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靛玉红对喉癌Hep-2细胞增殖的影响及机制
目的:探讨靛玉红甲肟(IRO)对人喉癌Hep -2细胞增殖的影响及机制.方法:MTT法检测不同浓度、不同作用时间IRO对Hep -2细胞增殖活性的影响.流式细胞仪检测IRO对Hep -2细胞周期的影响.Western法检测IRO对Hep -2细胞CDK4和cyclin D1蛋白表达的影响.结果:MTT结果发现IRO对Hep -2细胞具有明显的增殖抑制作用,且表现为剂量依赖性(P＜0.01).流式检测发现,以10μ mol/L的IRO处理Hep -2细胞后,细胞阻滞于G0/G1期,不同浓度组间差异存在显著性(P＜0.01).Western结果发现IRO对Hep -2细胞CDK4和cyclin D蛋白的表达有抑制作用(P＜0.01).结论:IRO具有抑制人喉癌Hep -2细胞增殖的作用,其机制与阻滞细胞于G0/G1期有关.
关键词： 喉癌 靛玉红甲肟 Hep-2 细胞周期 CDK4 cyclin D1 -
靛玉红对喉癌Hep-2细胞增殖的影响及机制
目的:探讨靛玉红甲肟(IRO)对人喉癌Hep-2细胞增殖的影响及机制.方法:MTT法检测不同浓度、不同作用时间IRO对Hep-2细胞增殖活性的影响.流式细胞仪检测IRO对Hep-2细胞周期的影响.Western法检测IRO对Hep-2细胞CDK4和cyclin D1蛋白表达的影响.结果:MTT结果发现IRO对Hep-2细胞具有明显的增殖抑制作用,且表现为剂量依赖性(P＜0 01).流式检测发现,以10μmol/L的IRO处理Hep-2细胞后,细胞阻滞于G0/G1期,不同浓度组间差异存在显著性(P＜0 01).Western结果发现IRO对Hep-2细胞CDK4和cyclin D蛋白的表达有抑制作用(P＜0 01).结论:IRO具有抑制人喉癌Hep-2细胞增殖的作用,其机制与阻滞细胞于G0/G1期有关.
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D3细胞的制备及其对几种病原体的敏感性研究
目的制备基因转染(D3)细胞并测定能引起先天性感染的几种病原体的敏感性.方法HEP-2细胞的DNA转染人胚肺细胞(HEL),得到基因转染细胞,命名为D3细胞.分析D3细胞的核型.研究丹参对D3细胞促增殖作用和丹参对病原体不同的促增殖作用.普通显微镜观察病原体感染D3细胞后的细胞病变.免疫荧光试验研究D3细胞对病原体的敏感性.电子显微镜观察由D3细胞培养物纯化的病原体形态.在酶联免疫吸附试验(ELISA)中,分别纯化病原体制作抗原,检测1196份孕妇血清特异性抗体(IgG、IgM).结果传代5～100代的D3细胞的染色体数均是96.丹参(SMB,100μg/ml)对D3细胞和病原体有明显的促增殖作用.D3细胞感染病原体后72 h,均出现明显的细胞病变效应(CPE)和荧光阳性细胞.电镜下见到了病原体典型的形态.结论永生性的D3细胞可用于培养病原体,所培养的病原体可制备用于诊断的抗原.
