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人端粒酶逆转录酶启动子驱动重组腺病毒治疗人前列腺癌的动物实验研究
目的 探讨带有人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子驱动单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSV-tk)基因的重组腺病毒Ad-hTERT-HSV-tk结合无毒的环氧鸟苷(GCV)对人前列腺癌的治疗作用.方法 建立人前列腺癌裸鼠移植瘤模型,肿瘤局部注射1.0×109pfu/ml重组腺病毒0.1 ml后,腹腔注射GCV 100 mg/kg,观察肿瘤体积、瘤重、肿瘤抑制率、肿瘤体积-时间曲线以及裸鼠生存期.取肿瘤组织应用TUNEL法及透射电镜检查检测肿瘤细胞凋亡,免疫组化染色检测增殖细胞核抗原,测定增殖指数.结果 Ad-hTERT-HSV-tk对裸鼠移植瘤具有明显抑制作用,Ad-hTERT-HSV-tk/GCV治疗组的移植瘤体积、重量都明显小于对照组(P＜0.05),也明显小于Ad-hTERT-HSV-tk和GCV治疗组(P＜0.05);TUNEL法测定该系统所致的凋亡率明显高于对照组,而增殖指数明显低于对照组.结论 Ad-hTERT-HSV-tk联合GCV对前列腺癌具有明确的抑制肿瘤生长作用,为前列腺癌的基因治疗提供了一个新的思路.
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重组腺病毒介导的突变型P27kip1基因对胆管癌细胞化疗增敏机制的研究
目的 探讨通过重组腺病毒转导突变型P27kip1至人胆管癌细胞系QBC939中,观察对胆管癌细胞化疗敏感性的影响并探讨可能的机制.方法 重组腺病毒载体Ad-P27mt转染人胆管癌细胞系QBC939,经逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)﹑Western blot检测P27kip1在胆管癌细胞中的表达;流式细胞术检测细胞周期.通过噻唑蓝比色法及流式细胞仪检测5-氟尿嘧啶(5-FU)﹑丝裂霉素(MMC)﹑环磷酰胺(CTX)对转染P27kip1前后的QBC939细胞生长抑制及凋亡的影响.结果 Ad-P27mt转染人胆管癌细胞系QBC939后,5-FU、MMC和CTX对QBC939细胞生长抑制率分别由41.89%、45.59%和38.91%明显升高为56.15%、55.65%和51.69%;凋亡率也由13.76%±3.03%(5-FU)、11.76%±3.99%(MMC)和10.46%±2.10%(CTX)明显升高为41.39%±4.32%(5-FU)﹑35.94%±2.71%(MMC)和34.46%±2.32%(CTX),差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 突变型P27kip1能显著增强胆管癌细胞对化疗药物的敏感性,为靶向调控细胞周期联合化疗药物治疗胆管癌提供了参考依据.
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转染甲氨蝶呤阿糖胞苷双耐药基因的小鼠骨髓细胞对大剂量化学治疗的保护作用
目的探讨同时导入人双突变的二氢叶酸还原酶基因(DHFR)和胞苷脱氨基酶基因(CD)小鼠骨髓细胞对大剂量甲氨蝶呤(MTX)和阿糖胞苷(Ara-C)的耐受性及骨髓耐受联合化疗的可行性.方法以反转录病毒为载体,将人双突变的DHFR和CD通过共培养转染入两只小鼠骨髓干细胞,观察共培养后的骨髓细胞经Ara-C、MTX、Ara-C+MTX处理后,耐MTX及Ara-C粒-巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM)生成情况;转基因小鼠骨髓细胞提取的DNA,用聚合酶链反应(PCR)检测转基因小鼠骨髓细胞耐药基因的表达.结果含有耐药基因(SFG-F/S-CD)的骨髓细胞均有耐药克隆的形成,耐Ara-C、MTX、Ara-C + MTX克隆分别为56%、22%和14%,并明显增加了对MTX和Ara-C的耐受(P<0.005);转基因小鼠骨髓细胞经PCR检测,显示有F/S、CD基因表达;耐药基因转染后小鼠骨髓细胞对MTX和Ara-C 的耐受明显增加.结论双耐药基因可以导入小鼠骨髓细胞并且获得表达,提高了造血细胞对MTX和Aar-C的耐药性.
