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双抗夹心ELISA检测犬粪贾第虫抗原方法的建立及应用
目的 建立简便、特异的检测犬粪贾第虫抗原贾第素α-12的双抗夹心ELISA方法. 方法 利用辣根过氧化物酶标记抗贾第素α-12单克隆抗体4C9,通过过滤、超声的方法处理犬粪样品.以抗贾第素α-12单克隆抗体3H10为捕获抗体,5％脱脂奶粉作为封闭剂,辣根过氧化物酶标记的抗贾第素α-12单克隆抗体4C9为检测抗体,经底物显色后,用酶标仪测量490 nm处的吸光度(A)值.通过棋盘滴定法确定抗体适包被浓度、佳封闭剂、待检粪液佳稀释度及酶标抗体佳稀释度.应用建立的ELISA方法对122份犬粪样品进行检测. 结果 建立的双抗夹心ELISA检测标准阳性样品的A490为0.465,标准阴性样品的A490为0.098;优化的佳检测条件为:抗体包被浓度为0.01 mg/ml,封闭剂为1％ BSA,粪液稀释度为1∶2,酶标二抗稀释度为1∶400,该试验与犬等孢球虫、犬隐孢子虫、犬蛔虫样品均无交叉反应,批间和批内变异系数较小,重复性好.应用本方法对122份犬粪进行检测,阳性率为36.9％. 结论 建立的双抗夹心ELISA方法特异性高,重复性好,为贾第虫流行病学调查提供了一种更简便、快速、特异的免疫学检测方法.
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血浆蚓激酶定量检测方法的建立及评价
本研究目的建立血浆蚓激酶的定量检测方法,并利用该方法分析人血浆样本中的蚓激酶含量.利用蚓激酶免疫家兔和BALB/c小鼠,制备其兔源及鼠源的多克隆抗体,建立双抗夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定蚓激酶的方法,绘制蚓激酶含量检测标准曲线,进一步对该方法的特异性、精密度、回收率等进行了分析.利用建立的双抗夹心ELISA检测方法对人血浆中的蚓激酶进行检测,并对检测结果进行评价.结果表明,本研究建立的双抗夹心ELISA检测蚓激酶的标准曲线拟合R值＞0.99；精密度评价3个批次内及批间测定值的变异系数(CV)均＜15％；回收率评价3个批次内及批间测定值回收率均＞80％；定量下限为5 ng/ml(精密度CV＜ 15％,回收率＞85％).结论:本研究建立的双抗夹心ELISA检测方法符合药典所规定的标准,满足药代动力学评价的基本要求,可为蚓激酶的临床试验研究提供可靠的检测方法.
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结扎胸导管对食管癌术后肠道细菌内毒素移位的研究
目的 探讨胸导管是否是术后禁食状态下肠道内毒素移位的主要途径.方法 血样标本离心后取上清(血浆),双抗夹心酶联免疫法(双抗夹心ELISA法)测定内毒素含量,所得检测数据相应进行相关检验,分析结扎胸导管对血浆内毒素水平的影响,探讨胸导管是否为内毒素移位的主要途径.结果 年龄和性别对血浆内毒素水平影响差异无统计学意义(P＞0.05).手术后第1～5天内,血浆内毒素水平有很大程度的升高(P<0.01).食管癌患者术中结扎胸导管组术后血浆内毒素水平和未扎组比较结扎组明显低于未扎组(P＜0.01).结扎胸导管降低了术后血浆内毒素水平.结论 预防结扎胸导管不仅可以预防术后乳糜胸的发生,而且对于阻断内毒素的移位有重要意义,胸导管可能是内毒素移位的主要途径.
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抗Trx单克隆抗体用于血吸虫病诊断的研究
目的:建立双抗体夹心ELISA法检测日本血吸虫硫氧还蛋白(Thioredoxin,Trx).方法:用重组日本血吸虫Trx(rTrx)蛋白免疫BALB/c小鼠,筛选高滴度、高特异性的单克隆抗体建立双抗体夹心ELISA法.通过检测日本血吸虫排泄-分泌物(excretory-secretions,ES)与rTrx的浓度评价该方法的敏感性;通过对健康人血清的检测确定其特异性;通过对布氏姜片吸虫病、华支睾吸虫病、卫氏并殖吸虫病、囊虫病患者血清进行交叉反应试验,评价该方法的特异性.结果:获得2株稳定分泌抗rTrx蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为McTrx1和McTrx2.以McTrx1为包被抗体,HRP-McTrx2为酶标抗体,建立的双抗体夹心ELISA可检测出ES的低浓度为4.8 μg/ml,检测出rTrx的低浓度为1.2 μg/ml.该方法的特异性为96％.结论:以抗rTrx蛋白单克隆抗体McTrxl与McTrx2为基础建立的双抗体夹心ELISA法具有较高的特异性.
