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慢病毒介导siRNA 沉默EGFR 基因及其对胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响
目的探讨利用慢病毒介导小干扰核糖核酸(siRNA)沉默表皮生长因子受体(EGFR)基因的可行性及其对胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响.方法构建慢病毒表达载体LV-shEGFR,包装慢病毒表达载体及制备慢病毒颗粒EGFR-shRNA.实验分为Panc-1 组(空白组)、绿色荧光蛋白(GFP)-Panc-1 组(对照组)及siEGFR-Panc-1 组(干扰组)共3 组.空白组使用未经处理的对数生长期的胰腺癌细胞株Panc-1 细胞,对照组使用不含siRNA 片段的慢病毒颗粒及干扰组使用制备好的EGFR-shRNA 慢病毒颗粒感染对数生长期的Panc-1 细胞.采用实时聚合酶链反应(real-time PCR)检测EGFR 基因表达量(以与β- 肌动蛋白相对浓度比值表示),采用蛋白质印迹法(Western-blot)检测细胞中EGFR 蛋白表达(以灰度值表示),采用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖情况,采用流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡情况.3 组EGFR 表达、吸光度(A)值、细胞凋亡率、细胞周期比较采用单因素方差分析和t 检验.结果干扰组EGFR 基因相对含量为0.20±0.04,明显低于对照组(1.00±0.15)及空白组(1.13±0.13),差异有统计学意义(LSD-t=7.865,7.668;P<0.05).干扰组EGFR 蛋白表达量为0.185±0.009,与对照组(0.801±0.087)及空白组(0.825±0.092)相比,干扰组EGFR 蛋白表达明显降低(LSD-t =4.216,3.975;P<0.05).干扰组细胞增殖受抑制,生长速度较对照组生长缓慢.干扰组G2/M 期细胞比率为(8.87±0.29)%,与空白组(20.00±1.88)%和对照组(21.48±2.13)%比较明显减少,比较差异有统计学意义(LSD-t=2.015,2.323;P<0.05),干扰组S 期细胞比率为(50.97±3.04)%,与空白组(36.67±6.18)%和对照组(39.91±2.09)%比较明显增加,比较差异有统计学意义(LSD-t=1.987,2.251;P<0.05).干扰组细胞凋亡率为(18.4±2.3)%明显高于对照组(7.4±1.4)%和空白组(7.7±1.2)%,比较差异有统计学意义(LSD-t=2.585,2.667;P<0.05).结论慢病毒介导siRNA 可以沉默EGFR 基因,抑制胰腺癌细胞增殖,阻滞细胞在S 期和促进细胞凋亡.
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干扰长单一序列区83基因对人巨细胞病毒感染后人脑血管平滑肌促血管生成素及血管内皮生长因子表达的影响
目的 长单一序列区(unique long region 83,UL83)基因是人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)感染再激活标志.本研究拟探索UL83对HCMV感染后人脑血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cel s,VSMC)中不稳定斑块破裂相关因子,如促血管生成素(angiopoietin,Ang)以及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的影响.方法 ①采用流式细胞仪确定amidite荧光素(fluorescein amidite,FAM)标记的小干扰核糖核酸(smal interfering ribonucleic acid,siRNA)通过脂质体转入人脑VSMC的转染效率;②将3条化学合成siRNA通过脂质体转染入已感染HCMV AD169株(MOI=10)的人脑VSMC当中,结合空白组、接毒组及接毒无效干扰组筛选抑制UL83基因强siRNA;③分别检测HCMV AD169株(MOI=10)感染人脑VSMC后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h以及72 h Ang-1、Ang-2及VEGF-A信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid,mRNA)及蛋白表达变化;④分别检测空白组、接毒高效干扰组、接毒无效干扰组及接毒组在感染48 h后Ang-1、Ang-2及VEGF-A的mRNA及感染72 h后上述蛋白表达情况.结果 转染6 h后,95.59％人脑VSMC转染了FAM标记siRNA.感染HCMV AD169株(MOI=10)的人脑VSMC在转染siRNA 48 h后,siRNA转染组与接毒组相比,UL83 mRNA相对表达量多下降78.7％;转染siRNA72 h后,UL83编码的pp65蛋白相对表达量多下降81.3％.人脑VSMC感染HCMV AD169株(MOI=10)0 h、6 h、12 h、24 h、48 h以及72 h时后,Ang-1 mRNA及蛋白相对表达量逐渐下降(P<0.01),Ang-2及VEGF-A mRNA及蛋白相对表达量则逐渐增加(P<0.01).而通过转染高效siRNA抑制HCMV AD169株UL83基因,使得Ang-1表达下降,Ang-2和VEGF-A表达增加均被抑制.结论 HCMV AD169株具有同时促进人脑VSMC中Ang-1表达降低,Ang-2及VEGF-A表达增加功能.而通过siRNA抑制HCMV AD169株UL83基因表达能够阻止上述变化.提示HCMV可能通过UL83基因造成靶细胞产生促血管新生微环境.