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p53N15融合肽转染肺腺癌细胞系H1299的抗肿瘤作用
目的 探讨p53N15融合肽转染对肺腺癌细胞H1299体外生长的抑制作用.方法 通过腺体相关病毒(adeno-associated virus AAV)载体把p53N15融合肽高效导入p53缺失肺腺癌H1299细胞系,应用相差倒置显微镜观察、MTT细胞活性试验及流式细胞仪技术分析p53N15对肺癌细胞的抑制作用.结果 p53N15融合肽在H1299细胞中得到了高效表达并发挥明显效应,表现为显微镜下,重组病毒转染72 h可见大片细胞死亡.MTT试验分析,重组病毒转染组细胞活性明显降低.流式细胞仪技术显示,重组病毒转染组可见大量死亡细胞.结论 p53N15融合肽转染可明显抑制肺腺癌细胞H1299的体外生长.
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基因治疗对下颌骨牵引过程中碱性成纤维细胞生长因子表达的影响
目的 探讨电穿孔介导的基因治疗对兔下颌骨牵引成骨过程中碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)表达的影响.方法 新西兰大白兔双侧下颌骨截骨,术后3d开始以0.8 mm/d速度行下颌骨牵引,连续牵引7d,将实验动物分为:A、B、C、D、E5组.分别在牵引区注射2μg重组质粒pIRES-hVEGF165-hBMP2、pIRES-hBMP2、pIRES-hVEGF165、空质粒pIRES及生理盐水.各组实验动物均施加电穿孔刺激.各组分别于固定期第7、14、28天处死动物取材行免疫组织化学检查bFGF的表达,并利用病理图像分析系统进行分析.结果 bFGF在肉芽中的成纤维细胞、单核巨噬细胞、多核巨噬细胞、间质细胞、成骨细胞和骨细胞中表达:1周时以C组表达较强,2、4周时以A、B、C组表达仍较强,A、B、C组与D、E组相比差异有统计学意义(P＜0.01).结论 电穿孔介导的基因治疗能使bFGF在牵引区的表达增强和表达时限延长,发挥其生理作用,促进细胞的分裂增殖与分化及牵引区细胞基质的形成和新骨生成.这可能是基因治疗促进牵引区新骨生成的机制之一.
关键词： 电穿孔 基因疗法 骨生成 碱性成纤维细胞生长因子 -
基因治疗对兔下颌骨牵引过程中骨形成蛋白-2表达的影响
目的 探索电穿孔介导的基因治疗对兔下颌骨牵引成骨过程中骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP2)表达的影响.方法 新西兰大白兔双侧下颌骨截骨,术后3d开始牵引,连续牵引7d后,将实验动物分为A、B、C、D、E5组,A、B、C组分别在牵引区注射2 μg(0.1 μg/μl)重组质粒pIRES-hVEGF165-hBMP2、pIRES-hBMP2、pIRES-hVEGF165.D组与E组分别注射相同剂量的空质粒(pIRES)和生理盐水(NS).各组分别于固定期第7、14、28天处死动物,取材行免疫组织化学检测BMP2的表达情况,并利用病理图像分析系统进行分析.结果 BMP2主要在肉芽组织中的炎细胞及新生幼稚骨小梁表面的细胞组织中表达.固定7d时表达强烈,各时点基因治疗组明显强于对照组.结论 电脉冲介导的基因治疗能使BMP2在牵引区的表达增强和表达时限延长并促进细胞的分裂增殖与分化,促进牵引区细胞基质的形成和新骨生成.
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维生素A类药物抗恶性黑瘤的研究进展
恶性素瘤(malignant melanoma,MM)的治疗,手术治疗为首选,然而辅助疗法在某些情况下也非常重要.抗癌化学药物、生物活性制剂、免疫疗法、放射治疗甚至基因疗法都显示其不同的效果.近年,维生素A类制剂在抑制MM的作用方面引起人们的关注.
