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博尔纳病病毒p24和p40基因星形胶质细胞特异表达重组质粒的构建
目的 构建星形胶质细胞特异性表达的博尔纳病病毒磷蛋白和核蛋白基因重组质粒,以供后续实验研究使用.方法 用PCR方法扩增BDV p24和p40基因完整序列同时加入Nhe Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点,将所得目的片段克隆至pMD18-T载体,再通过酶切连接将其连接至pCMvie-GFAP质粒中的GFAP启动子的下游,分别得到p24和p40重组质粒.用酶切、PCR以及测序3种方法鉴定重组质粒,并将质粒转染人胶质瘤细胞株(U251),采用免疫细胞化学方法检测目的蛋白表达.结果 pCMvie-GFAP-BDVp24和pCMvie-GFAP-BDVp40重组质粒经酶切、PCR鉴定可见目的条带位置与预期相符,经测序可见插入序列正确,质粒转染U251细胞后,经免疫细胞化学检测到目的蛋白表达.结论 成功构建了pCMvie-GFAP-BDVp24和pCMvie-GFAP-BDVp40星形胶质细胞特异性表达质粒,为研究这两种病毒蛋白的致病机制及其对星形胶质细胞的影响提供了工具.
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中国精神病人外周血博尔纳病病毒P24基因片段检测
目的探讨博尔纳病病毒与人类精神疾病的关系.方法采用套式逆转录酶聚合酶链反应(nested RT-PCR)结合荧光定量(FQ)PCR检测了31例精神分裂症病人,16例情感障碍病人以及50例健康人外周血单个核细胞(PBMC)中BDV P24基因片段.结果精神分裂症组BDV P24基因片段阳性率为9.7%(3/31);情感障碍组(0/16)和健康组(0/50)均为阴性.精神分裂症组阳性率高于健康组,但差异无显著性意义(P＞0.05).结论中国的精神病人中存在BDV感染,但BDV感染是否与精神分裂症发病相关有待进一步研究.
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博尔纳病毒的研究进展
目的 博尔纳病病毒是一种非细胞溶解性,嗜神经性核糖核酸病毒.该病毒具有广泛的感染宿主,感染范围从鸟类、马、灵长类等到人类,博尔纳病是一种致死性中枢神经系统疾病,临床上以精神、行为异常为主要表现.其流行病学调查、检测和治疗显得尤为重要.
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博尔纳病病毒感染与精神行为异常
1885年,德国Borna镇大批马匹患了一种以精神行为异常为主的脑炎,当时,这些患病的马科动物又被称作"悲伤的马",该疾病被命名为博尔纳病(Borna Disease,BD);随后,研究者们从病马脑组织分离出了病原体,并将该病毒命名为博尔纳病病毒.
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博尔纳病病毒持续感染的原因及意义
近年来许多国家尼巴病毒和西尼罗河病毒脑炎的暴发流行,导致感染区内数千人短时间内迅速死亡;2004年以来爆发的禽流感病毒等都引起了人类极度恐慌和巨大的经济损失.这些疾病的出现引起了研究者们对新发病毒感染性疾病的高度关注.BDV可能也是新发感染性疾病中的一种病原体,研究者们近年亦对其进行了广泛的研究.博尔纳病(Borna disease,BD)是19世纪末首先在德国马匹发现的一种神经综合症.其病原体博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)是一种非分节段的单股负链RNA病毒,属于单分子负链RNA病毒目博尔纳病毒科,具有8.9 kb基因组,包括6 个开放读码框架,分别编码核蛋白(N) 、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)、RNA聚合酶(L)、病毒蛋白(X).该病毒虽然在世界多个国家和地区均有发现,但临床病例主要集中在中欧[1].