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RNA干扰抑制Hep-2细胞人端粒酶逆转录酶基因表达对放射敏感性的影响
目的 构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因特异性短发夹样RNA(shRNA)真核表达载体,观察其联合射线对人喉癌Hep-2细胞端粒酶活性和细胞存活的影响,研究hTERT基因在放射增敏中的作用.方法 根据hTERT mRNA编码序列设计RNA干扰(RNAi)靶点,构建重组表达质粒pshRNA-hTERT,构建成功后,转染Hep-2细胞并作射线处理,用端粒重复序列扩增方法(TRAP-PCR-ELISA)检测端粒酶活性的动态变化,采用克隆形成分析方法观察质粒pshRNA-hTERT对Hep-2细胞放射敏感性的影响,计算放射增敏比SERSF2.结果 转染质粒pshRNA-hTERT后,Hep-2细胞的hTERT mRNA表达抑制率为60.8%,质粒pshRNA-hTERT不仅能够抑制Hep-2细胞的端粒酶活性(P＜0.05),而且还可以抑制辐射诱导的端粒酶活性上升(P＜0.05).照射前经pshRNA-hTERT处理24 h,明显降低了2 Gy照射后Hep-2细胞的存活分数(85.7%),与单纯放射组(67.7%)相比,差异有统计学意义(P＜0.05),pshRNA-hTERT的放射增敏比SERSF2为1.27.结论 RNAi显著抑制了靶基因hTERT的表达,质粒pshRNA-hTERT能明显抑制2Gy照射诱导的Hep-2细胞端粒酶活性升高,并显著提高其体外放射敏感性;质粒pshRNA-hTERT的放射增敏作用可能与端粒酶活性受抑制有关.
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带FLAG标签的CDK4真核表达载体构建及对喉癌细胞的影响
目的 构建带Flag标签的pcDNA3.0载体细胞周期蛋白依赖性激酶4(cyclin-dependent kinase,CDK4)的真核表达载体,验证该基因对喉癌Hep-2细胞增殖的影响.方法 以人乳腺文库为模板采用聚合酶链反应(PCR)技术扩增出CDK4的CDS区编码序列,应用双酶切将带Flag标签pcDNA3.0载体插入到PCR产物上,转化DH5α提取质粒,测序正确后转染喉癌Hep-2细胞,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测CDK4基因的转录水平,蛋白质印迹鉴定目的基因蛋白表达,CCK-8法和克隆形成实验测定其对喉癌Hep-2细胞生长的影响.结果 pcDNA3.0-Flag-CDK4真核表达载体构建成功;提取质粒转染Hep-2细胞,qRT-PCR技术检测到该基因在Hep-2中转录水平明显增高;蛋白质印迹实验验证该基因蛋白成功表达;CCK-8法和克隆形成实验证明CDK4基因可促进Hep-2细胞增殖.结论 pcDNA3.0-Flag-CDK4真核表达载体构建成功并验证该基因促进喉癌细胞增殖,为进一步研究该基因在喉癌中的发生发展奠定了前期基础.
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核苷二磷酸激酶A亚基的纯化、鉴定及其对顺铂抗癌作用的增强
目的了解核苷二磷酸激酶A亚基(NDPK-A)能否提高顺铂的抗癌效果.方法利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western印迹杂交来监测和鉴定目标蛋白NDPK-A,利用离子交换、亲和层析结合高效液相色谱纯化分离目标蛋白;MTT比色法测定药物对细胞生长抑制率的影响.结果获得NDPK-A单体蛋白,酶比活为8 mmol*min-1*g-1蛋白质;细胞生长抑制率显示,NDPK-A单独处理细胞时未见明显的细胞毒性,但与顺铂联合处理却能大大加强后者对鼠肺腺癌细胞LA795和人喉癌细胞Hep-2的细胞毒性.结论 NDPK-A与顺铂联用能增强顺铂对体外培养的鼠肺腺癌细胞LA795和人喉癌细胞Hep-2的杀伤作用.