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不同时机转染基因对兔下颌骨牵引区新生骨骨密度与骨强度的影响
目的 观察不同时机转染基因对兔下颌骨DO过程中牵引区新生骨骨密度与骨强度的影响,探索基因导入的佳转染时间,以获得更好的治疗效果.方法 新西兰大白兔48只,全麻下行双侧下颌骨截骨及牵引器植入后,采用随机区组法分成A、B、C、D4组,分别于术后即刻、术后3d(牵引开始时)、牵引结束时,于双侧牵引区分别注射2 μg(0.1 μg/μl)重组质粒pIRES-hBMP2-hVEGF165；A、B、C3组均予电穿孔刺激,D组单纯牵引不行基因转染.各组于术后3d开始以每天0.8 mm、每天1次的速率进行牵引,连续牵引10 d；各组分别于固定期1、2、4、8周处死3只兔子,切取下颌骨行X线片检测、定量CT(quantitative computer tomography,QCT)测量牵引区新生骨组织密度后,将4、8周的标本进行生物力学检测.结果 各组牵引间隙新生骨骨密度与骨强度,随着固定期的延长逐渐增高；固定1周时,A(83.43 ±9.96)、B(92.29±11.25)、C(89.93±14.15)3组新生骨骨密度组间比较,差异无统计学意义(P＞0.05),但均高于D组(70.31±3.30),差异有统计学意义(P＜0.05)；固定2、4、8周时B组骨密度(137.54±7.20、492.93±17.57、790.48±12.19)高于A组(121.44 ±9.27,396.15±15.70,603.39±16.46)、C组(125.06±7.24,464.15±15.45,764.15±17.28)、D(98.86±8.13,336.45±11.95,577.89±18.43),差异有统计学意义(P＜0.05),固定4、8周时B组生物力学各项指标均高于A、C、D组(P＜0.05).结论 在牵引开始时(牵引期)进行基因转染,能够获得佳的促进新骨生成的效果,提示牵引期是下颌骨基因治疗的佳时机.
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脂质体介导血管内皮生长因子对不同时间断蒂大鼠随意型皮瓣的影响
目的 通过血管内皮生长因子基因对大鼠随意型皮瓣的转染,探讨基因治疗对不同时间断蒂的大鼠随意型皮瓣成活的影响.方法 以SD大鼠为实验模型制作背部随意型皮瓣,实验组注入脂质体包裹的PcDNAVEGF165(目的 基因组),对照组分别注入PcDNA(空白质粒组)和生理盐水(生理盐水组),于用药后1、3、5、7 d,每组每时相点分别随机选取10只断蒂,断蒂后7 d处死大鼠,观察下述指标:①皮瓣成活率.②皮瓣组织标本行常规HE染色检测平均微血管数目及内径.③行VEGF免疫组织化学染色检测VEGF表达情况.④取皮瓣组织标本在电镜下观察超微结构.结果 ①皮瓣成活率:1、3、5、7 d断蒂实验组皮瓣成活率分别为(45.45±12.24)%、(82.95±3.81)%、(85.00±3.38)%、(85.96±3.25)%.1 d断蒂实验组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),3、5、7 d断蒂各实验组明显高于相应对照组(P<0.05),3、5、7 d断蒂各实验组则随着断蒂时间的延迟差异无统计学意义(P>0.05).②平均微血管数目及内径:各实验组与相应对照组比较差异有统计学意义(P<0.05).③各实验组VEGF染色深度明显高于对照组(P<0.05).④超微结构:实验组内有新生血管形成,内皮细胞内可见较多粗面内质网,线粒体等结构,组织内成纤维细胞增多,细胞合成代谢旺盛.结论 皮下注射脂质体介导VEGF基因可提高皮瓣成活率,促进早期断蒂,是一种简单,高效,经济,相对安全的基因治疗方法.
