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神经营养因子-3质粒转染失神经肌肉的表达
目的:观察外源性神经营养因子-3(neurotrophin-3,NT-3)基因直接转染失神经肌肉的表达及治疗效果.方法:SD大鼠40只,制成腓肠肌失神经支配模型.实验组术后腓肠肌内注射人NT-3质粒10 μl(1 μg/μl),对照组注射等量生理盐水10 μl/d,不同时间点取材采用免疫组化检测蛋白的表达,并进行肌湿重、肌纤维横截面积和运动终板检测.结果:实验组2d后肌细胞出现外源性NT-3免疫组化染色阳性,7 d时达到高峰,14 d和28 d时有所下降,但与2 d相比,仍维持在较高水平.而对照组免疫组化染色结果为阴性.实验组与对照组检测指标比较差异有显著性.结论:NT-3基因直接转染可在肌细胞内表达蛋白,为失神经肌肉萎缩的基因治疗提供了初步的理论和实验依据.
关键词： 神经营养因子3/遗传学 基因疗法 肌萎缩/治疗 转染 肌/代谢 -
抗新生血管形成基因治疗胶质瘤的实验研究
目的:探讨Endostatin基因(EScDNA)对大鼠胶质瘤的抑制作用.方法:采用脂质体法将pSecTagA-ES-cDNA和pSecTagA转染人脐静脉内皮细胞(EVC-304),并以RT-PCR、Western Bl0t分别从RNA水平和蛋白水平鉴定转染是否成功.然后以FCM测细胞凋亡情况,MTT实验测细胞活力,验证Endostatin基因对血管内皮细胞增殖的抑制作用.再以C6胶质瘤细胞植于SD大鼠腋部皮下制作胶质瘤模型.将pSecTagA-EScDNA直接瘤内注射.分别观察记录肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线.结果:转染细胞PCR、Western分别检测到EScDNA和ES;FCM示细胞凋亡增加,MTT示细胞活力降低,肿瘤生长曲线示肿瘤生长明显受抑.说明Endostatin基因体内应用,具有明显抑制C6胶质瘤的效应.结论:Endostin基因可能通过抑制肿瘤血管新生从而对胶质瘤达到抑制作用,为临床抗血管形成基因治疗胶质瘤提供了实验依据.
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超声微泡造影剂介导EGFP质粒转染大鼠骨骼肌
目的 探讨增强型绿色荧光蛋白质粒(EGFP)在大鼠骨骼肌微血管通透性增加的条件下表达的可行性.方法 20只清洁级Sprague-Dawley(SD)大鼠,随机均分为裸质粒组(P)、质粒+超声组(P+U)、质粒+微泡组(P+M)和质粒+超声+微泡组(P+U+M)共4组进行实验.选择增强绿色荧光蛋白质粒与白蛋白微泡相混合,以超声介导白蛋白微泡破裂的方法 对大鼠骨骼肌行基因转染,转染7 d后,荧光显微镜下观察质粒在大鼠脊斜肌组织中的表达情况.结果 P、P+M组大鼠脊斜肌组织中均未见增强型绿色荧光蛋白表达;P+U组可见少量微弱绿色荧光,荧光强度较P和P+M组明显增强(P<0.05),P+U+M组可见明显特异性增强型绿色荧光蛋白表达,荧光强度约为P、P+M组的10倍,P+U组的3倍(P<0.05);P+U+M组转染率为(42.72±10.07)%较之P+U组(13.62±6.17)%明显增高(P<0.05).结论 超声介导微泡造影剂破裂造成的脊斜肌组织毛细血管通透性的增加,是血管内基因成功跨越内膜屏障的主要途径之一.
