猴眼视网膜下注射方法的建立

目的: 探索一种简便、有效的视网膜下注射方法. 方法: 利用自制玻璃微穿刺针系统,在猴视网膜黄斑区进行视网膜下药物注射. 猕猴30只(30眼),其中,15只眼在进行视网膜下药物注射的前1 d接受黄斑周围激光光凝. 结果: 30只眼中,29只眼的视网膜下注射为一次成功. 1只在预先的BSS注射时形成视网膜内界膜隆起,重复穿刺成功. 2只黄斑周围进行过激光光凝眼(2/15),发生黄斑中心凹破裂. 术中无严重的视网膜出血,未发生脉络膜损伤. 术后观察3～42 d,未发生孔源性视网膜脱离等并发症. 结论: 自制的玻璃微穿刺针视网膜下注射系统简单易行、成功率高、可控性好.

胃癌相关基因和基因治疗

0 引言 肿瘤发生的直接原因是基因的改变，致使正常细胞转变成肿瘤细胞，癌基因的激活与抑癌基因的失活起了重要作用. 近年来与胃癌发生有关的癌基因和抑癌基因受到重视，如何扭转或恢复癌基因或抑癌基因的异常改变也成为防治胃癌的研究热点.

进一步加强病毒性肝炎基因治疗的研究

0 引言病毒性肝炎是目前严重危害人类健康的常见的世界性感染性疾病之一,迄今仍无有效抗病毒药物.

旁分泌形式作用的人AngiostatinK(1-3)抑制大鼠C6脑胶质瘤的研究

目的:研究人AK(1-3)[Angiostatin Kringle(1-3)]对大鼠C6脑胶质瘤的抑瘤效应.方法:利用基因转染的方法获得重组人AK(1-3)基因的C6胶质瘤细胞;以细胞增殖试验及免疫组化等方法检测转染细胞株是否表达了具有生物活性的人AK(1-3).正常大鼠C6脑胶质瘤模型作对照,研究转染细胞株在大鼠脑内的致瘤性.脑组织切片进行Ⅷ因子染色.结果:大鼠C6胶质瘤细胞稳定表达的人AK(1-3),在体外明显抑制牛主动脉内皮细胞的增殖;在体内明显抑制了大鼠C6脑胶质瘤的生长.试验组脑切片内仅见显微瘤灶,Ⅷ因子染色少见新生毛细血管.结论:旁分泌形式作用于大鼠C6脑胶质瘤内血管内皮细胞的人AK(1-3)可明显抑制肿瘤的血管生成,进而抑制肿瘤的生长和转移.

组织型纤溶酶原激活物基因疗法防治血管吻合口血栓栓塞

目的探讨防止血管吻合口血栓栓塞的新方法，了解组织型纤溶酶原激活物基因疗法防止吻合口血栓栓塞的效果. 方法①将含有t-PA基因的重组质粒pAdCMVt-PA与缺陷型腺病毒大框架pJM17共转染病毒包装细胞293细胞，获得有感染能力但复制缺陷的重组腺病毒AdCMVt-PA. ②实验动物随机分为对照组和治疗组，均用11-0尼龙缝线行大鼠颈总动脉原位端端吻合. 治疗组吻合口注射AdCMVt-PA溶液，对照组注射AdCMV（不含t-PA的空载体）. 提取吻合口组织的总RNA行RT-PCR，应用发色底物法检测吻合口组织的纤溶酶活力. 结果治疗组RT-PCR在2.0 kb前面有一条带，对照组则没有. 治疗组术后第2，3，5，7和14 日均可检测到纤溶酶活力，但第3日活力高，对照组未检测到纤溶酶活力. 结论克隆入腺病毒载体的t-PA基因可在吻合口组织中表达出有生物学活性的t-PA，可能有效地抑制吻合口血栓形成，提高吻合口通畅率.

短发卡RNA抑制survivin表达并诱导CNE-2细胞凋亡

目的 观察以短发卡RNA(shRNA)抑制鼻咽癌细胞survivin表达对细胞凋亡与增殖的影响.方法 构建特异性survivin shRNA,转染CNE-2细胞.分组:A组为空白对照组；B组为阴性干扰组,转染pSIREN-survivin/nonsenseshRNA;C组为阳性干扰24 h组,转染pSIREN-survivin/shRNA;D组为阳性干扰48 h组,转染pSIREN-survivin/shRNA.以RT-PCR、Western-blot分别测定细胞survivin mRNA及蛋白,PI、TUNEL及MTT检测细胞周期、凋亡率、细胞增殖.结果 转染效率约(70.90±4.76)％；C组survivin mRNA和蛋白抑制率分别为(41.58±0.63)％、(68.29±0.52)％；D组抑制率分别为(63.64±0.96)％、(70.83±0.48)％.C组凋亡率为(36.24±0.78)％,D组为(50.37±0.85)％,显著高于B组和A组；S期细胞减少,G2/M期比例增高；MTT结果提示细胞增殖受到明显抑制.结论 特异性shRNA可有效干扰CNE-2内survivin的表达,诱导细胞凋亡并抑制其过度增殖.

