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Colgalt2基因敲除小鼠Kupffer细胞形态及亚型差异
目的：从Colgalt2基因敲除小鼠肝脏内分离Kupffer细胞，并比较其与正常小鼠Kupffer细胞形态分化和亚型分化的差异。方法采用胶原酶灌注法、percoll密度梯度离心法和免疫磁珠分选法分离纯化Kupffer细胞，并将分离的Kupffer细胞进行培养，显微镜下观察其形态的变化和差异。用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）分别刺激Kupffer细胞6小时、12小时和24小时，检测细胞亚型。结果分离获得Kupffer细胞数目为（4.42±0.63）×106/鼠肝，流式细胞仪检测细胞纯度为97.9%。培养后的细胞逐渐延伸为不规则形态，早期Colgalt2基因敲除小鼠Kupffer细胞形态分化相比正常小鼠有延迟，后期两者无显著差异。在未刺激状态下，Colgalt2-/-小鼠M1型Kupffer细胞的比例小于Colgalt2+/+小鼠，Colgalt2-/-小鼠M2a型Kupffer细胞所占比例较高；LPS刺激6小时后，Colgalt2-/-小鼠M2a型所占比例高于Colgalt2+/+小鼠；LPS刺激12小时后，Colgalt2+/+小鼠M2a型和M2c型Kupffer细胞所占比例小于Colgalt2-/-小鼠；LPS刺激24小时后，Colgalt2-/-小鼠M2c型细胞所占比例高于Colgalt2+/+小鼠。结论应用胶原酶灌注法、percoll密度梯度离心法、免疫磁珠分选法可以获得纯度较高的小鼠肝脏Kupffer细胞，为后期的细胞实验奠定基础。Colgalt2基因的敲除会影响小鼠Kupffer细胞的形态分化和亚型分化。
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Kupffer细胞激活与肝移植免疫耐受
目前,关于Kupffer细胞(KC)在肝移植后免疫调节的确切作用尚不清楚.肝移植后KC通过各种途径被激活,激活的KC通过吞噬凋亡的T细胞、高表达FasL促进Th1细胞凋亡,同时分泌大量的Th2/Th3类细胞因子(白介素10、转化生长因子β等),促进Th2细胞的增生分化,诱导免疫耐受.然而,激活的KC也能通过表达MHC抗原,分泌黏附分子、共刺激分子发挥抗原递呈功能,并分泌促进Th1增生分化的细胞因子,启动和促进肝移植后供体肝脏的排斥反应.K在肝移植后是诱导免疫耐受减轻排斥反应,还是促进并加重排斥反应,可能与其所受刺激因素的变化进而形成一个复杂的动态的细胞因子调控网络,终导致Th1/Th2细胞比率变化有关:Th2细胞占优势则诱导免疫耐受,Th1细胞占优势则促进排斥反应.
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Kupffer细胞在肝移植缺血再灌注损伤中的双重作用
Kupffer细胞足定居于肝内的巨细胞,在月十移植缺血再灌注损伤中发挥着重要的作用,门静脉恢复血流后刺激Kupffer细胞激活,释放活性氧族、多种炎性介质和细胞因子,对肝脏造成损伤.另一方面又可上调HO-1的表达,保护肝脏缺血再灌注损伤,因此,Kupffer细胞在肝移植缺血再灌注损伤中发挥着双重效应.