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电穿孔介导的基因治疗对兔下颌骨牵引区新生骨骨密度与强度的影响
目的 探索电穿孔介导的基因治疗对下颌骨DO过程中牵引间隙新生骨密度与强度的影响,从而为促进下颌骨DO新骨生成,缩短牵引周期,减少并发症提供新思路.方法 以新西兰大白兔为实验动物模型,于术后3 d开始下颌骨牵引,每天0.8 mm,连续牵引7 d后,将实验动物分为5组.A组:在牵引区注射2 μg(O.1μg/μl)重组质粒pIRES-hVEGF165-hBMP2;B组:在牵引区注射2 μg(0.1μg/μl)重组质粒pIRES-hBMP2;C组:在牵引区注射2 μg(0.1μg/μl)重组质粒pIRES-hVEGF165;D组:在牵引区注射2 μg(0.1μg/μl)空质粒pIRES;E组:在牵引区注射相同剂量的生理盐水.5组实验动物均施加电穿孔刺激.各组分别于固定期第1、2、4、8周行X线及QCT检查.选整个牵张间隙新生骨痂部分为兴趣区,测定骨密度.然后处死动物.取材测量牵引区新生骨的三点抗压强度.结果 A、B、C组新生骨痂密度各时相点新生骨痂密度明显高于D、E组(P<0.01).固定2周,A组明显高于各组,但B、c组间比较差异无统计学意义.固定4周,A、B组明显高于C、D、E组(P<0.01).固定8周A组明显高于B、c、D、E组(P<0.01).B、C组间比较差异无统计学意义,但高于D、E组(P<0.01).固定4周,A组新生骨的三点抗压强度明显高于B、C、D、E组(P<0.01).固定8周,A组仍明显高于各组(P<0.01),且B组也明显高于c、D、E组(P<0.05).结论 电脉冲介导的pIRES-hVEGF165-hBMP2重组质粒体内转染可使牵引区获得较满意的骨再生和骨化成熟进程,其新骨骨化、改建过程均超过对照组.提示联合应用BMP与VEGF,可能会实现成骨与血供的联合重建,并且使单一生长因子的效应放大,使骨愈合的速度加快.
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不同时间基因转染对兔下颌骨牵引区BMP-2表达的影响
目的 探讨于不同时间体内转染重组质粒人形态蛋白-2和人血管内皮生长因子-165真核细胞共表达载体(pIRES-hBMP2-VEGF165)对兔下颌骨牵引区骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)表达的影响.方法 48只新西兰大白兔随机分为A、B、C、D4组,均于双侧下颌骨截骨后置入内置式下颌骨牵引器,经过3d潜伏期后开始牵引,牵引速度0.8 mm/d,连续牵引10d进入固定期.A、B、C组动物分别于术后立即、术后3和14d,在双侧牵引区注射2μg(0.1 μg/μl)重组质粒pIRES-hVEGF165-hBMP2.D组不进行基因转染,4组动物均施加电穿孔刺激.各组动物分别于注射后固定l、2、4周处死,取材行免疫组化检测新生骨中BMP-2的表达情况,并应用CMIAS系列多功能真彩色病理图像分析系统定量分析.结果 BMP-2在牵引区肉芽组织中的炎性细胞如单核细胞、成纤维细胞,以及少量沿牵张方向排列的新生幼稚骨小梁表面的成骨细胞、骨细胞和骨周围结缔组织中表达.固定1和2周,B组阳性表达蛋白平均吸光度(MA)值和积分吸光度(IA)值,B组(0.58 ±0.03和0.34±0.02),与A组(0.42±0.02和0.31 ±0.01)、C组(0.32±0.01和0.30±0.01)、D组(0.27±0.01和0.23 ±0.02)比较,差异有统计学意义(P＜0.05);A组(0.42±0.02和0.31 ±0.01)、C组(0.32±0.01和0.30±0.01)与D组(0.27 ±0.01和0.23±0.02)比较,差异也有统计学意义(P＜0.05);固定4周时A、B、C、D各组BMP-2表达均减弱,组间比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 在牵引开始时进行基因转染更能促进牵引过程中BMP-2的表达,从而刺激牵引区骨基质合成和诱导成纤维细胞、成骨细胞、血管内皮细胞、骨细胞等的增殖分化,更能有效地促进骨的生长和修复,提示牵引开始时转染可能是基因转染的佳时间.