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mPEG-PCL-g-PEI聚合物纳米粒介导的小干扰RNA递送
本文旨在合成小干扰核糖核酸(siRNA)递送载体聚合物聚乙二醇-聚己内酯-聚乙烯亚胺(mPEG-PCL-g-PEI),并探讨其体外siRNA递送性能.通过开环聚合反应制备二嵌段共聚物聚乙二醉-聚己内酯(mPEG-PCL-OH),将mPEG-PCL-OH的羟基末端依次化学转化为羟基(-COOH)和N-羟基琥珀酰亚胺(-NHS)生成mPEG-PCL-NHS,再将mPEG-PCL-NHS同枝化聚乙烯亚胺(PEI)反应生成三元共聚物mPEG-PCL-g-PEI.应用傅里叶变换红外光谱(FTIR)、核磁共振(NMR)和凝胶渗透色谱(GPC)对聚合物mPEG-PCL-g-PEI进行结构表征;通过复凝聚法制备mPEG-PCL-g-PEI/siRNA纳米粒,并测定其粒径和zeta电位;通过体外细胞MTT测试,比较mPEG-PCL-g-PEI/siRNA纳米粒和PEI/siRNA纳米粒的细胞毒性;通过体外细胞转染实验,考察不同N/P比的mPEG-PCL-g-PEI/siRNA纳米粒对萤火虫荧光素酶基因表达的抑制效率.结果表明,合成的三元聚合物(MPEG5k-PCL1.2k)1.4-g-PEI10k能压缩siRNA形成粒径为50～200 mn的纳米粒,其表面带有正电荷.MTT分析结果显示(mPEG5k-PCL1.2k)1.4-g-PEI10k/siRNA纳米粒的细胞毒性显著小于PEI10K/siRNA纳米粒(P< 0.05).当N/P比在50～150,萤火虫荧光素酶基因的表达显著下调(P<0.01).当N/P比为125时,萤火虫荧光素酶基因表达的抑制效率大.聚合物mPEG-PCL-g-PEI能递送siRNA进入细胞,抑制靶基因表达,且细胞毒性较低,有望成为一种新型的siRNA递送载体.
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端粒重复序列结合因子2小干扰核糖核酸逆转胃癌细胞多药耐药性的研究
阿霉素(Adriamycin,ADR)和依托泊苷是临床常用的肿瘤化学治疗药物,主要作用机制为抑制DNA拓扑异构酶,导致DNA双链断裂(double-strand DNA breaks, DSB) [1].肿瘤细胞发生耐药与多种机制有关,其中对DNA损伤修复的影响是其中重要的一环[2].端粒重复序列结合因子2(telomeric repeat binding factor 2, TRF2)能够通过维持端粒末端的T环结构,防止端粒被DNA损伤修复机制检测为DSB,维持端粒的正常结构和功能[3-4].
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小干扰RNA分子对增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响
目的 使用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术抑制黏着斑激酶(Focal adhesion kinase,FAK)基因的表达,观察增生性瘢痕成纤维细胞在生物学行为上发生的变化.方法 设计特异性探针合成FAK SiRNA片段,脂质体法转染体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞,光学显微镜观察细胞形态;MTT检测细胞活性并绘制细胞生长曲线;流式细胞仪检测细胞周期.结果 转染后的成纤维细胞呈短梭形改变,胞质、突触减少,细胞核内核仁减少.细胞生长曲线表明,转染FAK siRNA的瘢痕成纤维细胞生长明显抑制.转染后瘢痕成纤维细胞阻滞在G1期.S期和G2期细胞比例减少.结论 FAK与瘢痕增生相关密切,因此改变FAK在成纤维细胞中的表达可望调控增生性瘢痕成纤维细胞的生物活性.