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超声微泡介导bcl-xl基因抗视网膜神经节细胞凋亡作用的实验研究
目的 评价超声微泡介导bcl-xl基因抗视网膜神经节细胞(RGCs)凋亡的作用.方法 体外混合培养LongEvans大鼠RGCs,并建立N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)损伤的RGCs凋亡模型.将体外培养的RGCs分为A组(正常对照组),B组(NMDA组),C组(bcl-xl转染+NMDA组);其中C组在加入NMDA前48 h用超声微泡介导bcl-xl转染RGCs.转染48 h后采用免疫组化分析转染细胞和未转染细胞的bcl-xl蛋白水平;加入NMDA 36 h后采用吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)双荧光染色检测细胞凋亡的形态特征,琼脂糖电泳检测细胞凋亡DNA片断.结果 免疫组化检测表明转染细胞与未转染细胞的bcl-xl蛋白表达水平有差异,AO/EB检测发现B组可见大量凋亡小体,C组可见少许凋亡细胞.琼脂糖电泳检测亦发现B组呈典型的DNA"梯度"条带,而A组和C组无明显的DNA"梯度"条带.结论 超声微泡介导bc1-xl基因抗视网膜神经节细胞凋亡有一定作用,有可能为视网膜视神经疾病的基因治疗提供一种新的方法.
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Endostatin-Angiostatin融合基因治疗大鼠C6胶质瘤的3.0T磁共振动态观察
目的 探讨3.0T磁共振在重组单纯疱疹病毒介导的Endostatin-Angiostatin(Endo-Angio)融合基因对大鼠C6胶质瘤疗效评价中的作用.方法 30只雄性Wistar大鼠采用立体定向方法在颅内接种C6细胞,将荷瘤大鼠随机分为两组,治疗组与对照组;两组大鼠分别于接种后1、2、3周进行MR检查;第2、3周检查结束后每组留取2只鼠脑标本进行病理学检查;治疗组大鼠于第1周检查后于肿瘤接种位置原位注入Endo-Angio融合基因进行治疗.结果 第1周检查共25只大鼠成瘤(成功率83%),第2周两组肿瘤体积均增大,二者无统计学差异(P＞0.01),病理检查显示治疗组大鼠微血管腔减少,间质水肿及细胞水肿较对照组明显严重;第3周时治疗组大鼠体积减小,小于对照组(P＜0.01).结论 重组单纯疱疹病毒介导的Endo-Angio融合基因对大鼠C6胶质瘤的生长有抑制作用,3.0T磁共振可以较好地动态观察大鼠C6胶质瘤的生长及治疗变化.
关键词： 大鼠 胶质瘤 基因疗法 endostatin Angiostatin 磁共振成像 -
HIF-1的调控及抗肿瘤相关基因治疗
缺氧诱导因子-1 (hypoxia-inducible factor,HIF-1)是细胞缺氧状态下的关键调控蛋白,作为调节肿瘤细胞缺氧适应、细胞活性、肿瘤血管形成、肿瘤侵袭性和恶性程度的中枢.控制HIF-1的活性及其下游基因的表达,有望成为抗肿瘤治疗的有效途径.本文就HIF-1的结构、表达的调控、相关基因治疗作一综述.
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携带人肝细胞生长因子腺病毒重组体的构建
目的 构建一种同时携带人肝细胞生长因子(hHGF)及绿色荧光蛋白(GFP)的腺病毒重组体,为hHGF的基因治疗提供实验基础.方法 对重组质粒pcDNA3-hHGF进行酶切鉴定及测序正确后,酶切获得hHGF,亚克隆至带有GFP 标记的穿梭质粒pAdTrack-CMV上.选取hHGF 正向插入的重组穿梭质粒经PmeⅠ充分线性化后,与骨架质粒pAdEasy-1 在大肠杆菌BJ5183 中同源重组,挑取阳性克隆行PCR 及酶切鉴定.重组病毒质粒用PacⅠ酶切线性化后,脂质体转染HEK293 细胞进行包装并扩增获取重组病毒上清,RT-PCR 及Western Blot 方法检测hHGF 的表达.结果 目的基因的测序结果与Genebank上的hHGF序列一致.hHGF 基因插入重组腺病毒载体的预期位置,感染Ad-hHGF的HEK293细胞中可检测到hHGF mRNA 和蛋白的表达.结论 成功构建了同时携带hHGF和GFP的重组腺病毒表达载体Ad-hHGF,为进一步探讨hHGF 的生物学功能提供了实验依据.