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电穿孔介导的基因治疗兔下颌骨牵引成骨模型的建立
目的 探讨电穿孔技术介导的重组质粒体内转染兔下颌骨牵引成骨的可行性.方法 以新西兰大白兔为实验动物模型,于术后3 d开始下颌骨牵引,每天0.8 mm,连续牵引7 d后,将实验动物分为3组:质粒+电穿孔组(A组),质粒组(B组),生理盐水组+电穿孔组(C组).各组动物分别于注射后3 h及1、3、7、14 d处死,切取牵引区组织0.4 cm×0.4 cm行冰冻切片检查,采用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)表达以检测外源基因的表达.检测兔血清肝功能指标丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)和肾功能指标尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)和心、肝、肾组织学检查.结果 A组转染新西兰大白兔,3 h可观察到GFP的表达,1 d时GFP的表达增强,3 d时GFP的表达强,其后开始逐渐下降,7 d后GFP的表达减少,14 d仍可观察到微弱GFP的表达.B组的GFP的表达时限与A组相同,但各时相点的GFP的表达强度明显弱于A组,C组在各时间段均未观察到GFP的表达.3组肝、肾功能指标两两比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 电穿孔技术介导的带有荧光标记的重组质粒体内转染,可在兔下颌骨牵引区组织内表达,电穿孔能明显提高重组质粒的体内转染效率,提示电穿孔技术介导的重组质粒体内转染兔下颌骨牵引成骨的动物模型是可行的,用于体内试验是安全的.
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电穿孔介导的基因治疗对兔下颌骨牵引过程中细胞周期蛋白表达的影响
目的 探索电穿孔介导的基因治疗对兔下颌骨牵引成骨过程中细胞周期调节蛋白表达的影响。方法 45只新西兰大白兔，双侧下颌骨截骨后3d开始以0.8 mm/d速度行下颌骨牵引，连续牵引7d后，随机分为A、B、C、D、E5组，每组9只，分别在牵引区注射2μg（0.1 μg/μ1）重组质粒plRES-hVEGF165-hBMP2、pIRES-hBMP2、plRES-hVEGF165、空质粒pIRES和相同剂量的生理盐水后，均施加电穿孔刺激。各组分别于固定期第7、14、28天处死动物取材，行免疫组织化学检查细胞周期蛋白Cyclins A、D1、E的表达情况，并利用CMIAS-2001A病理图像分析系统分析，结果采用单因素方差分析和q检验。结果 Cyclin A、D1、E主要在肉芽组织中的炎性细胞如单核细胞、成纤维细胞及少量沿牵张方向排列的新生幼稚骨小梁表面的成骨细胞、骨细胞和骨周围结缔组织中表达；固定7d时表达强烈，14 d下降，28 d时表达较弱。图像分析结果显示，固定7d时C组阳性表达蛋白的吸光度A值(0.59 +0.14)表达较强，与A(0.41±0.13)、B(0.38 +0.14)、D(0.34±0.12)、E(0.31 +0.10)组比较差异有统计学意义(P ＜0.05，P＜0.01)；A、B组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)，但与D、E组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；固定14 d和28 d时，A(0.39±0.11)、B(0.34±0.10)、C(0.33 +0.09)组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)，但与D(0.19±0.12)、E(0.14 +0.04)组比较差异有统计学意义(P ＜0.05，P＜0.01)。各时相点基因治疗组明显强于对照组。结论 电穿孔介导的基因治疗能使细胞周期蛋白CyclinsA、D1、E在牵引区的表达增强、时限延长，可能促进细胞的分裂增殖与分化，促进牵引区细胞基质的形成和新骨生成。
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融合型自杀基因Fcy::Fur联合5-氟胞嘧啶对人卵巢癌细胞株HO-8910体外杀伤作用的初步研究
卵巢癌基因治疗的研究备受关注,而自杀基因疗法被认为是有希望的策略之一,其具有一个独特的杀伤机制,即"旁观者效应",转染了自杀基因的肿瘤细胞被杀死,且周围大量未被转染的肿瘤细胞也被杀死,此效应的意义在于只需少量的肿瘤细胞转染自杀基因,就可产生广泛的杀伤作用[1].