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靛玉红对喉癌Hep-2细胞侵袭能力的影响及机制
目的 探讨靛玉红甲肟(Indirubin-3’-monoxirne,IRO)对人喉癌Hep-2细胞迁移和侵袭的影响及其机制.方法 MTT法检测不同浓度、不同作用时间IRO对Hep-2细胞增殖活性的影响.Boyden chamber实验计算各组穿膜的细胞数以比较靛玉红甲肟对细胞侵袭能力的变化.明胶酶谱检测不同浓度靛玉红甲肟处理喉癌Hep-2细胞后细胞MMP-9和MMP-2活性的变化.结果 MTT结果发现IRO对Hep-2细胞具有明显的增殖抑制作用,且表现为剂量依赖性(P＜0.01).Boydenchamber体外迁移和侵袭实验结果显示:靛玉红甲肟可以显著抑制人喉癌Hep-2细胞的侵袭能力(P＜0.05).明胶酶谱检测发 现以靛玉红甲肟处理24h后人喉癌Hep-2细胞MMP-9和MMP-2活性明显降低,不同浓度组间存在显著性差异.结论 靛玉红甲肟具有抑制人喉癌Hep-2细胞株增殖和侵袭的作用,其作用机制与显著抑制MMP-9和MMP-2活性有关.
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MDCK、Hep-2和Vero混合细胞体外培养条件的优化
目的 优化MDCK、Hep-2和Vero混合细胞(下文简称MHV-mix细胞)体外共培养的培养条件.方法 在传统培养方法的基础上改进一项或多项,如细胞消化液、培养液及血清含量、气体和酸碱度的变化等,培养MHV-mix细胞,通过观察细胞生长状态,并用台盼蓝染色细胞,通过台盼蓝拒染率计算细胞存活率并绘制细胞生长曲线,从而对各种培养条件的优劣做出综合比较.结果 改进多项培养条件后细胞增殖更快、生长状态更好,细胞存活率从85％升为98％.结论 改进的实验条件更适合MHV-mix细胞的培养,可作为这3种细胞体外共培养的条件.
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丝裂霉素对喉癌细胞生长的影响
目的:探讨丝裂霉素(MMC)对人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞活性的影响.方法:采用体外细胞培养实验方法,应用MTT、台盼蓝拒染等技术检测MMC对Hep-2细胞活力的影响,同时应用nm23免疫组化染色检测nm23蛋白的表达水平.结果:Hep-2细胞在MMC作用下,48h后细胞死亡率达90%,nm23蛋白在喉癌细胞中随MMC作用时间的延续表达量增多.结论:丝裂霉素影响人喉癌细胞(Hep-2)的生长,降低Hep-2细胞的活性而达到治疗作用.
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金纳米链与人喉癌Hep-2细胞共培养自由进出细胞的形式
背景 金纳米颗粒对肿瘤细胞具有杀伤效应.目的 观察金纳米链对人喉癌Hep-2 细胞增殖的影响.方法 首先运用葡萄糖体系合成法制备金纳米链溶胶,然后MTT 法检测不同终浓度(10%,25%,50%,75%,95%)金纳米链溶胶对人喉癌Hep-2 细胞增殖的影响,并通过电镜观察金纳米链进出Hep-2 细胞的过程.结果 与结论 金纳米链在75%和95%高浓度时对Hep-2 细胞增殖有一定的抑制,但并没有随着浓度的增加而加重,均属于一级范围,表明金纳米链对人喉癌Hep-2 细胞无毒性.金纳米链在与Hep-2 细胞共培养8 h 后即能以胞吞的方式进入细胞,48 h 后大部分出胞,能够自由进出细胞.
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花脸蘑多糖LSPb1在喉癌细胞裸鼠移植瘤模型中抑制血管形成
目的 研究花脸蘑多糖(LSPb1)在体内对喉癌血管新生的作用,探究其抗肿瘤的作用机制.方法 ELISA检测体外培养的喉癌Hep-2细胞在低氧环境下分泌血管内皮生长因子(VEGF)的量;异种移植瘤模型研究LSPb1对移植瘤体积的影响;ELISA和RT-PCR检测移植瘤内VEGF蛋白和mRNA水平的表达;免疫组化定量分析移植瘤组织中新生血管的数量.结果 在Hep-2细胞中,LSPb1显著抑制了VEGF的分泌(P＜0.001).在Hep-2异种移植瘤模型荷瘤裸鼠中发现LSPb1显著抑制了瘤体的生长(P＜0.05);与对照组相比,LSPb1处理移植瘤中VEGF mRNA水平无表达,VEGF因子的表达下降(P＜0.01),血管密度显著下降(P＜0.01).结论 LSPb1作为一个潜在的喉癌治疗药物有望在治疗人喉癌中发挥重要的作用.