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Survivin T34A质粒/脂质体复合物抑制Lewis肺癌实验研究
目的 本研究旨在观察及探讨Survivin基因突变体Survivin T34A对Lewis肺癌的影响和作用机制.方法 构建Survivin T34A质粒/脂质体复合物(Lip-mS)及空载质粒/脂质体复合物(Lip-null);体外分别以Lip-mS及Lip-null转染Lewis肺癌细胞,以空白组(NS)作为对照组,利用流式细胞仪检测各组肿瘤细胞的凋亡率;体内试验使用C57 BL/6小鼠建立Lewis皮下移植瘤动物模型,随机分为Lip-mS治疗组、Lip-null治疗组及NS组,观察各组小鼠肿瘤生长情况,通过对肿瘤组织CD31免疫组化、TUNEL荧光染色探讨Survivin T34A基因的抗瘤机制.结果 流式细胞仪检测体外转染不同质粒后各组肿瘤细胞的凋亡:NS组(8.7±0.5)%、Lip-null组(9.0±1.0)%、Lip-mS组(41.6±1.7)%,Lip-mS组相对于其他各组诱导凋亡作用显著(P<0.01);C57 BL/6小鼠Lewis肺癌模型接受治疗后,计算各组小鼠抑瘤率(TIR),Lip-null组为负值,Lip-mS组为71.1%,分析小鼠肿瘤生长曲线,Lip-mS组较其他各组有显著抑瘤作用(P<0.05);肿瘤组织凋亡染色(TUNEL):Lip-mS组凋亡系数为(40.0±2.3)%,与NS组的(11.8±2.4)%、Lip-null组的(12.8±1.8)%比较有统计学差异(P<0.05);CD31免疫组化染色中肿瘤微血管密度:Lip-mS组为6.3±0.76,明显小于NS组的47.1±1.37和Lip-null组的45.8 ±1.18(P<0.01).结论 Survivin TMA质粒/脂质体复合物对Lewis肺癌治疗有效,能够诱导肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤微血管生成,从而控制肿瘤生长.
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探讨肝再生磷酸酶3在脑胶质瘤细胞SHG-44中作用
目的研究肝再生磷酸酶3（PRL-3）在胶质瘤细胞SHG-44中作用。方法采用siRNA干涉的方法下调SHG-44中PRL-3表达水平，通过Western blot方法检测干涉效果，绘制细胞生长曲线、流式细胞仪检测细胞周期及凋亡以观察下调PRL-3对SHG-44细胞的影响。结果 Western blot提示siRNA能够下调PRL-3在SHG-44细胞中的表达，细胞生长曲线显示下调PRL-3能够抑制细胞的增殖，流式细胞仪检测发现下调PRL-3的表达可以促进SHG-44细胞G1期阻滞，S期减少，凋亡增加。结论下调PRL-3能够明显抑制SHG-44细胞的增殖，PRL-3很可能成为脑胶质瘤基因治疗的新靶点。
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高强度聚焦超声介导脂质体pEGFP-N1质粒转染胰腺癌细胞的实验研究
目的 通过观察高强度聚焦超声(HIFU)介导脂质体增强型绿色荧光蛋白质粒pEGFP-N1转染辐照后残余活细胞的效率,探讨HIFU联合基因治疗胰腺癌的可行性.方法 HIFU辐照胰腺癌PANC-1、CFPAC-1细胞,热电偶测温仪记录温度变化,锥虫蓝染色试验检测辐照后即刻杀伤效应,CCK-8试剂盒测定存活细胞生长曲线.辐照后立即加入脂质体pEGFP-N1质粒转染48 h,荧光显微镜观察存活细胞中GFP瞬间转染阳性率.比较在不同发射功率及时问作用下温度、细胞活力与转染效率变化特征.结果 辐照功率30、50、70 W/cm2的平台期温度及达到平台期时间分别为47℃、61 s,62℃、44 s,82℃、33 s.在辐照功率为70 W/cm2、辐照10 s时温度为56.51℃.胰腺癌PANC-1、CFPAC-1细胞即刻活力分别为(85.91±2.23)%、(84.35±1.65)%;辐照后48 h存活细胞的增殖抑制率分别为56.47%、44.60%;存活细胞中脂质体pEGFP-N1质粒瞬间转染率分别为(68.31±2.61)%、(65.85±6.70)%,较对照组分别增加3.7倍和4.3倍.两株细胞在温度变化、细胞破坏、细胞增殖及抑制、质粒转染效率等方面没有统计学差异.结论 HIFU在灭活胰腺癌细胞的同时,可促进辐照区域存活细胞的基因转染,HIFU联合基因治疗具有可行性.