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共刺激分子B7基因诱导小鼠抗子宫颈癌主动免疫的研究
目的探讨共刺激分子B7基因能否在体内诱导小鼠抗宫颈癌主动免疫应答。方法将B7基因转染小鼠宫颈癌细胞株即U14，建立高表达B7的U14细胞株即B7+U14。随后分4组进行体内实验：(1)实验A组：将B7+U14（1×107个细胞）接种于同系615小鼠的右侧背部皮下（n=6）。(2)实验B组：用B7+U14（1×106个细胞）皮下注射免疫615小鼠，7 d后将U14（1×107个细胞）接种于免疫后的小鼠背部皮下（n=6）。(3)对照A组：在615小鼠右侧背部皮下接种U14（1×107个细胞），其余条件同实验A组。(4)对照B组：用U14（1×106个细胞）免疫615小鼠，其余条件同实验B组。观察4组小鼠的成瘤情况、生存时间；体外分别检测经B7+U14和U14免疫后的小鼠（n=4×2）T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。结果 (1)小鼠皮下接种B7+U14后，体内的致瘤能力明显降低（P<0.01）。(2)用B7+U14免疫后再皮下接种U14可有效预防移植瘤产生（P<0.01）。(3)体外检测经B7+U14和U14免疫后的小鼠T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞作用，前者明显高于后者（P<0.01）。结论 B7基因转染小鼠宫颈癌细胞株U14能诱导机体有效的抗肿瘤主动免疫应答，提示应用B7基因转染法可能成为临床治疗宫颈癌的有效方法。
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半胱天冬酶3前酶增强胞嘧啶脱氨酶-胸苷激酶融合双自杀基因系统治疗人卵巢癌的体外研究
目的探讨半胱天冬酶3前酶(procaspase-3)能否增强胞嘧啶脱氨酶-胸苷激酶/5-氟胞嘧啶+更昔洛韦(CD-TK/5-FC+GCV)系统对人卵巢癌细胞的体外杀伤作用.方法构建procaspase-3的表达载体pcDNA3-casp3和人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子调控下的CD-TK融合双自杀基因表达载体pBTdel-279-CD-TK.应用蛋白印迹法检测pcDNA3-casp3和pcDNA3质粒转染后的3AO细胞(3AO-pcDNA3-casp3、3AO-pcDNA3细胞)中procaspase-3蛋白的表达情况;应用RT-PCR技术检测pBTdel-279-CD-TK和pBTdel-279分别转染的3AO-pcDNA3-casp3和3AO-pcDNA3细胞中CD和TK基因的表达情况;应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、流式细胞仪技术、蛋白印迹法和荧光底物分析法分别检测4种细胞在CD-TK/5-FC+GCV系统作用后的细胞存活率、细胞周期及半胱天冬酶3(caspase-3)活性.结果 3AO-pcDNA3-casp3细胞有明显的procaspase-3蛋白表达,而3AO-pcDNA3细胞则无表达.3AO-pcDNA3-casp3和3AO-pcDNA3细胞在pBTdel-279-CD-TK转染后均可检测到CD和TK基因,但在pBTdel-279质粒转染后则CD和TK基因表达均为阴性.在5-FC+GCV作用下,3AO-pcDNA3-casp3+pBTdel-279-CD-TK细胞的存活率显著低于3AO-pcDNA3+pBTdel-279-CD-TK细胞.在5-FC(2 mmol/L)+GCV(10 μg/ml)作用48 h后,3AO-pcDNA3-casp3+pBTdel-279-CD-TK细胞的凋亡率为37.98%,S期比例为49.67%,分别高于3AO-pcDNA3+pBTdel-279-CD-TK细胞的21.34%和35.76%,两者分别比较,差异有统计学意义(P<0.05).在5-FC(1 mmol/L)+GCV(1 μg/ml)作用48 h后,3AO-pcDNA3-casp3+pBTdel-279-CD-TK细胞中的caspase-3活性值为189.7,高于3AO-pcDNA3+pBTdel-279-CD-TK细胞的44.9,两者比较,差异有统计学意义(P<0.05).结论procaspase-3可显著增强CD-TK/5-FC+GCV系统对人卵巢癌细胞的杀伤作用.
