性成分的降解、变性与失活方面,低温炮制工艺优于传统炮制工艺.该工艺适用于以蛋白为主要活性成分的动物药研究.
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家蝇幼虫淋巴液的抑菌作用及其SDS-PAGE分析
目的 观察针刺诱导家蝇幼虫血淋巴抗菌物质抑菌作用与抗菌分子.方法 室内饲养的家蝇三龄幼虫,经针刺体壁处理后48 h,提取其血淋巴,观察单独使用血淋巴和血淋巴与氨苄青霉素混合对9种应试细菌的抑菌效果,血淋巴与抗真菌药氟康唑混合对酵母真菌抑菌效果,应用SDS-PAGE分析血淋巴抗菌分子表达.结果 针刺家蝇幼虫后48 h的血淋巴,作用于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、福氏痢疾杆菌、变形杆菌、枯草杆菌、伤寒杆菌、副伤寒杆菌、黄色小球菌,结果显示:针刺家蝇幼虫后48 h的血淋巴对试验9个标准株细菌,均产生明显抑菌环,经单因素方差分析,显示各抑菌试验组的抑菌效果,皆有显著差异(P＜0.001).其中对黄色小球菌抑菌活力强.1 μ1氨苄青酶素与7 μ1针刺诱导家蝇幼虫淋巴液混合对白色葡萄球菌抑菌效果呈现好的加强抑菌作用.针刺诱导家蝇幼虫血淋巴与抗真菌药物氟康唑混合对酵母真菌抑菌效果呈现明显协同增强作用.SDS-PAGE分析结果显示:针刺幼虫后发育的成蝇和针刺幼虫血淋巴的电泳条带与未针刺者相比,针刺幼虫后发育的成蝇,在24000～97000范围内表达尤为增强,在12000附近有一条特异性条带.针刺家蝇3龄幼虫血淋巴SDS-PAGE分析显示,在24 000、35000、40 000～96000范围内表达明显增强,其中35 000、12 000条带较为特异.结论 本研究进一步验证了家蝇血淋巴的抑菌活性,发现针刺诱导家蝇幼虫血淋巴对黄色小球菌抑菌活力强,氨苄青霉素与家蝇幼虫淋巴液混合对白色葡萄球菌抑菌效果呈现好的加强抑菌作用,针刺诱导家蝇幼虫血淋巴与抗真菌药物氟康唑混合对酵母真菌抑菌效果呈现明显增强作用,上述发现在国内外报道较少,本研究结果,为进一步开发这类抗菌物质,提供了实验资料.
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HPV16 E5蛋白原核表达、鉴定及真核表达稳定株的筛选
目的研究HPV16 E5蛋白的生物学特性及其细胞转化机制,对HPV16 E5蛋白原核和真核表达质粒进行构建、表达和鉴定.方法以临床确诊的HPV16感染患者子宫颈细胞DNA为模板,采用PCR方法扩增HPV16 E5基因,经BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切后插入相同酶切的pET32a(+)载体,转染JM109感受态细胞,并进行阳性克隆筛选.经IPTG对重组质粒进行蛋白诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting检测目标蛋白表达情况.将BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切pET32(+)/E5质粒后取得的E5全基因片段转入pcDNA3.1(+)空质粒,构建pcDNA3.1(+)/E5真核表达质粒并对NIH3T3细胞进行转染,后用G418进行稳定表达株的筛选,并采用RT-PCR鉴定细胞内HPV16E5基因表达情况.结果成功构建了原核表达质粒pET32/E5,在1 mmol/LIPTG、28℃诱导条件下BL21(DE3)菌体中HPV16 E5-TRX融合蛋白占菌体总蛋白的10%左右.真核表达质粒pcDNA3.1(+)/E5在成功转染NIH3T3细胞后于250μg/ml G418浓度时筛选21d得到了E5基因稳定表达株,RT-PCR产物测序得到了HPV16 E5基因全序列.结论成功构建了pET32/E5原核和pcDNA3.1(+)/E5真核表达质粒,HPV16E5蛋白在大肠杆菌和NIH3T3细胞中的稳定表达,这些结果为进一步深入研究HPV16 E5蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用奠定了坚实基础.