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干预Wip1基因对人肝癌细胞系Huh-7的影响
目的 干预人肝癌细胞系Huh-7的野生型p53诱导的磷酸酶1(Wip1)基因的表达,并观察其细胞生物学特性的变化.方法 采用转染法,将促进Wip1基因表达的质粒和抑制Wip1基因表达的小干扰RNA(siRNA)分别转染Huh-7细胞.质粒转染的Huh-7细胞为质粒转染组,未经质粒转染的为未转染组,siRNA转染的为siRNA干扰组,用Negative Control siRNA转染的为NC组.转染后,行Western blot、CCK-8、细胞划痕、Transwell实验,检测各组细胞生物学特性的变化.结果 质粒转染后,Huh-7细胞Wip1蛋白的表达上调,细胞增殖促进,增殖率在107.42％～ 176.36％之间.未转染组在0～24h、～48 h、～72 h时的迁移距离分别小于质粒转染组:[(34.78±4.77) μm vs (61.60±2.02) μm,(33.98±3.48)μm vs (64.75±4.67) μm,(35.49±0.90) μm vs(67.89±4.23)μm,P均＜0.01].未转染组3次Transwell实验的细胞迁移数均少于质粒转染组:[(90.00±3.00)vs (178.67±5.77),(74.33±26.95)vs(209.00±32.91),(79.33±20.74)vs (208.67±73.24),P均＜0.01].siRNA转染后,Huh-7细胞Wipl蛋白的表达下调;细胞抑制率在12.37％ ～40.81％之间;NC组在0～24h、～48 h、～72 h时的迁移距离分别大于siRNA干扰组:[(31.24±4.42) μm vs (16.04±6.21)μ m,(31.33±2.13)μm vs (18.20±5.67)μm,(32.45±3.08) μm vs (18.99±5.32) μm,P均＜0.01];NC组3次Transwell实验的细胞迁移数均多于siRNA干扰组:[(74.00±12.17)vs(33.00±10.44),(77.00±5.00)vs (32.67 ±2.08),(81.33±17.16)vs (29.30±2.51),P均＜0.01].结论 促进Huh-7细胞Wip1基因表达后,其Wip1蛋白的表达上调,细胞增殖、迁移、侵袭能力增强.抑制Huh-7细胞Wip1基因表达后,其Wip1蛋白的表达下调,细胞增殖、迁移、侵袭能力被抑制.
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凋亡蛋白抑制因子livin基因siRNA表达载体的构建与转染
目的:构建3个针对凋亡蛋白抑制因子livin基因mRNA的小干扰RNA(siRNA)表达载体,然后转染HCT-8/V细胞.为研究livin基因沉默对HCT-8/V细胞耐长春新碱特性的影响奠定基础.方法:合成3对靶基因liyin的siRNA寡核苷酸序列通过退火生成转录模板,与线性pGCsi-H1/Neo/GFP质粒连接,转化DH5α钙化菌抽提重组质粒,测序鉴定.用脂质体2000将重组质粒转染HCT-8/V细胞并用G418筛选.结果:转化大肠杆菌涂布平板长出阳性菌落,测序结果与所设计、合成的livin的siRNA转录模板序列一致;在荧光显微镜下观察到HCT-8/V细胞表达绿色荧光蛋白(GEP)证实重组质粒已转染入细胞并用G418剔除了未转染质粒的细胞.结论:成功构建livin基因的siRNA表达载体,转染并筛选出转染了livin siRNA表达载体的HCT-8/V细胞.