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重庆地区抑郁症患者博尔纳病病毒感染的分子生物学研究
背景 博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)是一种高度嗜神经的RNA病毒,是人畜共患病博尔纳病(Borna disease,BD)的病原体,可引起从鸟到灵长类的多种动物的中枢神经系统感染[1],表现为以中枢神经系统功能障碍为特征的BD.近年研究发现BDV感染与一些神经精神疾病的发病有关,尤其是精神疾病.但有关BDV感染与抑郁症(depressive disorder,DD)发病之间的关系,目前国内外研究尚有争议.本研究从分子生物学角度进一步探讨BDV与DD发病之间的关系.方法 采用巢式逆转录酶聚合酶链反应(nRT-PCR)结合荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测了60例DD患者和120名健康人外周血单个核细胞(PBMCs)中BDV p24基因片段,对FQ-PCR阳性产物进行克隆和基因序列测定,测序结果与人和动物来源的BDV分离株以及标准株Strain V和He/80进行序列比较.对两组阳性率进行Fisher精确概率检验.结果 DD组BDV p 24基因片段阳性率为5%(3/60);健康组阳性率为0%(0/120).DD组阳性率高于健康组,差异有显著性意义(P＜0.05).测序结果为5'-CCCTCCAAGTGGAAACCATCCAGACAGCTCAGCGGTGCGACCACTCCGACAGCATCAGGATTCTTGGCGAGAACATCAAGATACTG-3'.登陆美国国家生物技术信息中心,证实所获得目的基因片段确系BDV p 24基因片断,与人类基因组片段和其他病毒基因组片段无同源性.其与马源的BDV病毒株H1766序列比较亲缘关系近,同源性为97.68%,在2个位点出现突变(nt 1675 T→C,nt 1678 C→T).与其他国际公认的标准病毒株Strain V和He/80比较,同源性分别为96.51%和95.35%,碱基互换中局限于T-C、和A→G两种.结论 中国的DD患者中存在BDV感染,重庆地区DD的发病可能与BDV感染有关.
关键词： 抑郁症 博尔纳病病毒 荧光定量聚合酶链反应 重庆 -
中国精神病人外周血博尔纳病病毒RNA的检测
博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)是一种非分段的、负链、单股的RNA病毒.具有很强的嗜神经性,能感染从鸟到灵长类的广泛动物种类并引起以中枢神经系统功能障碍为特征的博尔纳病(Boma disease,BD).目前我国大陆尚无国人BDV感染的研究报道.我们采用套式(nested)RT-PCR结合荧光定量(FQ)PCR检测精神病人外周血单个核细胞(PBMC)中BDV P24基因片段.
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博尔纳病的实验室诊断方法
博尔纳病病毒(borna disease virus,BDV)是博尔纳病(borna disease)的病原体,为单股负链的RNA病毒,有严格的嗜神经性,可抑制神经系统少突间质细胞增殖并诱导其凋亡[1],可感染包括人在内的多种动物[2],进入人体后能引起持续性的中枢系统感染.因感染该病毒而引发的疾病称博尔纳病,在已报道的人类感染BDV的病例中,以患精神分裂症、情绪障碍、神经质及慢性疲劳综合征者多见[3].
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博尔纳病病毒荧光定量套式RT-PCR检测方法的建立
目的:建立博尔纳病病毒(BDV)荧光定量套式RT-PCR检测方法,为快速、准确地定量检测BDV奠定基础.方法:根据BDV P24基因序列,设计并合成引物和荧光标记探针.将PCR扩增的BDV P24基因片段克隆入载体,重组质粒经筛选、鉴定后,作为阳性模板,用于标准曲线的制定和样品检测.结果:应用量组质粒制作的定量曲线循环阈值与模板具有良好的线性关系,相关系数为0.998,建立了检测BDV的荧光定量套式RT-PCR方法.检测58例神经精神病患者及50例健康人外周血单核细胞(PBMC)中BDV P24基因片段,3例精神分裂症及1例帕金森病患者呈阳性,其余均为阴性.结论:荧光定量套式RT-PCR方法能够避免PCR后处理导致的假阳性污染,并实现准确定量,对于研究BDV感染与人类神经精神疾病的关系有很好的应用价值.