pEGFP-N1-TNFα表达载体的构建与鉴定

目的 构建pEGFP-Nl-TNFα重组质粒并鉴定,为转导CIK细胞并定位表达奠定基础.方法 以pMD19 Simple T-TNFα为模板,PCR扩增TNFα CDS区片段,将PCR产物进行15 g/L琼脂糖凝胶电泳,并回收TNFα条带,用BglⅡ和HindⅢ将TNFa的PCR片段及目的载体pEGFP-N1双酶切,然后进行连接.连接产物转化至DH5α中.挑取克隆,提质粒,进行鉴定.结果 PCR扩增片段、双酶切出现722 bp大小的目的基因条带与预期结果相符；插入片断测序结果与合成的寡核苷酸序列一致.结论 成功构建了重组质粒pEGFP-N1-TNFα,为下一步用纳米材料转染CIK细胞的研究奠定了基础.

survivin基因启动子驱动的肿瘤特异性腺病毒载体的构建

目的:构建肿瘤特异性启动子驱动的腺病毒载体,检测survivin基因启动子在喉癌细胞中的特异表达活性.方法:PCR扩增survivin启动子,构建分别携带survivin启动子和CMV启动子的真核表达栽体pCMV-EGFP和pSurp-EGFP,体外连接法制备重组腺病毒Ad-SP-EGFP和Ad-CMV-EGFP,后转染Hep-2细胞及血管内皮细胞ECV304,荧光显微镜下观察EGFP表达.结果:成功构建survivin基因启动子的腺病毒载体;Ad-SP-EGFP转染后荧光镜下见Hep-2细胞发出较强的绿色荧光,而ECV304细胞无表达.结论:成功制备肿瘤特异性survivin启动子驱动的腺病毒,为进一步开发肿瘤的特异性基因治疗奠定了实验基础.

HSV-tk/GCV自杀基因系统治疗小鼠喉癌的实验研究

目的:研究逆转录病毒介导的HSV-tk/GCV系统对荷人喉癌小鼠的抑瘤作用及体内旁观者效应.方法:将含HSV-tk基因的重组逆转录病毒感染人喉癌细胞Hep-2,G418筛选出抗性克隆,命名为Hep-2/tk.将Hep-2/tk细胞单独或Hep-2/tk细胞与未经基因修饰的Hep-2细胞等比例混合接种小鼠皮下,联合应用GCV,观察其抑瘤作用及体内旁观者效应.结果:GCV治疗后,Hep-2/tk细胞或Hep-2/tk细胞与Hep-2细胞等比例混合所致荷瘤鼠与对照组相比,肿瘤的生长明显受到抑制(P＜0.01).结论:逆转录病毒介导的HSV-tk/GCV系统对荷人喉癌小鼠具有明显的抑瘤作用及体内旁观者效应.该系统有望成为喉癌的有效治疗途径.

人骨形态发生蛋白2基因治疗大鼠牙槽骨缺损的实验研究

目的:观察重组腺相关病毒(rAAV)介导的人骨形态发生蛋白2 (hBMP2)对大鼠实验性牙槽骨缺损的修复作用.方法:将30只实验大白鼠随机分为实验组和对照组.在两组动物下颌1 1 牙间牙槽骨人工制备2mm×2mm骨缺损区.实验组骨缺损区植入浸有携目的基因hBMP2和标记基因绿色荧光蛋白(GFP)的重组腺相关病毒液(rAAV-hBMP2-GFP)的明胶海绵块,对照组植入只浸有携GFP的空病毒液(AAV-GFP)的明胶海绵块.术后15d、30d、60d分别处死动物,进行放射学和组织学观察. 结果:①两组样本牙槽骨缺损处的骨密度值随时间的增加而增高;在15d、30d、60d,实验组样本牙槽骨缺损处骨密度值(0.062,0.236,0.456)均高于对照组(0.054,0.158,0.216),其中30d、60d两组有显著性差异(P＜0.05,P＜0.01).②术后15d两组样本牙槽骨缺损处周边组织均可见到GFP;术后30d、60d,实验组样本较对照组绿色荧光强度明显加强.③实验组:术后15d,牙槽骨人工缺损区周围成纤维细胞和毛细血管生长活跃,周边有骨样组织和少量的骨组织形成.术后30d,骨缺损处新骨数量增多.术后60d,缺损区几乎被新生骨组织充满;对照组:术后15d可见少量炎性细胞,成纤维细胞和毛细血管生长活跃;术后30d,骨缺损区周边可见成骨细胞和少量骨样组织;术后60d,骨缺损区边缘有少量新骨沉积,腔内被纤维组织充满.结论:rAAV- hBMP2- GFP成功修复大鼠实验性牙槽骨缺损.