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模拟微重力对小鼠肝kupffer细胞增殖及相关基因表达的影响
目的 探讨旋转式细胞组织培养系统(RCCS)模拟微重力对小鼠肝Kupffer细胞增殖及相关基因表达的影响.方法 应用RCCS建立模拟微重力细胞培养系统.将小鼠肝原代Kupffer细胞随机分为模拟微重力组(SMG)和正常重力组(NG).分别于培养第3、5、7天收获细胞.采用血球计数板进行细胞计数,流式细胞仪检测细胞周期,实时荧光定量PCR测定PCNA、Ki-67、ERK、CDK2以及CyclinB基因表达水平.结果 培养第3天时,SMG组细胞计数明显低于NG组(2.6±0.1比3.1±0.2,P＜0.05),培养第5、7天SMG组明显高于NG组(6.9±0.4比5.9±0.2,P＜0.05;8.4±0.3比6.5±0.3,P＜0.05).流式细胞仪检测结果显示,培养第3天SMG组G0/G1期比例明显高于NG组(78.1±0.2比59.7±1.2,P＜0.05),S期、G2/M期比例明显低于NG组(12.0±0.4比27.6±0.9,P＜0.05;9.9±0.3比12.7 ±0.4,P＜0.05);培养第5天,SMG组G0/G1期比例低于NG组(69.5±1.5比74.8±0.7,P＜0.05),S期、G2/M期比例高于NG组(21.2±1.5比17.3±0.4,P＜0.05;9.3 ±0.4比7.9±0.4,P＜0.05);培养第7天,SMG组G0/G1期比例依然低于NG组(73.9±1.9比81.7±1.3,P＜0.05),S期、GJM期比例亦高于NG组(18.9±1.9比12.1±0.8,P＜0.05;7.3±0.2比6.2±0.6,P＜0.05).实时荧光定量PCR结果显示,与NG组相比,SMG组PCNA、Ki-67、ERK、CDK2以及CyclinB基因表达在培养3天时均下调,第5和7天呈现明显上调趋势.结论 在RCCS模拟失重应激损伤期,小鼠肝Kupffer细胞增殖功能受到抑制,以后Kupffer细胞增殖能力在相关基因的参与调节下得以恢复并被激活强化.
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大鼠肝移植缺血再灌注后Kupffer细胞CD14基因及蛋白的表达
目的研究大鼠肝移植缺血再灌注后Kupffer细胞CD14基因及蛋白的表达,探讨其在再灌注损伤中的作用.方法分离培养大鼠肝移植缺血再灌注后0(对照组)、2、6、12 h(IR组)的Kupffer细胞,用逆转录聚合酶联反应(RT-PCR)检测Kupffer细胞CD14 mRNA的表达,用免疫印迹检测CD14蛋白合成,用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定培养上清TNF-α的分泌量.然后在上述时间点的细胞培养液中加入抗CD14抗体(anti-CD14组),观察CD14抗体对TNF-α分泌的影响.结果再灌注后Kupffer细胞CD14 mRNA、蛋白以及TNF-α随观察时间点呈逐步上升趋势(与对照组相比,P＜0.01).应用抗CD14抗体后,TNF-α表达较IR组明显降低(P＜0.01).结论再灌注后Kupffer细胞CD14基因及蛋白的表达明显升高,TNF-α的合成和分泌也明显增强;抗CD14单抗能明显抑制TNF-α的产生;CD14在介导Kupffer细胞激活和肝移植缺血再灌注损伤中可能起重要作用.
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内毒素血症时肝组织中脂多糖受体CD14的表达及其意义
目的观测内毒素血症时大鼠肝组织中脂多糖受体CD14 mRNA的表达及其在内毒素介导Kupffer细胞(KCs)激活中的作用.方法经大鼠尾静脉注入内毒素(剂量按5 mg/kg计算)建立内毒素血症动物模型,测定血浆中内毒素、脂多糖结合蛋白(LBP)、TNF-a及IL-6含量变化,同时观测不同时相点肝组织中CD14 mRNA的表达及肝组织形态学变化,并与生理盐水组大鼠相比较.结果在内毒素血症组大鼠中,随着血浆LPS浓度升高和时间延长,肝组织中CD14 mRNA的表达明显增强;血浆中LBP、TNF-a和IL-6含量也明显增加,与对照组相比较有显著差异(P<0.01).伴随KCs激活和肝细胞损伤的形态学改变,表现为KCs数量增多、体积增大、噬功能增强,肝细胞出现变性、坏死等变化.结论内毒素血症时,随着肝组织中CD14 表达增强和血浆LBP增加,可介导KCs激活,产生和释放多种细胞因子,诱导或加重肝组织及其它器官的损害.
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Kupffer细胞抑制剂氯化钆的研究现状
氯化钆通过抑制Kupffer细胞,可缓解肝脏疾病的发生发展.这种作用表现在多个方面:氯化钆作用于Kupffer细胞,抑制吞噬和抗原提呈,进而抑制大鼠肝移植的急性排斥反应;缺血再灌注时,保护受伤的肝脏,促进肝细胞的再生;减轻对内毒素的敏感性及内毒素所致的感染作用;有效预防和减轻酒精性肝损伤等.该文对目前氯化钆抑制Kupffer细胞,进而减轻肝脏疾病的机制的研究现状综述如下.