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用双抗夹心ELISA法快速检测灭活乙型脑炎疫苗的效价
目的:用单克隆抗体制备的双抗夹心ELISA法快速检测灭活乙型脑炎疫苗中的乙型脑炎病毒包膜蛋白(E)的含量,并探讨其替代蚀斑减少中和试验法的可行性.方法:将疫苗样品用蚀斑减少中和试验法测定,同时选定一批疫苗为参考疫苗,用双抗夹心ELISA法检测.结果:用双抗夹心ELISA法测得的中和指数(T_E)为1.595~1.655.用蚀斑减少中和试验法测得的中和指数(T_P)为1.367~1.932.经F检测,两种检测方法的灵敏度有极显著差异(F=56.25,P<0.01), 用t检验法对这两种检测方法进行统计分析,表明两组测定值的差异无统计学意义(t=0.079 3,P>0.05).结论: 双抗夹心ELISA法与蚀斑减少中和试验法测得的中和指数(T)呈正相关性;与蚀斑减少中和试验法比,双抗夹心ELISA法具有重复性好、成本低、快速等优点.用双抗夹心ELISA法取代蚀斑减少中和试验法测灭活乙型脑炎疫苗效价是可行的.
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双抗夹心ELISA法快速检测人用狂犬病疫苗的效价
目的:用单克隆抗体制备的双抗夹心ELISA法,快速检测人用狂犬病疫苗中的狂犬病毒糖蛋白G的含量.并探讨其替代NIH法的可行性.方法:将疫苗样品用NIH法检定.同时以国家标准品为参考疫苗,用双抗夹心ELISA法检测.结果:用双抗夹心ELISA法测得的IgED50为2.60～2.78;用NIH法测得的IgED50为2.55～2.85.对两种检测方法进行F检验,两种检测方法的灵敏度有显著差异(F=5.76,P＜0.05);用t检验法对这两种检测方法进行分析,表明两组测定值的差异无统计学意义(t=0.187,P＞0.05).结论:双抗夹心ELISA法与NIH法测得的IgED50呈正相关性.与NIH法相比,双抗夹心ELISA法具有重复性好、成本低、快速等优点.用双抗夹心ELISA法取代NIH法测狂犬病疫苗效价足可行的.
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国产重组抗CD20单克隆抗体在食蟹猴体内的毒代动力学检测方法研究
目的 建立一种灵敏度高、特异性好且快速的酶联免疫吸附测定(ELISA)方法,用以检测食蟹猴体内的国产重组抗CD20单克隆抗体(YKY-101).方法 采用双抗夹心的ELISA方法对YKY-101进行定量,以大鼠抗Rituximab为一抗,加入YKY-101后,再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人IgG,加入底物显色,采用酶标仪读取450 nm(参比波长630 nm)处吸光度值.结果 建立并验证了灵敏度高、稳定性良好的检测猴血清中YKY-101的ELISA方法.结论 该ELISA方法能够满足YKY-101临床前毒代动力学的要求,可应用于猴血清中YKY-101的浓度检测.
关键词： 国产重组抗CD20单克隆抗体 双抗夹心ELISA 毒代动力学 食蟹猴 -
骨唾液酸蛋白双抗夹心酶联免疫吸附试验检测方法的初步建立
目的 建立快速检测骨唾液酸蛋白的酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法,为试剂盒的研制奠定基础.方法 用鼠抗人骨唾液酸蛋白(BSP)单克隆抗体包被酶标板,兔抗人BSP检测,辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗与兔抗人BSP相结合,初步建立BSP的双抗夹心ELISA检测方法.结果 自建双抗夹心ELISA法检测骨唾液酸蛋白的灵敏度为1.5 ng/mL,标准曲线的线性范围为2～100 ng/mL,回归方程y=0.254 8 x+0.077 5(r=0.992);批内批间变异系数分别为4.6%～5.4%和5.2%～7.1%,对人血清做50、25和10ng/mL三个加标浓度的回收率实验,回收率47.2%～101%;4℃有效期至少360 d.结论 成功建立双抗夹心ELISA检测BSP的方法.