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siRNA下调高迁移率族蛋白 A2表达对前列腺癌细胞增殖凋亡的影响
目的：观察小干扰RNA（siRNA）靶向下调高迁移率族蛋白A2（HMGA2）基因表达对人前列腺癌DU145细胞增殖和凋亡能力的影响。方法采用脂质体LipofectamineTM 2000将HMGA2‐siRNA（siRNA组）和阴性对照siRNA（阴性对照组）分别转染至DU145细胞中；空白组无特殊处理。采用RT‐PCR及Western blot 法分别检测 HMGA2 mRNA 和蛋白的表达；细胞增殖‐毒性检测（CCK‐8）法检测DU145细胞的增殖；流式细胞术检测细胞凋亡。结果 siRNA组 HMGA2 mRNA的相对表达量为0.562±0.067，低于阴性对照组的0.858±0.043和空白组的0.876±0.041（P＜0．05）。siRNA组细胞的增殖能力也低于其他两组（P＜0．05）。转染后48 h ，siRNA组DU145细胞的凋亡率为（14.180±0.395）％，高于阴性对照组的（8.267±0.379）％和空白组的（7.513±0.476）％（P＜0．05）。结论 HMGA2基因特异性siRNA可抑制DU145细胞增殖，促进细胞凋亡。
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环氧化酶2特异性siRNA真核表达质粒的构建与鉴定
目的 构建环氧化酶2(COX-2)特异性小干扰RNA(siRNA)真核表达质粒,研究其对人结肠癌细胞COX-2的阻抑作用.方法 设计短发夹结构的COX-2 siRNA对应模版DNA序列,退火处理后克隆至pGPH1-GFP-Neo质粒,构建重组质粒pGPH1-GFP-Neo-COX-2.将重组质粒转染人结肠癌HT-29细胞,采用RT-PCR、Western blot分别从mRNA和蛋A水平检测COX-2表达.结果 酶切及测序证实质粒pGPH1-GFP-Neo-COX-2构建成功.转染重组质粒72h后可以显著抑制HT-29细胞COX-2mRNA和蛋白表达(P<0.05).结论 成功构建的COX-2siRNA真核表达质粒pGPH1-GFP-Neo-COX-2可以抑制人结肠癌HT-29细胞COX-2基因表达.
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沉默GOLPH3基因对胃癌细胞增殖、凋亡的影响及机制探讨
目的 观察特异性沉默高尔基体磷蛋白3(GOLPH3)基因对胃癌细胞增殖、凋亡的影响,并探讨其机制.方法 将人胃癌SGC-7901细胞随机分为3组,A、B组分别转染LV-GOLPH3-RNAi-1、无义链,C组不转染.转染72 h后,采用MTT法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot法检测细胞GOLPH3、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)和mTOR.结果 A组细胞增殖的OD值较B、C组低,细胞凋亡率(2.70%±0.11%)高于B组(0.42%±0.02%)和C组(0.31%±0.02%),细胞GOLPH3、p-mTOR蛋白表达量较B、C组少,P均<0.05;B、C组间各指标比较,P均>0.05.结论 沉默GOLPH3基因能抑制胃癌细胞增殖、促进胃癌细胞凋亡,其机制可能与下调mTOR信号通路中关键因子p-mTOR表达有关.
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沉默结缔组织生长因子表达对肝星状细胞增殖和凋亡的影响
目的 观察靶向沉默结缔组织生长因子(CTGF)表达对肝星状细胞(HSC)-T6增殖、凋亡的影响.方法将HSC-T6细胞随机分为3组,A、B组分别转染CTGF siRNA及无义序列4~6 h,C组不转染;培养24 h,采用RT-PCR法检测CTGF mRNA,MTT法检测细胞增殖速度,Annexin V/PI双染色法测算细胞凋亡率,Western blot法检测细胞中Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白.结果A组CTGF mRNA表达量(0.12±0.03)明显低于B组(0.87±0.07)和C组(0.85±0.09),细胞增殖速度(0.21±0.05)明显慢于B组(0.38±0.04)和C组(0.39±0.05),细胞凋亡率(37.5%±0.6%)高于B组(0.9%±0.3%)和C组(1.1%±0.2%),Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达量(29.2±0.8,26.4±2.7)均低于B组(66.7±1.7,64.7±0.9)和C组(68.4±1.7,66.1±2.2),P均<0.05.结论靶向沉默CTGF基因可抑制HSC-T6细胞增殖,促进其凋亡,并显著减少Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的合成和分泌.