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DHFR-CD双耐药基因增强转基因小鼠对大剂量化疗毒性的抵御能力
目的:探讨将人双突变的二氢叶酸还原酶基因(DHFR)和胞苷脱氨基酶基因(CD)同时导入小鼠骨髓细胞中,观察小鼠对大剂量氨甲喋呤(MTX)和阿糖胞苷(Ara-C)的耐受性,研究骨髓耐受联合化疗的可行性.方法:以反转录病毒为载体,将人双突变的二氢叶酸还原酶基因(DHFR)和胞苷脱氨基酶基因(CD)通过共培养转染入小鼠骨髓干细胞,观察共培养后的骨髓细胞及受体小鼠骨髓移植后经药物处理后的骨髓细胞耐MTX及Ara-C CFU-GM生成情况;转基因小鼠骨髓细胞提取的DNA,用PCR检测转基因小鼠骨髓细胞耐药基因的表达;观察转基因小鼠经大剂量MTX和Ara-C化疗后血象、体质量及生存率的变化.结果:骨髓移植前共培养后供体的骨髓细胞和骨髓移植后受体含有耐药基因(SFG-F/S-CD)的骨髓细胞均有耐药克隆的形成(14%,20%;x2分别为42.55,44.26;P＜0.01),并明显增加了对MTX和Ara-C的耐受;与对照组比较含双耐药基因组动物经大剂量化疗后,生存率明显提高(x2=7.42,P＜0.01),血象逐渐恢复正常;转基因小鼠骨髓细胞经PCR检测,显示有F/S-CD基因条带;耐药基因转染后小鼠骨髓对MTX和Ara-C的耐受明显增加.结论:双耐药基因可以进入小鼠骨髓细胞并且获得共表达,提高了造血细胞对MTX和Aar-C的耐药性.
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胞苷脱氨酶基因对小鼠大剂量化疗的保护作用
目的:将人胞苷脱氨基酶基因(CD)导入小鼠骨髓细胞后,观察小鼠对大剂量阿糖胞苷(Ara-C)的耐受性,探讨骨髓耐受联合化疗的可行性.方法:以反转录病毒为载体,将人胞苷脱氨基酶基因(CD)通过共培养转染入小鼠骨髓干细胞,观察共培养后的骨髓细胞及受体小鼠骨髓移植后经药物处理后的骨髓细胞耐Ara-C CFU-GM生成情况;从转基因小鼠骨髓细胞提取DNA,用PCR检测转基因小鼠骨髓细胞耐药基因的表达;观察转基因小鼠经大剂量Ara-C化疗后血象、体质量及生存率的变化.结果:骨髓移植前共培养后供体的骨髓细胞和骨髓移植后受体含有耐药基因(SFG-CD)的骨髓细胞均有耐药克隆的形成(52%,54%;与对照组相比χ2分别为124.62,126.26,P均<0.01),并明显增加了对Ara-C的耐受性;与对照组比较含耐药基因组动物经大剂量化疗后,生存率明显提高(χ2=7.42,P<0.01),血象、体质量下降幅度较小而恢复较快;转基因小鼠骨髓细胞经PCR检测,显示有CD基因条带.结论:耐药基因可以进入小鼠骨髓细胞并且获得共表达,提高了造血细胞对Aar-C的耐受性.