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检测BDV抗原的双抗夹心ELISA法的建立
目的 建立检测博尔纳病病毒(BDV)抗原的双抗体夹心ELISA法,为简单、快速的临床应用奠定基础.方法 根据双抗夹心ELISA法基本步骤,分别对BDV p24小鼠单克隆抗体、BDV p24兔多克隆抗体和酶标抗体作多梯度稀释,以确定佳实验条件,并对其精密度、灵敏度、稳定性、准确性进行初步评价,同期收集病毒性脑炎(VE)患者脑脊液(CSf)44例和神经系统非炎性疾病患者CSF 44例,通过建立的双抗夹心ELISA法检测临床样本中是否存在BDV抗原.结果 BDV p24小鼠单克隆抗体的佳稀释度为1:160,BDV p24兔多克隆抗体的佳稀释度为1:2 500,酶标抗体的佳稀释度为1:5 000,该法的检测灵敏度为170 ng/ml,精密度批内变异＜10％,批间变异＜15％,同时具有良好的稳定性与准确性.另外用该法检测临床标本其中实验组有3例患者检出BDV抗原阳性,阴性对照组均未检出阳性病例.结论 成功建立检测BDV抗原的双抗体夹心ELISA法.
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副溶血性弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体的制备及其活性分析
目的 制备副溶血性弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体(mAb)并建立双抗夹心ELISA.方法 采用差速离心法提取副溶血性弧菌ATCC 17802菌株的鞭毛蛋白,并以此为抗原免疫BALB/c小鼠,抗血清效价达到1∶32 000时,取脾细胞与生长良好的对数期Sp2/0骨髓瘤细胞进行融合.多次克隆化培养后获得杂交瘤细胞株并制备腹水,纯化后得到抗体.结果 获得6株持续、稳定分泌抗副溶血性弧菌鞭毛蛋白mAb的杂交瘤细胞株,命名为VpNo.1～VpNo.6,抗体效价高达1∶2×106.对抗体进行了Ig类和亚类检测以及Western blot法鉴定,其Ig亚类依次为IgGl、IgG1、IgM、IgG1、IgG2a和IgM.SDS-PAGE结果显示,提取出的鞭毛蛋白相对分子质量(Mr)为42 000并且纯度较高.采用VpNo.6抗体建立了副溶血性弧菌双抗夹心ELISA,该方法的检测灵敏度达到103 CFU/mL菌液,通过采用134株副溶血性弧菌和74株非副溶血性弧菌进行特异性实验,结果表明134株副溶血性弧菌呈阳性反应,74株非副溶血性弧菌呈阴性反应,VpNo.6抗体具有非常好的特异性.在基质添加试验中,低检出限为21CFU/g样品.结论 成功制备了副溶血性弧菌鞭毛蛋白mAb,并将其应用于双抗夹心ELISA,该方法的检测灵敏度达到1×103 CFU/mL菌液,与所测试的非副溶血性弧菌没有交叉反应.
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创伤弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体的制备及在食品检测中的应用
目的 制备创伤弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体(mAb)并建立双抗夹心ELISA.方法 采用差速离心法提取创伤弧菌ATCC 1.1758菌株的鞭毛蛋白,并以此为抗原免疫BALB/c小鼠,抗血清效价达到1∶32 000时,取脾细胞与生长良好的对数期Sp2/0骨髓瘤细胞进行融合.采用杂交瘤技术和ELISA制备并筛选分泌mAb的杂交瘤细胞株,有限稀释法对阳性孔克隆化培养.制备腹水,纯化以得到抗体.结果 获得5株持续、稳定分泌抗创伤弧菌鞭毛蛋白mAb的杂交瘤细胞株,命名为VVNo.1～VVNo.5,抗体效价高达1∶(2×106).SDS-PAGE结果显示,提取出的鞭毛蛋白相对分子质量(Mr)为44 000并且纯度较高.采用VVNo.5抗体建立了创伤弧菌双抗夹心ELISA,该方法的检测灵敏度达到103 CFU/mL菌液,通过采用12株创伤弧菌和130株非创伤弧菌进行特异性实验,12株创伤弧菌呈阳性反应,130株非创伤弧菌呈阴性反应,结果表明WNo.5抗体具有良好的特异性.在基质添加试验中,通过增菌,低检出限为2 CFU/25 g样品.结论 成功制备了创伤弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体,并将其应用于双抗夹心ELISA,该方法的检测灵敏度达到1×103 CFU/mL菌液,与所测试的非目标菌没有交叉反应.