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Kai1/CD82对人喉癌Hep-2细胞株增殖能力的影响
目的 探讨肿瘤转移抑制基因Kai1/CD82对人喉癌Hep-2细胞株增殖能力的影响.方法 以喉癌Hep-2细胞株为研究对象,将携带有Kail基因的重组腺病毒(rAd-Kail)进行扩增、纯化并测定其滴度,用适量rAd-Kail转染人喉癌Hep-2细胞株,以转染空病毒载体及未转染Kail的喉癌细胞株为对照,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定Kail对细胞增殖能力的影响,用RT-PCR技术对转染后的细胞进行检测.结果 rAd-Kail经扩增、纯化后,滴度可达6×10~(10) PFU/ml,当病毒量为30 MOI时,Hep-2细胞的转染率可达90%以上.MTT实验显示转染空腺病毒组与未转染组比较,Hep-2细胞株体外增殖能力无统计学差异,转染Kail组Hep-2细胞株体外增殖能力明显弱于未转染组(P<0.05),抑制率可达29%.结论 肿瘤转移抑制基因Kai1/CD82对喉癌细胞株体外增殖能力具有抑制作用.
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EZH2对人喉鳞状细胞癌HEP-2增殖、迁移和侵袭的影响
目的:探讨Zeste基因增强子同源物2(EZH2)在人喉鳞状细胞癌组织和HEP-2、SCC 10A细胞中的表达及其对人喉鳞状细胞癌细胞HEP-2增殖、迁移和侵袭的影响.方法:收集宣城中心医院30例喉鳞状细胞癌和10例癌旁正常喉黏膜组织标本,qRT-PCR检测喉鳞状细胞癌组织和癌旁组织以及喉鳞状细胞癌细胞HEP-2、SCC10A中EZH2的表达.采用Lipofectamine2000将EZH2shRNA质粒转染至HEP-2细胞中,通过qRT-PCR和Western blot检测EZH2shRNA的转染效率,并通过Western blot检测EZH2下游相关信号分子的表达水平.CCK8实验检测HEP-2细胞的增殖,划痕实验和Transwell侵袭实验检测细胞的迁移、侵袭能力.运用裸鼠体内成瘤实验检测EZH2对HEP-2细胞体内成瘤能力的影响.结果:EZH2在喉鳞状细胞癌组织及细胞中显著高表达(P＜0.01).EZH2shRNA质粒转染后可抑制细胞的增殖能力,细胞的迁移和侵袭也均受到明显抑制.裸鼠体内成瘤实验结果显示,EZH2shRNA组的HEP-2细胞肿瘤形成能力明显减弱.结论:EZH2在喉鳞状细胞癌组织和细胞中高表达;EZH2shRNA能够在体外抑制喉鳞状细胞癌细胞HEP-2的增殖、迁移和侵袭,并抑制RAF1-ERK信号通路的活化;EZH2能够在体内抑制喉鳞状细胞癌细胞HEP-2的成瘤能力.
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survivin基因启动子的克隆及其在人喉癌Hep-2细胞中的特异性表达
目的:构建survivin启动子调控的真核表达载体pSurp-EGFP,利用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)检测该启动子在Hep-2细胞中的特异表达活性.方法:PCR扩增survivin启动子,置换pShuttle载体中的CMV启动子,构建质粒pSurp;分别双酶切pShuttle、 pSurp和pEGFP-C1载体,构建分别携带survivin启动子和巨细胞病毒(CMV)启动子的真核表达载体pCMV-EGFP和pSurp-EGFP;脂质体法转染Hep-2细胞及血管内皮细胞ECV304,荧光显微镜下观察EGFP的表达.结果:成功扩增survivin基因启动子,构建了survivin基因启动子调控的真核表达载体pSurp-EGFP,用其转染两种细胞后,荧光显微镜下见Hep-2细胞发出较强的绿色荧光,而ECV304细胞没有表达.结论:成功克隆survivin启动子,其在Hep-2细胞具有较强的肿瘤特异性启动活性,为进一步开发肿瘤的特异性基因治疗奠定了实验基础.