关键词： 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 胞嘧啶脱氨酶 胸苷激酶 基因疗法 卵巢肿瘤 -
内皮前体细胞转染TRAIL基因后治疗卵巢上皮性癌的实验研究
目的探讨内皮前体细胞(EPC)转染TRAIL基因后对卵巢上皮性癌细胞的体外杀伤作用.方法采用细胞表面特异性标志物CD133磁珠分离法,从脐血中分离EPC,并进行体外培养、扩增和鉴定.构建带有TRAIL基因的质粒(即TRAIL质粒),用脂质体将TRAIL质粒转染入EPC,酶标法测定培养上清液中EPC分泌的TRAIL蛋白的表达水平,流式细胞仪分析其对卵巢上皮性癌细胞的促凋亡作用.结果采用磁珠分离法可从脐血中分离出EPC,EPC占分离后细胞总数的(84±3)%.成功构建TRAIL质粒,转染TRAIL质粒后EPC分泌的TRAIL蛋白水平增加,转染72 h时可达532.8 pg/ml;而仅转染脂质体及转染绿色荧光蛋白者为12.4及9.2 pg/ml.将转染TRAIL质粒后的EPC培养上清液与卵巢上皮性癌细胞共同孵育24 h后,卵巢上皮性癌细胞凋亡率高可达24.1%.结论TRAIL基因转染EPC后,可使EPC分泌的TRAIL蛋白水平增加,并诱导卵巢上皮性癌细胞凋亡.提示,EPC可作为基因治疗的靶向性载体,有望应用于卵巢上皮性癌的治疗.
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白细胞介素12和共刺激分子B7-1联合修饰肿瘤细胞疫苗诱导抗肿瘤免疫治疗的实验研究
目的探讨经白细胞介素12(IL-12)和共刺激分子(costimulatory molecule)B7-1基因联合修饰的肿瘤细胞疫苗诱导机体抗肿瘤免疫反应,对大鼠卵巢上皮癌腹腔转移瘤的治疗效果.方法采用酶切、去磷酸化、连接、重组的方法,构建携带B7-1基因的逆转录病毒表达载体pLmB7-1SN ,以脂质体介导法,建立高表达细胞株NuTu-19/B7-1、NuTu-19/IL-12及双基因联合表达细胞株NuTu-19/IL-12-B7-1,并以转染空载体pLXSN的细胞NuTu-19/Neo为对照组.观察各组细胞在大鼠体内的致瘤性;将经丝裂霉素C处理的各组肿瘤细胞,以皮下接种方式免疫动物,观察其对卵巢癌腹腔转移大鼠模型生存期的影响,及对大鼠脾淋巴细胞增殖及诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性的作用.结果本研究构建pLmB7-1SN成功.建立的NuTu-19/B7-1、NuTu-19/IL-12和NuTu-19/IL-12-B7-1细胞株中mB7-1和mIL-12稳定表达.与对照组细胞相比,各组肿瘤细胞在动物体内的致瘤性有不同程度下降.B7-1组[NuTu-19/BT-1(B7-1单独免疫)]和IL-12组[NuTu-19/IL-12(IL-12单独免疫)]大鼠的脾淋巴细胞增殖指数(PI)分别为2.4和4.6,后者与对照组(PI=1.05)相比,差异有显著性(P<0.05),而联合组[NuTu-19/IL-12-B7-1(IL-12+B7-1联合免疫)]PI为10.2,与对照组和B7-1组、IL-12组相比,差异有极显著性(P<0.01).诱导CTL杀伤活性的作用,B7-1组(15.0%)和IL-12组(31.5%)明显强于对照组(2.6%)(P<0.05,P<0.01);而联合组(52.4%)与对照组、B7-1组及IL-12组相比,差异均有显著性(P<0.05).B7-1组或IL-12组荷瘤动物生存期均有所延长(分别为56.2 d和59.8 d),但与对照组(53.4 d)相比,差异无显著性(P>0.05),而联合组(66.0 d)与对照组相比,差异有显著性(P<0.05). 结论 IL-12和B7-1联合制备的肿瘤细胞疫苗,通过刺激CTL增殖、成熟和增强CTL对肿瘤细胞的识别及杀伤活性,诱导机体抗肿瘤免疫反应, 对提高卵巢癌的治疗效果具有重要意义.