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肝脏微环境对肝脏干细胞调控机制的研究进展
随着对肝脏干细胞的深入研究,肝脏内存在具有向肝/胆系细胞双向分化潜能的成体肝脏干细胞的观点已经被广泛接受.在肝脏严重受损,成熟肝细胞增殖受抑制或增殖不能满足肝脏代偿时由肝脏成体干细胞增殖分化为成熟肝细胞.而由肝实质细胞,肝脏非实质细胞(肝星状细胞,Kupffer细胞,窦状内皮细胞),细胞外基质及神经系统等组成的肝脏微环境对肝脏干细胞增殖分化有重要作用.现对肝脏微环境对肝脏干细胞增殖分化调控作用的研究进展作一综述.
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肝硬化合并自发性细菌性腹膜炎诊断的研究进展
自发性细菌性腹膜炎(spontaneous bacterial peritonitis,SBP)是在无腹腔内邻近器官直接细菌感染(如肠穿孔、肠脓肿)的情况下发生于腹腔的感染,是肝硬化腹水患者常见的并发症之一.肝硬化患者肝内Kupffer细胞和肝窦内皮细胞的破坏导致了补体经典途径和替代途径功能障碍;同时门脉高压可致肠壁血流缓慢、肠壁屏障功能障碍、肠道微生态失衡和细菌发生移位;脾功能亢进导致白细胞、中性粒细胞减少及免疫功能减退等,致使肝硬化患者极易发生腹腔感染.
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T细胞免疫球蛋白及黏蛋白家族-3对干扰素-γ活化的小鼠肝Kupffer细胞分泌炎性细胞因子的调节作用及机制
目的 探讨T细胞免疫球蛋白及黏蛋白家族-3(Tim3)对IFN-γ活化的小鼠Kupffer细胞的调节作用并探讨其相关机制.方法 将真核表达质粒pcDNA3.1-Tim3转染小鼠肝Kupffer细胞,以Real-time PCR和Western blot检测Tim3在小鼠肝Kupffer细胞的表达.通过ELISA检测质粒pcDNA3.1-Tim3、Tim3阻断型抗体对IFN-γ活化的小鼠肝Kupffer细胞因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)产生的影响,Western blot检测JAK2/STATl蛋白表达.结果 Real-time PCR检测结果显示,IFN-γ能够显著提高小鼠肝脏Kupffer细胞中Tim3 mRNA的表达水平(P< 0.05);pcDNA3.1-Tim3组的TNF-α、IL-6和IL-1β分泌较对照组显著下降(P< 0.01);ELISA结果显示,Tim3阻断型抗体组与对照组相比,TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌增加(P< 0.01);Western blot检测显示,与对照组相比,Tim3阻断型抗体预处理的小鼠Kupffer细胞JAK2及STAT1蛋白的表达上调(P< 0.05).结论 Tim3通过调控Jak2/Stat1蛋白表达参与了Kupffer细胞活化的调节.
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Kupffer细胞CD14及Toll样受体4介导大鼠肝移植缺血再灌注损伤的机制
目的研究大鼠肝移植缺血再灌注后Kupffer细胞CD14和Toll样受体4(TLR4)的表达及其参与缺血再灌注损伤的机制.方法建立肝移植缺血再灌注模型,并分为正常对照组、缺血再灌注组、抗CD14抗体组,每组均为10只大鼠.分离培养大鼠肝移植缺血再灌注后的Kupffer细胞.检测Kupffer细胞CD14及TLR4的mRNA、蛋白表达、核转录因子κB(NF-κB)活性以及培养上清TNF-α的分泌量.结果再灌注后Kupffer细胞CD14及TLR4的mRNA和蛋白表达明显高于正常对照组(P<0.01),再灌注后核转录因子κB活性、培养上清TNF-α表达量明显高于对照组(P<0.01).用抗CD14抗体后NF-κB活性,TNF-α表达量明显下降(与再灌注组相比,P<0.05),但仍然高于对照组(P<0.01).结论缺血再灌注后肠道内毒素(脂多糖)能够上调Kupffer细胞CD14及TLR4的表达,激活NF-κB,启动细胞因子的转录和分泌,但除CD14和TLR4以外的其他信号途径参与了缺血再灌注损伤.