关键词： Survivin基因 启动子 基因治疗 绿色荧光蛋白 Hep-2 -
红豆杉细胞提取物对肿瘤细胞SMMC-7721和HEp-2的作用研究
目的了解红豆杉细胞提取物对肿瘤细胞SMMC-7721和HEp-2生长的影响及其抑制机制.方法运用MTT比色法测定细胞毒性和流式细胞仪分析细胞周期.结果红豆杉细胞提取物对SMMC-7721和HEp-2的IC50分别为0.161 4 g DCW*L-1和0.275 6 g DCW*L-1.细胞周期分析发现两肿瘤细胞G2～M期含量均有所增高.结论红豆杉细胞提取物可以通过诱导SMMC-7721和HEp-2发生凋亡而抑制肿瘤细胞的生长.
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稳定转染ABCG2 shRNA真核沉默载体的人喉癌Hep-2细胞的建立及其SP检测
目的：构建ABCG2 shRNA稳定转染人喉癌Hep-2细胞株探讨ABCG2基因表达与Hep-2细胞中SP（侧群细胞）比例的关系。方法（1）利用脂质体法转染ABCG2 shRNA真核沉默载体，嘌呤霉素筛选阳性转染细胞克隆，制备稳定转染shRNA真核沉默载体的 Hep-2细胞系，用RT-PCR、Western-blot及免疫荧光法检测转染效率及ABCG2沉默效果。（2）Hep-2及Hep-2-shABCG2稳转细胞经Hoechest33342以及维拉帕米和PI染色后，流式细胞仪检测转染后各组细胞中SP比例的变化。结果（1）荧光显微镜检测在sh-ABCG2组和Sh-Con组的Hep-2细胞中可以清楚看到绿色荧光表达，细胞形态清晰可见；未转染组未见绿色荧光；（2）嘌呤霉素的筛选浓度：细胞培养到2周时观察到佳筛选浓度确定为1．0 mg·L-1，维持浓度为0．5 mg ·L-1；（3）RT-PCR结果显示，Hep-2细胞稳定转染shABCG2后，ABCG2表达量显著降低；而转染空载体组与未转染组ABCG2表达无明显差异；（4）Western-blot结果显示，稳转细胞Hep-2- shABCG2未检测到ABCG2蛋白表达；而空载体转染组与未转染组均可见ABCG2表达，且无明显差异（P＜0．01）；（5）FACS检测结果显示，与Sh-con组和未转染组相比较，shABCG2稳定转染组SP细胞比例明显降低（P＜0．01）。结论（1）成功建立ABCG2 shRNA稳定转染人喉癌Hep-2细胞株；（2）ABCG2基因表达与SP细胞比例密切相关。
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阻断氯离子通道对荷 Hep-2细胞瘤裸鼠移植瘤生长、细胞凋亡及 Oct4和 CD133蛋白表达的影响
目的：研究阻断氯离子通道对荷Hep-2细胞瘤裸鼠移植瘤的抑制作用及可能机制。方法：以Hep-2细胞建立裸鼠皮下移植瘤模型，应用不同浓度（0、10、50、100和150μmol/L）的氯离子通道阻断剂（ NPPB）处理4周，每组6只。观察移植瘤体积的变化，采用TUNEL染色检测移植瘤组织细胞凋亡情况，免疫组化法检测移植瘤组织Oct4和CD133蛋白的表达。结果：不同浓度的NPPB组间移植瘤体积、细胞凋亡指数及Oct4和CD133蛋白的阳性表达率差异均有统计学意义（F＝7．361、126．385，P均＜0．05）；与对照组（0μmol/L NPPB组）相比，50、100和150μmol/L NPPB组移植瘤体积减小，细胞凋亡指数升高，Oct4和CD133蛋白的阳性表达率降低（P＜0．05或0．005）。结论：体内阻断氯离子通道可抑制荷Hep-2细胞瘤裸鼠移植瘤的生长，诱导肿瘤细胞凋亡，其机制可能与降低Oct4和CD133蛋白的表达有关。