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CD/5-FC自杀基因体系在正常免疫力动物体内的抑瘤及旁观者效应
目的:观察阳离子脂质体介导的CD/5-FC自杀基因体系协同γ-IFN在正常免疫力小型动物体内对肿瘤的抑制效应及远端旁观者效应.方法:采用阳离子脂质体介导CD基因质粒瞬时转染小鼠肝癌H22及空质粒转染的H22细胞,分别接种于KM鼠双侧前腋下皮下;向小鼠体内注射5-FC及γ-IFN,观察在γ-IFN协同作用下对转染CD基因瘤体的抑制作用和远距离空质粒转染瘤体的抑制即远端旁观者效应.结果:5-FC对转染CD基因侧瘤体抑制明显,抑制率为79.39%;在γ-IFN的协同下CD/5-FC的抑瘤作用得到了增强,抑制率为93.47%,与无γ-IFN协同作用相比,对癌细胞抑制率明显增强(t=3.49,P=0.0036);存在远端旁观者效应,远端未转染瘤体的抑制率为54.42%;在γ-IFN的协同下远端旁观者效应得到显著增强,抑制率达到88.43%,同无γ-IFN相比有差异有显著性(t=2.86,P=0.0212).结论:体内CD/5-FC自杀基因体系联合γ-IFN对肝癌细胞有更好的抑制效应,对肝癌的治疗有很好的应用前景.
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结直肠癌基因治疗研究进展
结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤,其治疗以手术治疗为主,同时辅以放化疗,但术后5年生存率在50%左右,约半数的患者5 a后出现复发或转移.对失去手术机会或转移性患者主要采取以5-FU为主的化疗和生物治疗.肿瘤基因治疗是生物治疗的发展和新支柱,是肿瘤生物治疗的里程碑.它是将含目的基因的重组DNA或RNA转移到受体细胞内,使之在细胞内表达,以诱发免疫应答反应,控制和调节机体抗癌功能.本文就结直肠癌基因治疗现状予以综述.
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大肠癌肿瘤坏死因子的研究进展
肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)是一种具有多种生物学功能的细胞因子.TNF在体内的分泌具有节律性,TNF分子与大肠癌的预后有关,而TNF基因却与大肠癌的发病机制有关.TNF包括TNF-α,TNF-β和TNF-γ三类,在人体分别由单核巨噬细胞,活化T细胞和LAK细胞分泌.其中TNF-α又称恶病质素(cachectin),它可以作为一种重要的炎症递质(inflammationmediator)及调节免疫细胞的关键因子,具有抗肿瘤特性.
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胰腺癌的生物治疗研究进展
胰腺癌发病隐匿, 进展迅速, 死亡率高, 预后差. 手术虽是主要治疗手段, 但因早期诊断困难, 大部分患者确诊时已无手术机会.放疗、化疗疗效不确切, 且有较多副作用. 随着生物技术的发展, 针对胰腺癌所进行的基因治疗、免疫治疗等生物治疗研究日趋增多, 使得对该病的治疗手段更加多样化. 合理运用生物治疗将会改善胰腺癌的预后.
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病毒性肝炎基因治疗的研究和面临的挑战
病毒性肝炎是目前严重危害人类健康的常见的世界性感染性疾病之一,迄今仍无有效的抗病毒药物.抗病毒基因疗法作为一种新的治疗手段,可望从病因上解决病毒性肝炎的治疗问题.本文结合我们自己的研究综述抗肝炎病毒基因疗法的研究现状和面临的挑战,重点介绍抗肝炎病毒核酶和DNA免疫的研究.
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防御素的抗肿瘤研究
当代肿瘤的治疗仍有许多问题未能解决[1,2].防御素引入肿瘤基因治疗已成为一个有前景的新途径.防御素(defensins)是存在于哺乳动物多形核中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophils,PMN)、巨噬细胞、小肠Peneth细胞中的一组同源性很高的生物多肽类,由29～34个氨基酸残基组成,Mr3000～4000.
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腺病毒载体的研究进展
腺病毒(adenovirus,Ad)作为基因表达载体的研制起始于20世纪60年代初,当时病毒学家观察到腺病毒基因组可与猴类病毒40(SV40)基因组杂交,说明腺病毒基因组可承载异源性基因.此后腺病毒逐步发展成一种重要的载体系统[1-9],并成功地用于基因治疗的体内外实验和临床试验[10-21].目前运用广的腺病毒载体(adenovirus vector,Adv)是血清5型腺病毒.
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胰腺癌的基因治疗
胰腺癌仅占恶性肿瘤的2%,却占癌症死亡的第4位.迄今为止,胰腺癌的切除率从未超过20%,五年生存率低于5%.