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多克隆及单克隆P24抗体在石蜡组织切片上检测BDV-P24蛋白质的应用
目的:验证本课题组前期制备的多克隆及单克隆P24抗体能否在石蜡组织切片上检测博尔纳病病毒(Boma disease virus,BDV)磷蛋白(P24蛋白质)以及探索其运用的条件.方法:选择出生24 h内的SD大鼠20只为实验组颅内注射BDV病毒液,对照组大鼠20只在相同部位注射磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS),未经注射的SD大鼠和C57小鼠各40只作为阴性实验对照,饲养到60 d取脑石蜡包埋制片;免疫组化染色用Envision两步法,一抗为多克隆或单克隆P24抗体,以PBS代替一抗作为空白对照,P24抗体的稀释浓度分别从1∶50、1∶100、1∶200、1∶400直到1∶5 000;以高倍镜下神经细胞细胞质呈棕黄色或棕褐色颗粒为阳性,将每张切片阳性细胞比例评分乘以阳性强度评分计算总分.结果:多克隆P24和单克隆P24抗体分别在BDV感染大鼠实验组与阴性对照组的染色评分差异有统计学意义(多克隆抗体Z=-3.108,P=-0.000;单克隆抗体Z=-4.605,P=0.000);在多克隆P24抗体稀释度中,1∶200、1∶400的敏感性好而背景着色较轻,在单克隆P24抗体稀释度中,1∶100、1∶200、1∶400的敏感性好而无背景着色.结论:多克隆及单克隆P24抗体在石蜡组织切片上能检测出BDV P24蛋白质;并且多克隆P24抗体推荐的浓度为1∶200和1∶400,单克隆P24抗体的推荐浓度为1∶100、1∶200和1∶400.
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博尔纳病病毒通过磷蛋白调节miR-134影响人少突胶质瘤细胞的增殖研究
目的:探讨博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)在感染宿主细胞中,miR-134对人少突胶质瘤细胞(oligodendrocyte,OL)增殖水平的影响.方法:应用real-time PCR方法检测正常的OL细胞和BDV感染的OL细胞(OL/BDV)中的miR-134表达水平,同时分别将BDV phosphoprotein (P24),nucleoprotein(P40)蛋白真核表达载体转染OL细胞,检测对miR-134的作用;通过miR-134过表达和BDV感染OL细胞,采用流式细胞仪检测miR-134和BDV对OL细胞增殖的影响.结果:real-time PCR表明miR-134在OL、OL/BDV细胞中的表达出现明显差异(P=0.000),并且BDV中的P24蛋白对miR-134有明显的上调作用(P=0.000),但P40对miR-134没有明显作用(P=0.139);流式细胞仪结果显示miR-134过表达(P=0.016)和BDV感染(P=0.001)均可以抑制OL细胞的增殖能力.结论:BDV感染可通过P24蛋白上调OL细胞中miR-134的表达,进而导致细胞增殖水平下降.
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博尔纳病病毒与细胞内信号转导通路
博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)是一种嗜神经性RNA病毒,可以在温血动物神经系统内形成非细胞溶解性持续感染.根据宿主种类及感染途径不同,BDV持续感染可能会调节神经可塑性和动物行为,也可能引起高致死性的T细胞介导的免疫病理反应.
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博尔纳病病毒对人少突胶质细胞增殖与凋亡的影响
目的 探讨博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)感染对人少突胶质细胞(oligodendrocytes,OL)增殖与凋亡的影响.方法 用BDV感染OL细胞,免疫荧光检测OL细胞中博尔纳病病毒P40蛋白的表达,CCK8测定法观察细胞的生长增殖情况,用流式细胞技术检测细胞的凋亡情况和周期变化,Western blot检测凋亡指标Bax、Bcl-2的相对表达量.结果 与阴性对照组细胞比较,感染组在博尔纳病病毒感染少突胶质细胞第3天时,免疫荧光能够检测到P40蛋白的表达.随着感染时间的增加,BDV感染的OL细胞增殖能力下降(P＜0.05),且通过流式细胞仪检测到病毒感染3d后,细胞出现凋亡增多.流式细胞仪检测结果显示,与对照组比较,感染细胞周期G2期延迟(P＜0.05),细胞增殖指数降低(P＜0.05).Western blot检测结果显示,与对照组比较,感染细胞促凋亡蛋白Bax表达量增加(P＜0.05),抑凋亡蛋白Bcl-2表达量下降(P＜0.05).结论 BDV感染可以抑制OL细胞增殖,并能通过上调Bax蛋白及下调Bcl-2蛋白表达量,诱导细胞凋亡的发生.