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敲除ABRO1不影响小鼠肝巨噬细胞重建
目的 建立一种高效清除并重建肝巨噬细胞的方法,检测敲除ABRO1对肝巨噬细胞重建的影响.方法8周龄CD45.1亚型C57BL/6J小鼠,尾静脉注射氯氟松(clophosome)清除肝巨噬细胞,钴源照射后,移植Abro1+/+或Abro1-/-小鼠(CD45.2)骨髓,8周后分离小鼠肝非实质细胞,流式分析检测肝巨噬细胞的重建效率.结果常规骨髓移植后,肝脏中单核来源巨噬细胞(CD11bhi F4/80lo)重建率高达90％,但Kupffer细胞(CD11bint F4/80hi)的重建率只有约10％;提前注射氯氟松后再进行骨髓移植,肝脏中单核来源巨噬细胞和Kupffer细胞的重建率都>90％.利用氯氟松清除肝巨噬细胞后再进行骨髓移植的方法,检测发现敲除ABRO1并不影响肝巨噬细胞的重建.结论通过采用尾静脉注射氯氟松联合骨髓移植的方法,成功建立了一种安全、高效清除并重建肝内巨噬细胞的方法,敲除ABRO1并不影响肝巨噬细胞的重建.
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当归多糖对大鼠Kupffer细胞免疫功能的激活作用
目的观察当归多糖(ASP)对大鼠Kupffer细胞免疫功能的影响.方法 ASP体外作用于正常Kupffer细胞,以吞噬中性红A540、分泌NO和TNF-α量评价其免疫功能;以LDH漏出量,评价ASP对细胞的直接损害情况.大鼠ig ASP后,检测Kupffer细胞上述指标及胞内酸性磷酸酶(ACP)活性;以sALT和sGST为肝毒性指标.结果 ASP增强Kupffer细胞对中性红吞噬作用、增加ACP活性及NO和TNF-α的产生.ASP在体外不增加肝实质细胞LDH漏出,而体内使sGST升高.结论适当剂量ASP可激活Kupffer细胞免疫功能.大剂量ASP出现的轻度肝功能改变可能与NO和TNF-α等免疫因子过度分泌间接有关.
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Kupffer细胞在肝纤维化形成与转归中的作用
肝纤维化是由于反复肝损伤引起持续性炎症反应、瘢痕组织形成,导致正常组织结构破坏甚至器官衰竭的一类疾病.临床研究和动物实验均证实,肝脏内慢性长期炎症是导致过量瘢痕形成的主要诱因.在肝损伤期,Kupffer细胞快速激活并释放大量可溶性调节因子(包括过氧化物、细胞因子和蛋白酶等),刺激肝星状细胞增殖、迁移和活化.另一方面,有研究显示,Kupffer细胞还参与肝纤维化转归,其功能可能与调节星状细胞的生物学活性及促进细胞外基质的降解有关.因此,深入研究Kupffer细胞的生物学特性以及在细胞因子环境下与星状细胞间的相互作用,对于理解肝纤维形成的病理学过程和肝纤维化转归的生理学机制具有重要的指导意义.
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药物性肝损伤的免疫学机制
目的 从免疫学的角度出发,探讨药物性肝损伤(drug-induced liver injury,DILI)的发病机制.方法 查阅近年相关研究,对文献资料进行分析和总结.结果 DILI的遗传特异性和普遍的不良预后情况使得DILI成为药物研发中的重要的安全性问题之一;同时,DILI也是许多上市药物撤出市场的主要原因.DILI初是由药物或其代谢产物的直接肝毒性作用引起的.肝实质细胞的损伤激活免疫细胞,促使其释放炎症因子或肝毒性介质,并可启动针对药物相关性抗原的免疫应答.结论 肝脏免疫系统独特的成分和反应特性是揭示DILI发生机制的基础,只有从细胞和分子水平上了解这些基础,才能对DILI作出有效的预测和防治.
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脂多糖对肝脏Kupffer细胞增殖和分泌功能及超微结构的影响
目的 探讨脂多糖(LPS)对肝脏Kupffer细胞增殖和分泌功能及超微结构的影响.方法 将小鼠原代Kupffer细胞培养扩增后,随机分为LPS组和正常对照组.2组细胞培养24 h后,LPS组加入LPS,继续培养6 h,甲基噻唑基四唑法(MTT)测定细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期变化,透射电镜观察细胞超微结构;并收集细胞上清液,检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)水平.结果 LPS组吸光度值高于正常对照组,G0/G1期细胞分布低于正常对照组,S+G2/M期细胞分布高于正常对照组(P<0.01).LPS组细胞上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6水平高于正常对照组(P<0.01).LPS组Kupffer细胞内可见大量空泡及自噬体形成,正常对照组个别细胞胞质内仅见少量空泡.结论 LPS能激活肝脏Kupffer细胞的增殖和分泌功能,并可引发肝脏Kupffer细胞自噬和超微结构改变.