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缺氧缺血再灌注新生鼠磷酸化的环磷酸腺苷反应元件结合蛋白、神经生长因子对神经元的保护作用
目的 探讨神经元的抗凋亡保护机制,评价环磷酸腺苷(cAMP)反应元件结合蛋白(CREB)、神经生长因子(NGF)对神经元损伤后的保护作用.方法 7日龄Spragu-Dawley新生大鼠随机分为假手术组、缺氧缺血性脑损伤(HIBD)未治疗组、小干扰RNA(siRNA)治疗组、siRNA加NGF治疗组.按照改良的Rice法制备HIBD再灌注模型,各治疗组于再灌注后开始予1次siRNA干预治疗(10 mg/kg);siRNA加NGF组予NGF(15μg/kg),1次/d.于治疗的不同时间通过免疫组织化学和Western blot法检测磷酸化的CREB、NGF在仔鼠HIBD再灌注后海马、丘脑神经元的表达变化.通过Thionine染色检测神经元凋亡.结果 HIBD未治疗组3 h仔鼠右侧海马CA1区磷酸化的CREB(p-CREB)表达达高峰,7 d后降至假手术对照水平.3 h NGF表达开始增加,12 h持续达高峰,7 d后仍明显高于假手术组(P＜0.05).siRNA治疗组p-CREB与NGF表达随时间逐渐下降.HIBD再灌注未治疗组24 h右侧海马CA1区已有明显的凋亡,7 d神经元凋亡与假手术组相比无统计意义.siRNA治疗组神经元有大量的丢失;而siRNA加NGF治疗组神经元与假手术组比较无明显丢失.结论 CREB经信号转导调节大鼠NGF的表达,从而促进其神经元损伤后修复,减少神经元死亡.
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重组补体因子B-小干扰RNA抑制大鼠脉络膜新生血管形成的作用及其机制
背景 脉络膜新生血管(CNV)是眼内新生血管的重要表现形式.研究发现补体旁路途径的激活在激光诱导的CNV发展中起关键作用,旁路途径中的补体因子B(CFB)可以作为一个重要的靶点来阻断补体活化的旁路途径. 目的 探讨不同浓度重组CFB-siRNA(CFB-siRNA)抑制激光诱导大鼠CNV的效果及其作用机制.方法 取棕色挪威(BN)大鼠60只120只眼,采用随机数字表法将其分为空白对照组、实验对照组和25、50、75 μg CFB-siRNA组,每组12只鼠24只眼.实验对照组和CFB-siRNA组大鼠用激光光凝法建立CNV模型,不同剂量CFB-siRNA组于激光光凝后第1、3、5天分别经鼠尾静脉注射相应剂量的CFB-siRNA;实验对照组大鼠以同样方法注射生理盐水,空白对照组大鼠不给予任何干预措施.各组大鼠分别于光凝后第3、7、14、21、28天进行荧光素眼底血管造影( FFA),根据荧光素渗漏程度对各光凝斑评分并检测CNV的生长情况；采用免疫组织化学法检测各组大鼠脉络膜内血管内皮生长因子(VEGF)、Ⅷ因子的表达情况.分别于第7、14、21、28天用免疫组织化学法检测脉络膜中CFB、VEGF、转化生长因子p2(TGF-β2)蛋白的表达,用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法观察CFB与VEGFmRNA、TGF-β2mRNA表达的关系. 结果 不同剂量CFB-siRNA组的CNV发生率明显低于实验对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05)；75 μg CFB-siRNA治疗组CNV发生率明显低于25 μg CFB-siRNA组(P＜0 05).免疫组织化学检测结果显示,不同剂量CFB-siRNA组VEGF、Ⅷ因子在大鼠脉络膜中的表达较2个对照组均减弱,且75 μg CFB-siRNA组减弱程度高于25 μg CFB-siRNA组.光凝后14 ～ 21 d,各剂量CFB-siRNA组VEGF蛋白、Ⅷ因子和TGF-β2在脉络膜中的表达均低于空白对照组,各组总体比较差异有统计学意义(P＜0.05).光凝后7～21 d,不同剂量CFB-siRNA组的CFB在脉络膜中的表达明显低于空白对照组,各组总体比较差异均有统计学意义(P＜0.05).RT-PCR检测结果显示,实验对照组CFB表达持续增加,VEGF、TGF-β2呈曲线变化,21 d时为表达高峰；不同剂量CFB-siRNA组中CFB、VEGF、TGF-β2表达显著减少,差异均有统计学意义(P＜0.05). 结论 尾静脉注射CFB-siRNA能够有效抑制激光诱导的大鼠CNV生成,其抑制效果随着注射剂量的增加而增强.补体激活旁路途径在CNV生成中扮演着重要角色,抑制CFB可减少CNV生成中VEGF和TGF-β2的表达.