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肺结核性及腺癌性胸水SDS-PAGE蛋白图谱分析
目的 分析肺结核性及腺癌性胸水SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)图像之图谱特点及异同,为两者的鉴别诊断奠定基础.方法 选用28例肺结核性胸水及36例肺腺癌性胸水,每例均以5%浓缩胶和不同浓度(6%、8%、10%、12%、15%)之分离胶行SDS-PAGE分离胸水中蛋白质,考马斯亮蓝染色,AlphaEaseFC Stand Alone图像分析软件分析10%分离胶凝胶图像.结果 不同浓度(6%、8%、10%、12%、15%)的分离胶SDS-PAGE图像表明,肺结核性胸水及肺腺癌性胸水经10%SDS-PAGE分离,两者的胸水蛋白在40～200 kD范围内均可稳定分离得到10条蛋白条带.这些条带蛋白质分子量分别为200 kD、152kD、134 kD、118 kD、103 kD、98 kD、84 kD、62 kD,54 kD、43 kD.含量达60%以上的蛋白质分子量在54 kD至B4 kD之间.50～60 kD区间的蛋白质含量肺结核性胸水高于肺腺癌性胸水,差异具有显著性.结论 10%及12%的分离胶对胸水中的蛋白具有较好的分离效果;经10%的分离胶分离,肺结核性胸水分子量在50～60 kD区间内的蛋白含量高于肺腺癌性胸水,具有鉴别诊断价值.
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国内几种尘螨变应原提取液的质量分析
目的评价国内几种尘螨变应原提取液的质量,了解国内尘螨变应原的质量现状. 方法采用SDS-PAGE、Western blotting和ELISA法对各尘螨变应原样品进行主要致敏蛋白的成分、含量进行分析比较. 结果各尘螨变应原样品在主要致敏蛋白的成分、含量方面均有明显差异,且各样品均未能达到WHO的变应原标准. 结论国内尘螨变应原的质量参差不齐,变应原的标准化问题亟待解决.
关键词： 尘螨 提取液 SDS-PAGE Western blotting ELISA -
刺苋花粉特异性变应原成分的分析研究
目的:分析刺苋花粉的抗原成分以及刺苋花粉特异性变应原组分,为刺苋花粉变应原的纯化和标准化变应原疫苗的研制提供理论依据.方法:取刺苋花粉浸出液,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)分离,以16例刺苋花粉过敏的病人血清为探针,进行免疫印迹(Western blotting),检测刺苋花粉浸出液的致敏组分.结果:SDS-PAGE显示可辨蛋白条带有11条,分子量在15～80 kD之间,其中主带有9条,分子量依次为18 kD、24 kD、29 kD、35 kD、39 kD、40 kD、42 kD、62 kD、78kD.Western blotting结果表明,16份刺苋花粉过敏患者的血清全部呈阳性反应,浸出液中共有4条致敏条带,其中主要致敏蛋白的分子量是78 kD和40 kD.结论:刺苋花粉78 kD和40 kD的变应原为主要特异性变应原.
关键词： 刺苋花粉 变应原 SDS-PAGE Western blotting -
一维凝胶电泳图谱数字化定量比较法的建立及验证
目的 探讨凝胶定量软件Quantity One用于血清差异蛋白质组学研究的可行性.方法 运用凝胶成像系统中的定量软件Quantity One对各电泳图上的各条带进行定量分析,将图形结果转换为数据结果;用上述技术分别对健康体检者和肝癌病人各32份除高丰度蛋白的血清电泳图进行分析,验证该研究方法的可行性.结果 两组间有10个条带差异具有统计学意义(P＜0.05).通过文献检索,其中9条找到相对应分子量的HCC标志物.结论 凝胶定量软件Quantity One可量化处理电泳条带的分子量和灰度;一维凝胶电泳技术可用于血清差异蛋白初期比较研究.