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博尔纳病病毒荧光定量PCR试剂盒扩增缓冲液的优化
目的 选择并优化博尔纳病病毒荧光定量PCR TaqMan探针法反应体系中的扩增缓冲液,使PCR反应体系对该病毒p24模板基因的扩增效率得到明显提高.方法 通过常规PCR比较选择3种常用酸(盐酸、磷酸和硫酸)所滴定的缓冲液体系,在其基础上选择适合浓度的硫酸铵配制TSS buffer,在TSS buffer中分别加入四甲基氯化铵、Triton X-100、二甲亚砜和甜菜碱这4种常用的PCR添加剂,并确定各自的佳工作浓度,选择扩增效果较好的添加剂与其他添加剂进行依次组合,寻找佳的添加剂组合,后用荧光定量PCR进行对比验证.结果 在滴定酸上选择了效果好的硫酸,配制TSS buffer硫酸铵的佳终浓度为6 mmol/L.在添加剂的优化组合上,1.5 mol/L甜菜碱、0.15% Triton X-100、8 mmol/L四甲基氯化铵和TSS buffer组合成的TBTT buffer效果佳,在其与TaKaRa PCR buffer的对比中,TBTT buffer效果明显好于后者.结论 成功研制优化出适合扩增博尔纳病病毒p24模板基因的扩增缓冲液.
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重庆地区博尔纳病病毒种系发生分析
目的 了解重庆地区博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)基因特征及其种系发生.方法 采用荧光定量巢式实时逆转录聚合酶链反应(fluorescence quantitative nested RT-PCR,FQ-nRT-PCR)检测健康牛、山羊、猪各50例以及病毒性脑炎(viral encephalitis,VE)患者20例外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)BDV p24片段,检出阳性序列和前期检出的5例重庆地区山羊和神经精神患者阳性BDV p24基因序列,与GenBank中5个国家7个动物种属33例BDV p24基因序列进行比对,分析其核苷酸和氨基酸序列同源性,重建基因系统发生树.结果 10例BDV p24 核苷酸序列一部分(1例VE患者)形成重庆独立支系,另一部分(7例动物和2例VE患者)汇聚至德国-瑞士-奥地利-日本-重庆混合支系.与BDV标准病毒株Strain V、H1766及He/80比对,9例核苷酸和氨基酸序列同源相似性分别为94%～100%和82%～100%,1例为95%～98%和89%～93%.结论 重庆地区动物和人宿主可能存在地源性BDV独立株和源于外来疫病病原传入的流行株.
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重庆三峡库区部分地域猪博尔纳病病毒自然感染状况调查
博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)是一种非细胞溶解的单股负链嗜神经RNA病毒,可引起人畜共患病博尔纳病.目前研究表明,BDV几乎可感染所有的温血动物[1],但其流行现况尚不完全清楚.本研究采用改进的巢式逆转录酶聚合酶链反应(nRT-PCR)检测重庆三峡库区部分地域健康猪外周血单核细胞(PBMCs)BDV P24基因片段,对阳性产物进行测序分析,了解该地域BDV自然感染状况.
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检测BDV抗原的双抗夹心ELISA法的建立
目的 建立检测博尔纳病病毒(BDV)抗原的双抗体夹心ELISA法,为简单、快速的临床应用奠定基础.方法 根据双抗夹心ELISA法基本步骤,分别对BDV p24小鼠单克隆抗体、BDV p24兔多克隆抗体和酶标抗体作多梯度稀释,以确定佳实验条件,并对其精密度、灵敏度、稳定性、准确性进行初步评价,同期收集病毒性脑炎(VE)患者脑脊液(CSf)44例和神经系统非炎性疾病患者CSF 44例,通过建立的双抗夹心ELISA法检测临床样本中是否存在BDV抗原.结果 BDV p24小鼠单克隆抗体的佳稀释度为1:160,BDV p24兔多克隆抗体的佳稀释度为1:2 500,酶标抗体的佳稀释度为1:5 000,该法的检测灵敏度为170 ng/ml,精密度批内变异＜10％,批间变异＜15％,同时具有良好的稳定性与准确性.另外用该法检测临床标本其中实验组有3例患者检出BDV抗原阳性,阴性对照组均未检出阳性病例.结论 成功建立检测BDV抗原的双抗体夹心ELISA法.