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大鼠Kupffer细胞分离方法的优化
目的:对大鼠Kupffer细胞分离方法进行优化.方法:采用D-Hanks液和Ⅳ型胶原酶液两步原位灌注法结合离体消化,差速离心法和Percoll分离液密度梯度离心法分离并选择性贴壁纯化Kupffer细胞.采用328 nm波长自发荧光法、CD68和CD163免疫荧光染色法及吞噬实验鉴定Kupffer细胞.结果:Kupffer细胞获得量为9.8×106个/鼠肝,其中活细胞率占93％以上,证实细胞为Kupffer细胞且吞噬功能正常.结论:该方法花费时间短,相对简便、经济,且细胞数量、功能活性和纯度等均达到实验要求.
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肝脏纤维化的机制、临床诊断与蒙医药研究概述
肝纤维化是一个重要的临床课题,与复杂临床病理过程相关,其特征性改变是肝组织以胶原蛋白为主的细胞外基质合成分泌增加和降解减少,导致其在肝脏过度沉积.HSC的激活是肝纤维化发生过程中的一个重要环节,同时各类细胞因子与其对应受体,及各种炎症细胞均在肝脏纤维化演变过程中充当重要的角色.在肝纤维化的诊断及实验领域,包括传统的肝活检技术,新型分子标志物以及影像学诊断技术均为临床诊断提供了依据.肝纤维化发生机制与诊断技术的提升给肝脏纤维化治疗以及康复开辟了更广泛的途径.
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CD14的生物学特性及其与酒精性肝炎的关系
CD14是一种单核细胞,巨噬细胞,多形核中性粒细胞表面上的糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白,是脂多糖(LPS)在细胞膜上的一种受体[1],属于细胞表面糖蛋白家族成员之一.在机体免疫、防御系统引起的一系列反应中介导细胞识别LPS并引起细胞酪氨酸磷酸化、核因子(NF-κB)转位、触发细胞因子释放和氧自由基产生.在酒精性肝炎的发病过程中,产生的肠源性内毒素(LPS)与血浆中的脂多糖结合蛋白(LBP)两者的复合物,同肝脏Kuppfer细胞细胞膜上的mCD14结合,进入细胞内介导一系列炎症反应,终导致肝炎的发生,因而对于CD14结构、功能及其与酒精性肝炎关系的研究有着重要的临床意义.
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IRAK-MmRNA在急性脑出血大鼠肝Kupffer细胞中的表达及涤痰通瘀方的干预作用
目的 研究急性脑出血大鼠肝Kupffr细胞(KCs)中白细胞介素-1受体相关激酶-M(IRAK-M)的表达变化及涤痰通瘀方对急性脑出血大鼠肝损害的保护作用.方法 将健康SD大鼠随机分为正常组、急性脑出血模型组和涤痰通瘀方组(酒大黄、胆南星、石菖蒲、蒲黄、三七、水蛭),尾状核注射VⅦ型胶原酶法建立大鼠急性脑出血模型,按10 mL/kg灌胃,正常组和模型组给予等量生理盐水灌胃,上、下午各1次,连续4d,第4天末次给药40min后腹主动脉取血,分离血清,-20℃冻存备用.密度梯度离心法提取正常大鼠肝KCs,分别给药体外培养6、12、24h后收集标本,实时荧光定量(PCR)检测各时相点IRAK-4 mRNA表达.结果 脑出血模型组在各时间点IRAK-M mRNA表达水平[(0.749±0.045)、(0.641±0.054)、(0.728±0.056)]较正常组[(1.108±0.066)、(0.865±0.038)、(0.758±0.041)]均明显降低(P＜0.05);中药治疗组的IRAK-M mRNA表达水平[(0.902±0.062)、(0.780±0.033)、(0.896±0.046)]较脑出血模型组明显升高(P＜ 0.05).结论 涤痰通瘀方可以提高KCs内IRAK-M mRNA的表达,对急性脑出血应激性肝损害具有一定的保护作用.