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去除血清中高、中丰度蛋白方法的优化
目的:通过比较和优化血清样品制备方法,建立简便、灵敏的去除血清中高、中丰度蛋白的方法.方法:运用盐析法、有机溶剂法和亲和层析柱法去除血清中高、中丰度蛋白,经蛋白浓度测定和SDS-PAGE电泳分析,比较3种方法对高、中丰度蛋白去除效果及小分子蛋白的保留和分布情况.结果:乙腈沉淀法能去除血清样品中90%左右的高、中丰度蛋白,同时可残留更多15 ku以下的小分子蛋白;盐析沉淀法和亲和层析柱法均能去除血清样品中大部分高、中丰度蛋白,但所得的15 ku以下的小分子蛋白少于乙腈沉淀法所得到的相应蛋白.结论:用1.2倍体积乙腈沉淀法处理血清样品可去除绝大部分高、中丰度蛋白,同时收获更多的15 ku以下的小分子量蛋白.
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岩沙海葵毒素单克隆抗体的制备及其鉴定
目的 建立岩沙海葵毒素(Palytoxin,PTX)高特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株. 方法将PTX偶联成具有免疫功能的PTX-PDP-KLH完全抗原,免疫雌性6～8周龄Balb/c小鼠,利用传统杂交瘤技术制备FIX单克隆抗体,并通过间接酶联免疫吸附测定(ELIA)方法筛选克隆阳性杂交瘤细胞株. 结果获得能稳定分泌抗PTX单克隆抗体的杂交瘤细胞株B8,与载体蛋白没有发生交叉反应.SDS-PAGE分析表明,McAb B8在50KD和25KD处各出现一条条带,与IgG的重链和轻链的大小相符. 结论研究制备了特异性单克隆抗体PTx,为进一步建立快速检测、鉴定海产品中岩沙海葵毒素的方法,奠定有效的实验基础.
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抗沙门氏菌IgY抗体的制备及其基本特性分析
目的 制备高效价特异性的抗沙门氏菌IgY抗体,并对其基本特性进行分析和鉴定.方法 以沙门氏菌作为抗原免疫产蛋的京白鸡,待抗体产生后,经过50%饱和硫酸铵盐析、透析、以及聚乙二醇浓缩等步骤纯化抗体.蛋白质定量后.再通过SDS-PAGE和ELISA等方法对该抗体进行分析鉴定.结果 经抗原免疫的母鸡,10d左右就可从其所产蛋的卵黄中检测出特异性IgY抗体,抗体量在30d左右达到高峰,经纯化的抗体通过还原性SDS-PAGE显示两条带.其分子量约为67kD和28kD,抗体纯度可达92.1%. 结论成功制备了抗沙门氏菌lgY抗体,实验结果表明IgY抗体是一种产量高,制备简便的新型抗体,并且高效价抗体持续时间较长,其特异性也较好.
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耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的耐药机制研究
目的 探讨2014年该院收集的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌(CRKP)的耐药机制.方法 采用纸片扩散法或者Vitek 2 Compact 全自动药敏分析系统初筛亚胺培南非敏感菌株,琼脂稀释法确证亚胺培南非敏感肺炎克雷伯菌;通过Carba N P确证试验检测碳青霉烯酶表型;通过PCR扩增及测序检测碳青霉烯酶基因、超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)基因、质粒携带的AmpC基因在菌株中携带情况;外膜蛋白SDS-PAGE分析菌株外膜蛋白的改变;外排泵抑制剂羰酰氰氯苯腙(CCCP)抑制试验检测不产碳青霉烯酶基因的肺炎克雷伯菌中是否存在针对碳青霉烯类抗菌药物的外排泵.结果 琼脂稀释法验证30株为碳青霉烯非敏感菌株,其中19株为Carba NP表型试验阳性,其中18株产KPC-2,1株产NDM-1.11株Carba NP表型试验阴性的不产碳青霉烯酶基因的肺炎克雷伯菌的ESBLs、AmpC酶的携带率为blaCTX-M 72.7%,blaSHV 27.3%,blaTEM 72.7%, blaDHA 27.3%.SDS-PAGE结果显示编号2368、2875、3050的菌株OmpK36缺失,其余菌株未发现外膜蛋白缺失.CCCP存在时,11株不产碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌对亚胺培南、美罗培南和厄他培南的小抑菌浓度值均明显降低.结论 碳青霉烯酶产生,尤其是产KPC-2是该院CRKP的主要耐药机制,外排泵的高表达,外膜蛋白的缺失合并产AmpC酶也发挥了重要作用.