基因疗法治疗慢性心肌缺血

基因疗法中非整合型病毒载体的应用

在过去的十年间,基因疗法在肿瘤、遗传性疾病以及传染性疾病等多个领域的临床治疗中取得了突破性进展.在基因疗法中,广泛地应用了各种各样的病毒载体,按其生活史可分为整合型病毒载体(如 γ-逆转录病毒、慢病毒)和非整合型病毒载体(如腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒和痘病毒).腺病毒、单纯疱疹病毒是溶瘤病毒中常用的病毒载体,能优先感染肿瘤细胞,经复制后造成其裂解.这些病毒的特点是基因携带量大,但只能维持较短时间的外源性基因表达,加之免疫原性较强,因此需要采取肿瘤内注射的给药方式.腺相关病毒则由于其较低的免疫原性和持久的表达能力而被广泛使用于遗传缺陷性疾病的基因替代疗法中.现就用于直接在体细胞内进行稳定表达的非整合型病毒载体作一概述.

自杀基因及其旁观者效应治疗肿瘤研究进展

近年来，肿瘤基因治疗已得到长足的发展。其中国内外对自杀基因疗法研究较多，研究发现自杀基因还有一种独特的效应，称之为旁观者效应。 1 自杀基因……

人甲胎蛋白增强子驱动自杀基因靶向杀伤肝癌细胞的实验研究

目的 探讨人AFP增强子驱动的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)/丙氧鸟苷自杀基因系统体内外靶向杀伤肝癌细胞的效应.方法 构建人AFP增强子驱动的pAFP-cDNA3.1-TK自杀基因真核表达质粒;利用脂质体将质粒转染入AFP阳性肝癌细胞株HcpG2和AFP阴性肝癌细胞株SMMC7721;采用RT-PCR和Western blot检测TK mRNA和蛋白表达;MTT检测细胞的存活率;观察丙氧鸟苷对肝癌细胞体外增殖、生长曲线和细胞凋亡的作用,以及丙氧鸟苷体内抑制肿瘤生长的效应.采用t检验分析相关数据.结果 成功构建pAFP-cDNA3.1-TK自杀基因真核表达质粒并转染入肝癌细胞;AFP阳性肝癌细胞株HepG2中能检测到TKmRNA和蛋白表达;丙氧鸟苷呈剂量和时间依赖性抑制转染后肝癌细胞株HepG2的生长并诱导其凋亡;AFP阴性肝癌细胞株SMMC7721中没有TKmRNA和蛋白表达,细胞增殖、生长曲线和凋亡均不受影响,两者比较,差异有统计学意义(t=2.58,2.73,3.12,P＜0.05).丙氧鸟苷可以特异性地抑制转染后肝癌细胞株HepG2治疗组中肿瘤的生长,肿瘤抑制率为46%,而在转染后肝癌细胞株SMMC7721治疗组中,对肿瘤生长无明显抑制作用,两者比较,差异有统计学意义(t=3.36,P＜0.05).结论 人AFP增强子驱动的HSV-TK/丙氧鸟苷自杀基因系统可以靶向杀伤AFP阳性肝癌细胞,抑制肿瘤生长.

肺变应性疾病的中西医结合治疗

所有肺变应性疾病的治疗,首先应该从去除病因着手.遗传体质和环境变应原是导致肺变应性疾病的重要病因.遗传因素使患者易患肺变应性疾病,用基因疗法来改变患者的易感性应是理想治疗,但由于技术原因,目前肺变应性疾病的基因治疗还不成熟.

积极审慎地开展创面愈合的基因治疗研究

尽管基因治疗的早思路是用于治疗单基因遗传性疾病,如囊性纤维化(CF),但近年来这一技术已被广泛应用于刺激特异性免疫反应、介导细胞杀伤等诸多领域.在组织修复方面,人们希望通过基因转移技术去影响组织修复的自然过程,使正常条件下创面愈合的时间缩短,加速或使难愈的创面愈合[1,2].但近年来,实验室与临床初试的结果尚没有完全证明该方法具有优于或完全能替代其他方法的优越之处,特别是有关转基因疗法应用于创面修复的目的性、安全性以及实用手段等问题尚未完全解决.故在临床应用前有必要就以下几个问题进行更加深入的思考与研究.