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抗博尔纳病病毒核蛋白单克隆抗体的制备和鉴定
目的 制备并鉴定鼠抗博尔纳病病毒核蛋白单克隆抗体.方法 重组核蛋白免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行常规融合,用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤并进行有限稀释法克隆和亚克隆,建立分泌抗核蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,纯化单克隆抗体并进行效价测定和特异性鉴定.结果 建立了1株能稳定分泌抗核蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为2F6E8,重链为IgG2a,轻链为κ.ELISA法测得腹水的效价高达1∶32 000以上.Western-blot和间接免疫荧光实验证实该单克隆抗体能特异性结合重组核蛋白及天然核蛋白.结论 成功制备了效价高、特异性好的抗核蛋白单克隆抗体,为建立博尔纳病病毒血清免疫学检测方法奠定了基础.
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神经系统疾病患者脑脊液博尔纳病病毒CIC及抗体的检测
目的 探讨贵州省部分地区神经系统疾病中博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)感染情况以及病毒性脑炎阳性患者的临床特征.方法 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测84例神经系统疾病患者[包括病毒性脑炎(VE)患者69例,吉兰-巴雷综合征(GBS)患者9例,多发性硬化(MS)患者6例,以及45例对照组(非炎症性神经系统疾病患者)]脑脊液(CSF)中BDV循环免疫复合物(CIC)及抗体,对13例脑脊液BDV CIC阳性患者同期行血液BDV CIC检测.结果 84例神经系统疾病患者CSF中BDVCIC总阳性率为15.4 ％(13/84),其中VE阳性率14.4％(10/69),GBS阳性率11.1％(1/9),MS阳性率33.3％(2/6),对照组阳性率2.22％(1/45),实验组总体阳性率明显高于对照组(P＜0.05),两组比较具有统计学意义.CSF抗体阳性率1.2％(1/84),对照组抗体阳性率为0.两组比较无统计学意义(P＞0.05).血液BDV CIC阳性标本10例.7例BDV CIC阳性病毒性脑炎患者主要以精神行为异常为特征,患者有密切动物接触史.结论 贵州省部分地区等地神经系统疾病中存在BDV感染,7例VE患者主要以精神行为异常为临床特征.
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神经疾病患者外周血BDV核蛋白抗体的检测
目的 探讨贵州省博尔纳病病毒(BDV)的感染状况及其与神经系统疾病发生的相关性.方法 建立检测外周血博尔纳病病毒的免疫印迹(Western blot,WB)方法,收集病毒性脑炎(VE)患者62例,帕金森病(PD)患者32例,格林-巴利综合征(GBS)患者19例,多发性硬化(MS)患者7例,以及体检中心健康人120例外周血标本中博尔纳病病毒核蛋白(P40)抗体,并对所检出的阳性标本进行确认.结果 病例组阳性结果8例(6.7％),其中病毒性脑炎患者4例,帕金森病患者2例,格林巴利综合征1例,多发性硬化1例.在所检测出的8例阳性标本中,病毒性脑炎患者阳性率为6.45％ (4/62),帕金森病患者阳性率为6.25％ (2/32),格林-巴利综合征患者阳性率为5.26％ (1/19),多发性硬化患者阳性率为14.29％(1/7).健康体检者对照组外周血中未检出阳性病例(0％).神经系统疾病患者明显高于健康体检者(P=0.003,＜0.05),有显著统计学差异,具有统计学意义.结论 贵州省人群中存在博尔纳病病毒的感染,博尔纳病病毒的感染可能与神经系统疾病(脑炎等)的发生有更大的关系.