关键词： 肺炎克雷伯菌 碳青霉烯酶基因 SDS-PAGE 羰酰氰氯苯腙抑制试验 -
当归种子蛋白质提取方法及SDS-PAGE技术体系研究
目的:建立适用于当归种子蛋白质提取及十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的技术体系,为当归种子蛋白质研究和品种纯度检测提供技术支撑.方法:以蛋白质含量和电泳条带数量等为指标,采用浓缩胶法、盐溶蛋白法、电极缓冲液法、二巯基苏糖醇(DTT)法、尿素法、巯基乙醇法、三羟甲基氨基甲烷(Tris)法、丙酮沉淀法等8种方法提取当归种子蛋白质,筛选优提取方法;再以优提取方法为基础,考察不同料液比、样品稀释倍数(上样量)和分离胶浓度对当归种子蛋白质提取及SDS-PAGE效果的影响.结果:8种提取方法中以巯基乙醇法提取蛋白质的含量较高(29.931 mg/g),且电泳条带数目多、泳道背景清晰;当以巯基乙醇法为优提取方法时,料液比为1:10、上样量为5倍、分离胶浓度为15%条件下电泳效果好,共得到18条条带.结论:建立的蛋白质提取方法和SDS-PAGE技术体系适用于当归种子纯度的检测.
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HPV16E7基因的原核克隆及表达
目的:探讨从喉癌组织中HPV16 E7蛋白的原核克隆及表达.方法:采用PCR方法扩增HPV16 E7基因,经BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后插入相同酶切pET28a(+)载体,转化JM109感受态细胞,并进行阳性克隆筛选.经IPTG对重组质粒进行蛋白诱导表达,SDS-PAGE和Western blot检测目标蛋白表达情况.结果:成功构建了原核表达质粒pET28/E7、HPV16 E7融合蛋白在BL21(DE3)菌株中高效表达.结论:HPV16 E7融合蛋白的表达为进一步深入研究HPV16E7蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用机制奠定了基础.
关键词： HPV16E7 原核表达 SDS-PAGE Western blot -
斯氏按蚊血淋巴在约氏疟原虫卵囊黑化时差异表达蛋白的SDS-PAGE分析
目的初步了解约氏疟原虫感染后的雌斯氏按蚊成蚊吸饲硝喹蔗糖水和蔗糖水后不同时间的血淋巴蛋白差异表达.方法挤压法分别收集两组雌斯氏按蚊成蚊1～5 d的血淋巴,经SDS-PAGE,考马斯亮蓝和银染显色,Bio-Rad1000凝胶图像分析系统进行扫描和差异蛋白条带的自动化分析.结果用药第2天少数蚊卵囊开始部分黑化,第5～9天黑化蚊及其黑化卵囊逐渐增多.用药后第3天处理组蚊血淋巴蛋白条带数明显多于对照组,两组间存在较多差异蛋白带,主要集中在(20～40)×103、(60～80)×103和130×103处.银染比考马斯亮蓝染色出现的蛋白条带数多.结论约氏疟原虫感染的雌斯氏按蚊成蚊吸饲硝喹糖水后其血淋巴蛋白表达有差异,其差异蛋白很可能就是黑化相关蛋白.