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胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶基因治疗联合放疗对裸鼠子宫颈癌移植瘤生长抑制作用的研究
目的探讨胞嘧啶脱氨酶(CD)/5-氟胞嘧啶(5-FC)基因治疗联合放疗对裸鼠宫颈癌移植瘤的生长抑制作用,以及CD/5-FC基因治疗与放疗之间是否具有协同作用.方法将24只鼠龄6～8周成功接种了HeLa细胞的BALB/C雌性裸鼠,随机分为对照组、基因治疗组、放疗组以及联合治疗组,每组6只,观察各组治疗前后的肿瘤体积、肿瘤生长抑制率及肿瘤体积增加倍数.结果(1)治疗21 d后,基因治疗组裸鼠的肿瘤体积是(728±201)mm3,联合治疗组是(357±113)mm3,放疗组是(739±419)mm3,对照组是(1168±380)mm3,基因治疗组、联合治疗组、放疗组肿瘤体积均小于对照组,3组分别与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);联合治疗组肿瘤体积小于基因治疗组及放疗组,前者分别与后两组比较,差异有统计学意义(P<0.05).(2)放疗组的肿瘤生长抑制率为36.74%,基因治疗组为37.66%,联合治疗组为69.45%,联合治疗组明显高于放疗组及基因治疗组,前者分别与后两组比较,差异有统计学意义(P<0.05).(3)联合治疗组平均肿瘤体积增加倍数为7.71倍,基因治疗组为19.16倍,放疗组为18.86倍,对照组为40.57倍.析因设计的方差分析结果,CD/5-FC基因治疗与放疗之间有交互作用(P=0.03),当与放疗联合使用时,CD/5-FC基因治疗的疗效大于其单独使用时所产生的疗效;当与CD/5-FC基因治疗联合应用时,放疗的疗效大于其单独使用时所产生的疗效.结论 CD/5-FC基因治疗与放疗联合应用,对裸鼠宫颈癌移植瘤的生长具有抑制作用,并且两者之间具有协同作用.
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内皮抑素真核表达载体对移植性卵巢癌的抑制作用
目的探讨脂质体介导的内皮抑素真核表达载体对裸鼠移植性卵巢癌的抑制作用.方法利用已构建的内皮抑素真核表达载体pVAX1-sEn,在脂质体介导下转染卵巢癌细胞系3AO细胞, RT-PCR技术检测3AO细胞中内皮抑素mRNA的表达,酶联免疫吸附实验 (ELISA)法检测3AO细胞上清液中内皮抑素的水平,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测3AO细胞上清液中的内皮抑素对脐静脉内皮细胞系ECV-204细胞的抑制作用.将荷卵巢癌移植瘤裸鼠分为3组,pVAX1-sEn治疗组、pVAX1对照组和生理盐水对照组,分别观察3组卵巢癌的生长情况.结果 RT-PCR 技术检测结果显示,在610 bp处有一内皮抑素mRNA的特异性条带;ELISA法检测结果显示, pVAX1-sEn转染3AO细胞后其上清液中内皮抑素水平为(201±8)ng/ml; MTT法检测结果显示,pVAX1-sEn转染3AO细胞后其上清液中的内皮抑素可有效抑制ECV-204细胞的生长,高抑制率为42%.pVAX1-sEn治疗组肿瘤体积为(0.85±0.18)cm3,显著小于生理盐水对照组的(1.90±0.28)cm3和pVAX1对照组的(1.78±0.32)cm3(P<0.05).肿瘤组织HE染色显示, pVAX1-sEn 治疗组肿瘤细胞坏死明显,而生理盐水对照组及pVAX1对照组肿瘤细胞生长旺盛.结论脂质体介导的pVAX1-sEn瘤内注射可有效抑制卵巢癌移植瘤的生长.