关键词： 脉络膜新生血管/治疗 基因疗法 补体因子B 小干扰核糖核酸 -
伴肌动蛋白相关锚定蛋白特异性siRNA筛选及效能评价
目的 设计、合成人伴肌动蛋白相关锚定蛋白(Nebulin related anchoring protein,NRAP)的特异性siRNA,转染人成纤维细胞筛选佳干扰序列.方法 设计并合成4条针对NRAP的siRNA,以不同浓度转染人成纤维细胞.通过Western blot、RT-PCR法检测其对NRAP mRNA及蛋白表达的抑制效果.结果 siRNA 50mol/L及Lipofectamine2000 1μl有较高的转染效率.4种siRNA干扰成纤维细胞24小时后,NRAP的mRNA及蛋白表达量均有显著下降,其中siRNA47抑制效果为显著.结论 成功筛选出可有效抑制成纤维细胞NRAP表达的siRNA,为观察阻断NRAP表达后应力诱导OPLL细胞成骨的变化奠定了基础.
关键词： 后纵韧带骨化症 伴肌动蛋白相关锚定蛋白 小干扰核糖核酸 -
抗呼吸道合胞病毒感染的新药物作用靶点的筛选
目的 为了筛选潜在的抗呼吸道合胞病毒药物作用靶标,以呼吸道合胞病毒感染相关的基因为靶标来构建抑制RSV感染的pSUPER RNAi表达载体,通过体外抗病毒实验进行验证,后筛选出有效的靶基因.方法 利用信使RNA (mRNA)差异显示法,获得特定细胞差异表达的mRNA差异显示谱,通过电子克隆获得这些EST片段的电子延伸产物,得到三十余条与RSV感染密切相关的基因.从中选取部分基因序列作为靶点,化学合成2条编码短发夹RNA序列的寡核苷酸链克隆到pSUPER载体上,构建若干靶向呼吸道合胞病毒感染细胞的相关基因的RNAi质粒.通过体外抗病毒实验来筛选有效的作用靶标结果.结果 本研究设计的siRNA序列克隆到了pSUPER上相应位置,序列正确.针对RSV基因构建的重组质粒pshRNA-ZQ06/16/20/26均可减轻RSV所致的细胞病变,降低病毒滴度,重组质粒对细胞生长无明显细胞毒性作用,通过噻唑蓝比色法(MTT)从mRNA水平分析并确定了该RNAi效应对靶基因有特异性抑制作用.结论 重组质粒pshRNA-ZQ06/20/26较pshRNA-ZQ16抗RSV作用要强.
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抑制核转录因子κBp65对鼻咽癌CNE2细胞的生物学影响
目的 探讨核转录因子κBp65(NF-κBp65)沉默对鼻咽癌的生物学作用.方法 构建NF-κBp65特异性小干扰核糖核酸(siRNA)质粒表达载体(pGPU6/RFP/Neo-NF-κBp65)和阴性对照质粒表达载体(pG-PU6/RFP/Neo-NC).采用非脂质体脂类转染剂将重组质粒表达载体转入人鼻咽癌CNE2细胞,建立NF-κBp65沉默的稳定转染CNE2细胞株(NF-κBp65沉默组)和阴性对照细胞株(阴性对照组);蛋白质印迹法(Western blot)分析癌细胞中NF-κBp65基因的表达水平,MTT实验及流式细胞术分析癌细胞的增殖能力和细胞周期变化;复制裸鼠移植瘤模型,分析沉默NF-κBp65对癌细胞成瘤性的影响.结果 成功获得稳定转染CNE2细胞株,NF-κBp65沉默组细胞中NF-κBp65蛋白表达水平降低;NF-κBp65沉默后,CNE2细胞周期阻滞于S期,增殖速度减慢;NF-κBp65沉默组裸鼠移植瘤生长慢,重量轻,与阴性对照组和空白对照组比较,差异有统计学意义(=14.386,<0.05).结论 NF-κBp65沉默能降低鼻咽癌CNE2细胞的恶性生物学行为.
