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核苷二磷酸激酶A亚基的纯化、鉴定及其对顺铂抗癌作用的增强
目的了解核苷二磷酸激酶A亚基(NDPK-A)能否提高顺铂的抗癌效果.方法利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western印迹杂交来监测和鉴定目标蛋白NDPK-A,利用离子交换、亲和层析结合高效液相色谱纯化分离目标蛋白;MTT比色法测定药物对细胞生长抑制率的影响.结果获得NDPK-A单体蛋白,酶比活为8 mmol*min-1*g-1蛋白质;细胞生长抑制率显示,NDPK-A单独处理细胞时未见明显的细胞毒性,但与顺铂联合处理却能大大加强后者对鼠肺腺癌细胞LA795和人喉癌细胞Hep-2的细胞毒性.结论 NDPK-A与顺铂联用能增强顺铂对体外培养的鼠肺腺癌细胞LA795和人喉癌细胞Hep-2的杀伤作用.
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99Tcm-annexinV在肺癌化疗评估中的应用
目的 制备放射性药物99Tcm-annexinV,评估其在早期预测肺癌化疗效果中的作用.方法 通过毕赤酵母重组表达、硫酸铵沉淀和分子筛层析纯化得到annexinV,采用氯化亚锡还原法在annexinV的氨基端标记放射性核素99Tcm,经脱盐柱纯化获得标记产物.采用薄层层析测定99Tcm-annexinV的标记率和放射性化学纯度,外露磷脂酰丝氨酸的红细胞测定99Tcm-annexinV的生物活性.通过在615小鼠腋部皮下接种LA795细胞和组织插块法获得荷肺癌小鼠模型,经腹腔注射环磷酰胺治疗肺癌后6、12、24和48 h测定99Tcm-annexinV在小鼠体内的分布情况.结果 毕赤酵母工程菌株分泌表达armexinV,经硫酸铵分级沉淀和分子筛层析纯化后annexinV得以有效回收.室温下30 rain完成anne-xinV的99Tcm标记,标记率为50.2%.99Tcm-annexinV放射性化学纯度为93.9%,其生物活性保存良好.生物分布实验表明,99Tcm-annexinV通过肾脏排泄.615荷肺癌小鼠模型经过环磷酰胺化疗后48 h,99Tcm-annexin V在肿瘤组织的摄取达到高,肿瘤/肌肉放射性摄取率之比为6.34,肿瘤/血液放射性摄取率之比为4.09.结论 制备了毕赤酵母来源的孵99Tcm-annexinV,有可能应用于早期预测肺癌化疗效果.
关键词： 99Tcm-annexinV 肺癌 环磷酰胺 LA795 生物分布 -
小鼠肺部TMEM16A基因表达沉默模型的建立
目的 构建小鼠TMEM16A-shRNA慢病毒载体,通过气管内注射慢病毒载体,局部部分沉默小鼠肺部TMEM16A基因的表达,为后续在体研究TMEM16A在肺部作用提供基础.方法 ①构建小鼠TMEM16A-shRNA慢病毒载体;②免疫荧光法验证LA795小鼠肺腺癌细胞膜上TMEM16A的表达,体外行慢病毒感染实验,确定感染的佳条件,后体外实验确定慢病毒的干扰效率;③链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶连接法(streptavidin-perosidase,SP)法验证肺组织中TMEM16A的表达;④气管内注射慢病毒2周后行支气管肺泡灌洗,BAC法检测灌洗液中蛋白及酶联免疫吸附法测定(ELISA)法检测炎症因子肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactor-a,TNF-α)、IL-1β及IL-10的浓度;⑤气管内注射慢病毒2周后取材肺组织提取蛋白用蛋白印迹法(Western blot)验证在体TMEM16A-shRNA慢病毒载体的沉默效率.结果 ①LA795细胞膜上存在TMEM16A的表达,LA795细胞在5 mg/L的Eni.S+ polybrene条件下容易被感染,病毒感染复数(MOI)为20;②Western blot进一步显示体外细胞慢病毒shRNA的沉降效率约81.35％(P＜0.05);③气管内注入Lenti-Neg-shRNA后BALF的蛋白含量无增加,细胞因子TNF-α、IL-1β及IL-10的浓度无明显变化(P＞0.05);光镜下肺组织结构正常,未造成病理损伤;④气管内注入Lenti-TMEM16A-shRNA后,Western-blot结果显示TMEM16A表达水平降低(P＜0.05),达到在肺部部分沉默TMEM16A的目的.结论 本研究成功构建小鼠TMEM16A-shRNA慢病毒载体,体内实验证实慢病毒气管内注射是比较安全,未增加肺组织的蛋白渗漏及病理损伤,并能有效转染气道及肺泡上皮细胞并在局部表达,成功沉默肺部TMEM16A的表达.
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E838对小鼠移植性肿瘤的治疗研究
目的观察E838对小鼠宫颈癌、肺腺癌的治疗效果.方法 IRM-2小鼠皮下接种宫颈癌(U14)、肺腺癌(LA795)瘤细胞,取E838三个剂量5 mg/kg、7.5 mg/kg、10 mg/kg对小鼠U14、LA795进行治疗,观察荷瘤小鼠生长情况和肿瘤生长曲线,测定肿瘤生长抑制率和骨髓有核细胞(BMC)数及脾脏、胸腺重量的变化.结果 E8385 5 mg/kg、7.5 mg/kg、10 mg/kg三个剂量对小鼠U14的抑瘤率分别为36.8%、64.3%、49.7%,对LA795的抑瘤率分别为46%、60%、58%,BMC数均高于对照组,肿瘤生长也较对照组慢.结论 E838对小鼠U14、LA795肿瘤的生长有明显的抑制作用和刺激骨髓细胞增殖功能.
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TNP-470联合CTX对小鼠LA795肺腺癌皮下移植瘤生长的影响
目的 研究血管生成抑制剂TNP-470联合CTX对小鼠L795肺腺癌生长的抑制作用.方法 将40只接种高转移性的LA795肺腺癌细胞T739小鼠随机分成5组:对照组、溶剂对照组、TNP-470组、环磷酰胺(CTX)组和TNP-470+CTX组.接种4 d后开始用药,用药期间,每隔1 d测量皮下移植瘤体积,20 d后处死全部小鼠,剥离皮下移植瘤并称重.采用免疫组化和图像分析系统定量检测皮下移植瘤中微血管密度(MVD)、血管生长因子bFGF及增殖核抗原PCNA的表达,用原位凋亡TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡指数.结果 各用药组肿瘤的生长明显受到抑制,而联合用药组抗瘤作用进一步增强,且具有协同作用.CTX组、TNP-470组和联合用药组与对照组相比都能减少bFGF表达;与CTX组相反,TNP-470组肿瘤组织中抗原PCNA的表达与对照组相比无差异显著性.TNP-470组和联合用药组肿瘤组织中的MVD与对照组相比都明显减小;而各用药组的凋亡指数比对照组都明显增高.结论 TNP-470组、CTX组中LA795肺腺癌生长受到明显抑制,两者联合应用具有协同作用.