心肌营养素-1基因治疗大鼠脑损伤后心肌营养素-1和caspase-3的表达变化

目的 观察外源性心肌营养素-1(CT-1)基因被载体重组腺病毒(Adv)导入损伤大脑细胞后在细胞中表达的情况及其对凋亡基因半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3(caspase-3)表达的影响,了解CT-1对损伤大脑神经元的作用和机制. 方法 建立大鼠创伤性脑损伤(TBI)模型,于损伤脑区局部注射Adv-CT-1,应用免疫组化技术检测伤后及治疗后CT-1和caspase-3基因的表达变化. 结果 TBI后1,3,7 d,大脑皮层和海马等损伤脑区CT-1基因表达轻度增加;伤后12 h、1,3,7 d,在大脑皮层和海马等损伤脑区caspase-3基因表达明显增加,1 d达高峰,3～7 d逐渐降低.Adv-CT-1转染损伤脑区治疗后12 h～7 d,大脑皮层和海马等损伤脑区CT-1表达明显增加,7 d达高峰;治疗后12 h～7 d在大脑皮层和海马等损伤脑区caspase-3基因表达较损伤对照组明显减少. 结论 TBI后CT-1基因表达轻度增加,可能是机体对脑损伤后的反馈性保护机制;伤后caspase-3基因表达增加,是创伤后神经细胞凋亡的内在原因.伤后Adv-CT-1转染治疗可使CT-1基因在受损大脑中表达增加,而CT-1可下调凋亡基因caspase-3的表达,这可能是CT-1保护损伤神经元、促进神经功能恢复的内在机制.

基因修饰的组织工程骨联合血管束植入修复节段性骨缺损

目的 评价骨形态发生蛋白2(BMP-2)基因修饰的组织工程骨联合血管束植入修复节段性骨缺损效果.方法 分离培养兔骨髓基质干细胞,经BMP-2基因转染后复合异种骨支架体外构建基因修饰的组织工程骨.建立兔双侧桡骨缺损(2.0 cm)模型,采用4种方法修复:A组:基因修饰的组织工程骨+血管束植入;B组:基因修饰的组织工程骨;C组:无基因修饰的组织工程骨+血管束植入;D组:单纯支架.术后4、8、12周行X线检查、计量组织学检查、生物力学测定和微血管墨汁灌注等观察血管形成及成骨情况.结果 A组缺损区在成骨活跃程度、再生骨量等方面均显著优于其他组,血管束发出分支向移植骨内长入,血管再生旺盛,其骨缺损得到了较彻底的修复.B组在BMP-2基因诱导下成骨速度和质量优于C组;而D组缺损内主要形成纤维组织.结论 BMP-2基因治疗联合血管束植入具有良好的成骨及血管化效果,对骨不连、长段骨缺损的治疗具有重要意义.

野生型p16基因对人瘢痕疙瘩成纤维细胞生长及代谢影响的实验研究

目的探讨野生型p16基因对人瘢痕疙瘩成纤维细胞(keloid fibroblasts, KFb)生长增殖及DNA合成代谢的影响. 方法构建含p16cDNA片段的真核表达载体pcDNA3-p16,采用脂质体介导的基因转染法,将其导入体外培养的KFb中,并用G418筛选阳性克隆.随后对已转染及未转染的KFb进行免疫细胞化学染色,观察p16蛋白的表达,并通过绘制细胞生长曲线及采用氚标记胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TdR)掺入法,比较转染前后细胞在生长增殖及DNA合成代谢方面的变化.结果经酶切鉴定证实,pcDNA3-p16构建成功.已转染的KFb经G418筛选,出现阳性克隆,并有p16蛋白表达;与正常KFb比较,其生长增殖速度明显减缓,DNA合成代谢能力明显减弱(P<0.05). 结论 p16基因对KFb的生长增殖及DNA合成代谢有明显的抑制作用.

骨折愈合的现代研究与局部基因治疗

本文综述了近年来有关骨折愈合研究的部分文献.作者认为,生长因子在骨折愈合中起着重要的作用.应用生长因子或其基因疗法有望成为一种骨折治疗的重要方法,特别是应用能诱导未分化间质细胞定向分化为成骨细胞的骨形态发生蛋白的基因治疗,具有应用价值.