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雷帕霉素对缺氧条件下 Hep-2细胞增殖及 VEGF、HIF-1α表达的影响
目的：探讨雷帕霉素对缺氧条件下人喉癌Hep-2细胞增殖及VEGF、HIF-1α表达的影响。方法：在缺氧条件下，采用MTT法检测0、5、10、20 nmol／L雷帕霉素处理12、24、36、48、60、72 h后Hep-2细胞的增殖活性，ELISA检测0、5、10、20 nmol／L雷帕霉素处理24 h细胞培养上清液VEGF蛋白含量的变化，Western blot 检测0、5、10、20 nmol／L雷帕霉素处理16 h细胞HIF-1α蛋白表达的变化。结果：缺氧条件下雷帕霉素对Hep-2细胞仍具有明显的增殖抑制作用，且呈浓度和时间依赖性（F浓度＝253．132，F时间＝213．945，P＜0．05）。缺氧条件下雷帕霉素可抑制Hep-2细胞VEGF的分泌及HIF-1α蛋白的表达（F＝7．045、16．218，P＜0．05）。结论：雷帕霉素可抑制缺氧条件下Hep-2细胞的增殖，其机制可能与抑制Hep-2细胞VEGF的分泌及HIF-1α蛋白的表达有关。
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Axl基因在喉癌细胞Hep-2中的表达及意义
目的：研究Axl 基因在喉癌细胞Hep-2中的表达，探讨Axl 基因与喉癌细胞的增值、浸润及转移的关系。方法提取Hep-2和人永生化表皮细胞Hacat细胞RNA，应用RT-PCR检测Axl mRNA的表达；应用免疫细胞化学染色检测Axl蛋白质在细胞Hep-2和Hacat中的表达。结果 AxlmRNA在Hep-2细胞中高表达，平均相对积分吸光密度值为：0．8601±0．0409；Axl mRNA 在 Hacat 细胞中低表达，平均相对积分吸光密度值为：0．2637±0.0503，差异有统计学意义（t＝18．682，P＜0．01）。免疫细胞化学染色表明 Axl在 Hep-2细胞中高表达，平均吸光密度值为：0．2621±0．0238；在 Hacat细胞中低表达，平均吸光密度为：0．0729±0．0201，差异有统计学意义（t ＝25.938，P＜0.01）。结论 Axl与喉癌细胞Hep-2的增值、浸润及转移有密切关系。
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硒化麒麟菜多糖抑制人喉癌细胞株Hep-2增殖的作用
目的 通过比较研究海藻麒麟菜多糖粗提物、无机硒化合物-亚硒酸钠(Na2SeO3)及其共价化合物-硒化麒麟菜多糖对人喉癌细胞株Hep-2的作用,探索新的具有抗肿瘤活性的有机硒化合物.方法 应用不同剂量的样品作用于Hep-2细胞株后,用MTT比色分析法计算肿瘤抑制率.结果 硒化多糖对Hep-2细胞的抑制率高于相同多糖浓度的麒麟菜多糖和相同硒浓度的亚硒酸钠(P＜0.05).硒化多糖的抑制率可高达71.53%,其多糖IC50与硒IC50分别为1805μg/ml和7.0μmol/L,分别低于麒麟菜多糖的多糖IC50(3034μg/ml)和亚硒酸钠的硒IC50(9.0μmol/L).结论 硒化麒麟菜多糖具有抗Hep-2细胞增殖的活性,其抑制作用明显优于亚硒酸钠及天然麒麟菜多糖的抗肿瘤活性.