关键词： 鼻咽癌 核转录因子-κBp65 小干扰核糖核酸 -
磁性纳米复合物对人肝癌细胞增殖能力的影响
目的：探讨磁性纳米复合物对人肝细胞癌（肝癌）细胞（HepG2细胞株）增殖能力的影响。方法以聚乙烯亚胺包被的磁性纳米复合物（PEI-SPIO）作为基因载体复合富含亮氨酸重复单位的 G 蛋白耦联受体（LGR）5-小干扰 RNA （siRNA），待细胞融合达60％时转染 HepG2细胞建立PEI 组，等量的单纯 LGR5-siRNA 转染 HepG2建立 SI 组，另设未转染对照（Ctrl）组。采用 MRI T2扫描检测纳米复合物进入细胞的效率，细胞计数试剂盒（CCK）-8实验检测细胞增殖抑制率，逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测细胞 LGR5的信使核糖核酸（mRNA）表达水平，蛋白印迹法检测LGR5、cyclin D1蛋白表达。结果PEI 组 HepG2细胞的 MRI T2信号明显减低。与 Ctrl 组相比，PEI组 HepG2细胞的细胞增殖抑制率明显升高，LGR5 mRNA 的相对表达量和 LGR5、cyclin D1蛋白相对表达量均明显降低（均为 P ＜0.05），而 SI 组细胞的相应指标差异无统计学意义（均为 P ＞0.05）。结论磁性纳米复合物 PEI-SPIO 复合 LGR5-siRNA 可有效转染 HepG2细胞，其机制可能是通过下调cyclin D1表达水平抑制人肝癌 HepG2细胞的增殖能力。
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siRNA对肝癌细胞异常表达FAT10基因的抑制效应研究
目的:探讨小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对原发性肝癌(肝癌)细胞中异常表达的类泛素蛋白FAT10的抑制作用,研究其对肝癌细胞生长的影响.方法:针对FAT10基因设计4条siRNA序列,并转染至人肝癌细胞株Hep3B细胞,通过实时荧光定量PCR检测siRNA对FAT10基因表达的影响,使用四甲基偶氮唑蓝法检测siRNA对Hep3B细胞生长情况的影响,采用流式细胞术分析siRNA对Hep3B细胞周期变化的影响.结果:Hep3B细胞转染siRNA后,FAT10 mRNA表达降低,Hep3B细胞的生长受到了明显的抑制,其生长主要停滞在G0/G1期,而S期和G2/M期细胞所占比例下降.结论:siRNA可抑制Hep3B细胞FAT10基因的表达,并抑制Hep3B细胞的生长.FAT10基因可能是调控肝癌基因表达的新的靶基因.
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注射用小干扰核糖核酸脂质体药效学研究
目的 利用乙型肝炎病毒(HBV)转基因鼠模型,研究注射用小干扰核糖核酸(siRNA)脂质体药物的抗HBV作用.方法 对M-TgHBV转基因小鼠静脉给予不同剂量的注射用siRNA脂质体药物,在给药的不同时间点采血测定乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg),在后一天取部分鼠肝脏进行免疫组化分析.结果 与给药前比较,试验药物2mg/kg组(A组)HBsAg表达水平在第9天和第12天时明显降低(P＜0.05),在第15天时降低非常明显(P＜0.01),试验药物1 mg/kg及0.5 mg/kg组(B,C组)、阳性药物(拉米夫定)组(F组)在第15天时均显著降低(P＜0.05);免疫组化分析结果表明,相对于阴性对照组(G组),肝内HBsAg表达抑制率A组为48.44%,B组为36.73%.结论 注射用siRNA脂质体在转基因鼠中的抗HBV作用明显.
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小干扰RNA沉默HK-2细胞VDR及其对低枸橼酸尿症的意义
目的 筛选有效沉默人肾近曲小管上皮细胞(HK-2 cells,HK-2细胞)维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)基因的小干扰核糖核酸(small interfering ribonucleic acid,siRNA)及其对低枸橼酸尿症的意义.方法 培养HK-2细胞,设计4条VDR-siRNA,利用包装的慢病毒侵染所培养的HK-2细胞,利用蛋白质印迹法(western blot,WB)和实时定量聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)检测沉默VDR基因的HK-2细胞中VDR蛋白质和VDR-mRNA的表达水平.结果 siRNA 1(6120)能显著抑制HK-2细胞中VDR的表达,获得了VDR-siRNA 1(6120)稳定细胞株.结论 VDR-siRNA 1(6120)能有效沉默HK-2细胞中VDR的表达,可以进行下一步沉默VDR表达后检测Na(+)-二羧酸转运子[Na(+)-dicarboxylatecotransporter1,NaDC 1]表达情况.
